Меню Рубрики

Экспериментальная модель бронхиальной астмы

Теория о психологической природе БрА, предложенная в начале XX века, была отвергнута в связи с отсутствием доказательств. Стресс ухудшает течение любого хронического заболевания, в том числе и БрА. Исследователи, занимающиеся изучением БрА, не относят психологические особенности к основным причинам БрА, а оценка этой теории на животных невозможна.

Популярная в середине XX века теория предполагала, что связанные с БрА патологические проявления (прежде всего гиперсекреция слизи и бронхоспазм) вызваны нарушениями в парасимпатической нервной системе. Основные усилия исследователей были направлены на доказательство повышенной холинергичес-кой иннервации ВП [17]. Стимуляция блуждающего нерва у животных может имитировать нарушения, напоминающие БрА. Ингаляция аналогов ацетилхоли-на вызывает у животных и человека развитие бронхоспазма, в связи с чем антагонисты ацетилхолина изучались в качестве средств, способных контролировать БрА. Однако, поскольку у большинства больных БрА холинолитики оказались малоэффективны, интерес к таким исследованим ослабевает. Теория р-адренергической блокады [18] постулировала, что основной дефект при БрА и других атопических заболеваниях заключен в повреждении р-адрено-рецепторов, опосредующих адреналин- и норадреналининдуцированное расслабление гладких мышц ВП. Однако достаточных доказательств этой гипотезы на животных получить не удалось, а широкое использование р-адреноблокаторов, не сопровождающееся увеличением частоты заболеваний, заставляет с осторожностью подходить к широким обобщениям.

Согласно этой гипотезе, БрА вызвана не какими-либо специфическими бактериями, передающимися от больного к больному, а развивается вследствие аллергии на микроорганизмы. По мнению сторонников этой теории, все формы БрА ассоциированы с иммунными реакциями гиперчувствительности. Исходя из отсутствия аллергии на обычные ингаляционные аллергены и из факта частых обострений БрА после респираторных инфекций, было предположено, что больные сенсибилизированы к бактериям, выявляемым в бронхиальном секрете. Практическим выходом этой гипотезы стали попытки десенсибилизировать таких больных инъекциями экстрактов убитых микроорганизмов, наиболее часто высеваемых из ВП при обострениях БрА. Хотя связь обострений БрА с респираторными инфекциями (чаще вирусными) не подвергается сомнению, отсутствие доказательств бактериальной аллергии как у больных БрА, так и в экспериментальных моделях на животных привело к снижению интереса к этой теории и к использованию инъекционной терапии бактериальными вакцинами. Роль вирусной инфекции в обострении БрА у человека весьма значима, однако экспериментальные исследования на животных в этой области находятся на начальном этапе.

Патогенез развития АллР первого типа состоит в активации нагруженных IgE-AT тКл аллергеном, адсорбирующимся со слизистой оболочки носа, что приводит к дегрануляции тКл и высвобождению группы высокоактивных биологически активных медиаторов. Аналогичным образом развиваются события при пищевой анафилаксии (например, на арахис) или IgE-опосредованной лекарственной реакции (например, на инъекцию пенициллина) [19]. В этих случаях пищевой или лекарственный аллерген всасывается через ЖКТ и взаимодействует с сывороточными белками, приводя к образованию IgE-AT и последующей системной активации тКл и развитию АнШ. Высвобождение медиаторов тКл под действием аллергена основная гипотеза, рассматривающая этот процесс как ведущий при развитии БрА. Подтверждают эту гипотезу атопическая форма заболевания, вызванная ингаляционными аллергенами (споры грибов, перхоть животных, тримеллитиновый ангидрид ТМА), исчезновение симптомов после элиминации аллергена, а также фармакологический контроль заболевания так называемыми стабилизаторами мембран тКл, прежде всего кромоглициновой кислотой. Различия между АллР и атопи-ческой БрА проявляются уже в том, что эффективные при АллР Н^антагонисты не оказывают существенного влияния на проявления БрА. В начале 50-х годов факт меньшей роли гистамина при БрА заставил исследователей искать другие медиаторы. Расшифровка структуры медленно действующего вещества анафилаксии [20] привела к открытию Лт, основных агонистов при БрА (среди них оказались JItD4 и ЛтЕ4). Были расшифрованы структура и пути синтеза (циклооксиге-назный и липооксигеназный) продуктов арахидоновой кислоты (ЛтВ4, ЛтЭ4 и ЛтЕ4, а также тромбоксаны и nrD2) [21]. Наряду с ними представляют интерес ФАТ и брадикинин [23]. В клинике применяют как рецепторные антагонисты этих веществ, так и блокаторы ферментов, приводящих к синтезу медиаторов. Основные направления воздействия новых терапевтических средств контроля БрА представлены в табл. 3-1.

Одна из новых теорий БрА основана на предположении, что в гладких мышцах бронхов больных БрА нарушена активность так называемой неадренергичес-кой нехолинергической активирующей системы [24]. ВП (гладкомышечные клетки и железы) человека иннервируются волокнами парасимпатической (медиатор ацетилхолин), симпатической (медиатор норадреналин) нервной системы, а также нейромедиаторами, не относящимися к этим системам. Такая нехолинергичес-кая и неадренергическая иннервация может иметь как подавляющий (медиатор вазоактивный интестинальный пептид VIP или пептиды гистидинметионин, гистидинизолейцин), так и активирующий (нейрокинин А, относящийся к каль-цитониновому гену пептид, вещество Р) эффекты. Эти пептидергические системы открыты относительно недавно, и их роль в патогенезе БрА интенсивно исследуется. Нарушение соотношения активности перечисленных систем рассматривается как одна из причин гиперреактивности бронхов. Эти гипотезы носят комплексный характер, в связи с чем их трудно проверить при исследовании у больных БрА, а эксперименты на животных затруднены в связи с ограниченным количеством моделей БрА. К настоящему времени интерес к гипотезе нейрогенной БрА фактически утрачен.

источник

Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии Литвин Лолиана Стефановна

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Литвин Лолиана Стефановна. Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии : диссертация . кандидата медицинских наук : 14.00.36 / Литвин Лолиана Стефановна; [Место защиты: ГП «ГНЦ «Институт иммунологии»»].- Москва, 2007.- 138 с.: ил.

Глава 1 Обзор литературы 10

Экспериментальные модели бронхиальной астмы (БА) у животных 10

Моделирование бронхиальной астмы у мышей 17

Краткосрочные модели БА 22

Долгосрочные модели БА 24

1.3 Практическое применение моделей БА на мышах 29

Изучение патогенеза БА 29

Использование моделей БА на мышах для доклинических исследований фармакологических препаратов 33

Изучение механизмов аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) и исследование новых форм лечебных аллергенов 35

Глава 2 Материалы и методы 40

Аллергены и основные реагенты, использованные в работе 40

Способы и схемы иммунизации животных 41

Определение аллерген-специфического IgE методом пассивной кожной анафилаксии 47

Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) 47

Оценка системной анафилаксии у мышей с экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмой (ЭБА) и после экспериментальной АСИТ (ЭАСИТ) 48

Гистологическое исследование легких, клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей при моделировании ЭБА 49

Исследование клеточного состава периферической крови 49

Методика забора и оценки клеточного состава БАЛ у мышей 49

Гистологическое исследование легких 50

2.8 Методика оценки дыхательной функции мышей на введение
неспецифического и специфического раздражителей 51

Установка для регистрации пневмограмм у мышей 51

Регистрация пневмограмм 55

2.9 Методы статистической обработки 56

Глава 3 Результаты собственных исследований 58

Оценка различных схем иммунизации ОА при моделировании аллергического воспаления в дыхательных путях мышей 58

Сравнение иммунологических и морфологических показателей при моделировании аллергического ответа в дыхательных путях мышей линии BALB/c и гибридов (СВА х C57BL/6)F1 60

Характеристика разработанной модели ЭБА у мышей 61

Динамика образования аллерген-специфических IgE антител 61

Оценка уровней суммарных аллерген-специфических IgG антител 63

Оценка реакции системной анафилаксии у мышей 64

Оценка клеточного состава периферической крови 66

Оценка клеточного состава БАЛ 68

Гистологическое исследование легких 73

Оценка неспецифической и специфической реактивности бронхов 82

3.4 Оценка ЭАСИТ модельным аллергеном овальбумином (ОА), химически
модифицированным сукцинилированием (сОА) и сОА в комплексе с
иммуномодулятором полиоксидонием (ПО) 90

Сравнительная оценка уровней аллерген-специфических IgE- и IgG-антител до, в течение и после ЭАСИТ 90

Сравнительная оценка клеточного состава периферической крови и БАЛ у мышей после ЭАСИТ 95

Сравнительная оценка морфологической картины легких у мышей после ЭАСИТ 100

Анализ пневмограмм мышей различных групп после ЭАСИТ 106

Сравнительная оценка выраженности системной анафилаксии у мышей после ЭАСИТ . ПО

Глава 4 Обсуждение полученных результатов 112

Перечень условных сокращений:

АСИТ — аллерген-специфическая иммунотерапия

БАЛ — бронхо-альвеолярный лаваж

БСА — бычий сывороточный альбумин

ГР — гиперреактивность бронхов

ГІДА — гомоцитотропные антитела

ИФА — иммуноферментный анализ

ПКА — пассивная кожная анафилаксия

сОА — сукцинилированный овальбумин

ТФР-р — трансформирующий фактор роста (3

ФСБ — фосфатно-солевой буфер

ЭАСИТ — экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия

ЭБА — экспериментальная IgE-зависимая бронхиальная астма

Бронхиальная астма (БА) является наиболее распространенным во всем мире хроническим заболеванием, представляющим значительную социальную проблему, как для детей, так и для взрослых. Очевидно, что за последние 20 лет распространенность этого заболевания заметно возросла, особенно среди детей [49]. По данным эпидемиологического исследования, проведенного в России, общее число больных БА приближается к 7 млн. человек [7]. В номенклатуре, представленной Европейской Академией Аллергологии и Клинической иммунологии, выделяют аллергическую (IgE-зависимая и не IgE-зависимая) и не аллергическую Б А [71]. В большинстве случаев, особенно у детей и молодых людей, развитие БА связано с IgE-опосредованными (атопическнми) механизмами [30]. Участие атопических механизмов доказано у 40% больных БА [114]. Представление о БА как о хроническом воспалительном заболевании дыхательных путей стало важным достижением и определило направление поиска терапевтических подходов для профилактики и контроля воспалительного процесса при БА. Несмотря на широкое применение различных противоастматических и противоаллергических фармакологических препаратов, отмечается повсеместный рост числа больных страдающих этим заболеванием, а также отмечается устойчивая тенденция к увеличению числа больных с тяжелыми формами БА [7].

На современном этапе медицинской науки значительная часть знаний о механизмах лежащих в основе того или иного заболевания получены с использованием экспериментальных моделей, адекватных различным заболеваниям человека. Исследования in vivo, также являются начальным и основополагающим этапом в изучении безопасности и эффективности новых лечебных препаратов. К настоящему времени, по данным зарубежной литературы, уже описаны протоколы индукции моделей бронхиальной астмы у животных, в частности у линейных мышей [17,42]. Большинство протоколов индукции IgE-зависимой бронхиальной астмы предполагает использование

адъювантов. Преимущественное использование мышей для моделирования бронхиальной астмы связано с большим разнообразием реагентов для изучения генетических и иммунных механизмов развития заболевания. Мыши могут быть сенсибилизированы к различным видам аллергенов и развивать аллерген-индуцированное воспаление в дыхательных путях, а также бронхиальную гиперреактивность. Существуют определенные сходства между параметрами моделей аллергической бронхиальной астмы мышей и характеристиками бронхиальной астмы человека, заключающиеся в морфологических изменениях дыхательных путей и ткани легких, в характере антительного ответа, а также участвующих в развитии и поддержании аллергического воспаления эффекторных клеток и молекул [25]. Анализ отечественной научно-практической литературы привел к заключению об отсутствии данных о разработке и использовании для доклинических исследований адекватной модели аллергической (IgE-зависимой) бронхиальной астмы у мышей. Поэтому, разработка экспериментальной модели бронхиальной астмы является актуальной и перспективной в нашей стране.

Разработка модели БА на мышах позволит в дальнейшем изучать механизмы, приводящие к развитию заболевания, оценивать безопасность и эффективность новых лечебных препаратов перспективных для лечения и профилактики БА.

Единственным к настоящему времени методом терапии аллергических
заболеваний атопической природы, воздействующего на все патогенетически
значимые звенья аллергического процесса и обладающего длительным
противоаллергическим эффектом, является аллерген-специфическая

иммунотерапия (АСИТ) [92]. В настоящее время разрабатываются и внедряются не только новые способы ее проведения, но и новые формы лечебных аллергенов. Такие аллергены должны обладать сниженной аллергенной и сохраненной иммуногенной активностью [4]. Это может быть достигнуто модификацией аллергенов, в том числе химической, а также использованием разнообразных природных и синтетических носителей — адъювантов [2,10,64].

Очевидно, что для доклинического изучения свойств гипоаллергенных вакцин и их терапевтической эффективности целесообразно использовать модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей. Проведение доклинических исследований новых форм аллергенов на модели ЭБА с использованием принципа АСИТ может всесторонне охарактеризовать влияние аллерговакцины на манифестацию и течение IgE-зависимой БА.

Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей и оценить возможность ее применения для доклинических исследований новых подходов к АСИТ.

Разработать схему моделирования IgE-зависимой БА у мышей путем введения модельного аллергена овальбумина (ОА) без использования адъюванта;

Изучить динамику накопления аллерген-специфических IgE- и IgG-антител в ходе моделирования ЭБА;

Провести оценку клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей с ЭБА;

Провести гистологическое исследование легких у мышей с ЭБА;

Оценить бронхиальную реактивность у мышей с ЭБА;

Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей с ЭБА;

Провести сравнительную ЭАСИТ ^модифицированным, модифицированным (сукцинилированием) аллергеном и комплексом модифицированного аллергена с полиоксидонием на модели ЭБА;

Изучить динамику накопления аллерген-специфических IgE- и IgG-антител в ходе и позавершении ЭАСИТ;

Провести оценку клеточного состава БАЛ и периферической крови у мышей после ЭАСИТ;

10. Провести гистологическое исследование легких у мышей после ЭАСИТ;

11.Оценить бронхиальную реактивность у мышей после ЭАСИТ;

12.Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у

мышей после ЭАСИТ. Научная новизна работы:

Впервые в России разработана и охарактеризована краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей без использования адъюванта.

Впервые в России проведено исследование дыхательной функции мышей в ответ на введение неспецифического раздражителя метахолина.

Впервые на модели IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей проведена экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия химически модифицированным аллергеном.

Показано преимущество ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и иммуномодулятора полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном. Практическая значимость:

Разработанная краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей позволит оценивать безопасность и эффективность новых форм лечебных аллергенов и фармакологических препаратов, перспективных для профилактики и лечения IgE-зависимых заболеваний, в частности атопической бронхиальной астмы.

Читайте также:  Моноклональные антитела для лечения бронхиальной астмы

Экспериментальная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы также может быть использована для изучения патогенетических механизмов лежащих в основе развития этого заболевания.

источник

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему: Разработка краткосрочной безадъювантной модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергена пыльцы тимофеевки

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка краткосрочной безадъювантной модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергена пыльцы тимофеевки

Крючков Николай Александрович

Разработка краткосрочной безадъювантной модели

экспериментальной ^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергена пыльцы тимофеевки

14 00 36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

кандидат медицинских наук М.Р. Хаитов

доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин доктор медицинских наук, профессор Т.И. Гришина

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «¿^»Селмм^ц. 2008 г в часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208 017 01 в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» по адресу. 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2. Тел/Факс: (495) 61710-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Автореферат разослан « >> аЛг^смшХ. 2008 г

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. К настоящему времени накоплен немалый объем знаний о причинах возникновения и закономерностях развития бронхиальной астмы (БА) — одного из наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний человека. Вплоть до начала 80-х годов XX века основным способом изучения этой нозочогии были исследования с участием людей [GINA, 2006, Faul JL, 1997; Roche W.R., 1998] Благодаря им, в частности, удалось выявить патогенетическое значение хронического аллергического воспаления в ткани легких и связь большей части случаев БА с гиперпродукцией IgE-антител Однако, неустранимые этические и технические ограничения, свойственные такого рода исследованиям, не позволяли ответить на многие вопросы Это обстоятельство, а также трудности в создании новых классов противоастматических лекарственных средств, стимулировали поиск подходов к воспроизведению признаков заболевания у животных Оказалось, что введение аллергенов по определенным схемам приводит к развитию так называемой экспериментальной бронхиальной астмы (ЭБА) у крыс, морских свинок, овец, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов [Torres R, 2005] Важно подчеркнуть, что у каждого из перечисленных млекопитающих удается воспроизвести свой спектр признаков астмы, обязательными из которых являются спонтанная или индуцированная бронхиальная гиперреактивность, высокий уровень IgE-антител в крови, типичные морфологические изменения в ткани легких и изменения клеточного состава бронхоальвеолярного ла-важа Бурное развитие этого научного направления началось в середине 1990-х годов с момента первого описания модели БА на лабораторных мышах [Kung Т Т., 1994] Мышиная ЭБА отличается высоким уровнем сопоставимости с патологическими признаками заболевания человека, а сами животные хорошо доступны для изучения в связи с наличием разработанных подходов селекции, генной инженерии, молекулярной биологии, лаборатор-но-инструментальной диагностики, Помимо прочего важным оказалось и удобство работы с мышами, обусловленное относительно низкими затратами

на их содержание и питание и коротким репродуктивным циклом [Sugita М, 2003, Torres R., 2005].

Бы то показано, что разные линии мышей различаются способностью реагировать на аллергены и развивать воспаление в тканях Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что одной из наиболее реактивных является чистая линия BALB/c, в то время как, например, С57ВЬ/6-мыши сенсибилизируются и провоцируются значительно хуже [Литвин Л С , 2006]

Для получения ЭБА наиболее часто используется овальбумин (OA) -аллерген с хорошо известными структурой и свойствами. К настоящему моменту разработано несколько схем моделирования. Наиболее часто на первом этапе проводится 2-3-кратное интраперитонеальное введение аллергена через 2-4 дня в дозе по 10 мкг/мышь в комбинации с гидроксидом алюминия Последний используется в качестве адъюванта для усиления Тх2-ответа и аллергического воспаления в дыхательных путях Однако, как выяснилось, введение OA в комбинации с алюмом вызывает появление обширных лимфоци-тарно-эозинофильных инфильтратов вокруг крупных бронхов, а инъекции монопрепарата аллергена индуцируют образование воспалительных очагов преимущественно около мелких бронхов [Epstein М М., 2006] Кроме того, не предполагается влияния адекватного по мощности адъюванта в процессе «естественной» сенсибилизации человека Поэтому все больший интерес привлекают безадьювантные модели, точнее имитирующие патогенез бронхиальной астмы и, в дополнение, позволяющие изучать влияние различных им-муномодулирующих агентов на маркеры заболевания [Крючков Н.А, 2008, Литвин Л С, 2007]. Тем не менее, воспроизведение ЭБА без применения адъювантов сопряжено со значительными трудностями и необходимостью подбора доз и кратности введения аллергена, достаточных для развития аллергического ответа, но не приводящих к развитию иммунологической толерантности В нашей стране выполнена серия работ, показавших действенность 7-кратных ежедневных или повторяющихся через день внутрибрю-шинных инъекций 10 мкг/мышь овальбумина [Литвин Л.С , 2007]. Через 2-3

недели после окончания интраперитонеальных или подкожных введений проводится провокация интраназальным введением OA Повторный контакт с антигеном в условиях предрасположенности к Тх2-ответу вызывает развитие иммунного воспаления, IgE-переключение, эозинофильную инфильтрацию стенок бронхиального дерева и после многократной экспозиции приводит к бронхиальной гиперреактивности

В последние годы для модечирования БА стали использоваться причинно-значимые аллергены, в первую очередь, пыльцевые и пылевые [Крючков H А, 2008, Kryuchkov N А, 2007, Kumar R.K, 2002; Torres R, 2005], вызывающие аллергическую патологию у человека в естественных условиях Данный подход особенно актуален в связи с необходимостью разработки новых технологий и схем антиген-специфической терапии (АСИТ) и предварительного изучения ее эффективности и безопасности на доклинических этапах Принципы воспроизведения ЭБА с использованием причинно-значимых алчергенов и овальбумина аналогичны Как правило, вначале проводится системная сенсибилизация, а после ее окончания — провокация путем доставки аллергена в воздухоносные пути В качестве аллергена могут выступать экстракты пыльцы ветроопыляемых растений и домашней пыли, а также экстрагированные или рекомбинантные сенсибилизирующие компоненты Эффективные дозы препаратов и схемы их введения различаются, однако предпочтительнее использовать малые количества аллергенов в отсутствие адъю-вантов Уже получены мышиные модели с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли [Ahn J H, 2007, McKinley L, 2004], маслины [Conejero L., 2007], пыльцы амброзии [Wild J S , 2000] и березы [Daniel С , 2006] Однако перечень причинно-значимых сенсибилизирующих агентов, изученных на предмет способносш вызывать ЭБА-подобные изменения, пока чрезвычайно ограничен

Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную безадъ-ювантную модель бронхиальной астмы на лабораторных мышах линии

ВАЬВ/с с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой

1 Разработать оптимальную схему моделирования экспериментальной бронхиальной астмы у мышей путем введения экстракта пыльцы тимофеевки в отсутствие адъюванта

2. Изучить динамику накопления аллерген-специфических гомоцитотроп-ных 1§Е-антител в крови мышей в ходе моделирования бронхиальной астмы

3. Провести оценку гистологических изменений легких мышей при моделировании БА

4 Разработать и провести первичную проверку применимости полуколичественной системы анализа гистологических изменений легких мышей с экспериментальной бронхиальной астмой

5 Оценить изменения относительного клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

6 Оценить изменения лейкоцитарной формулы периферической крови у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой

7 Провести пневмотахографическую оценку функции внешнего дыхания у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой

Научная новизна. Впервые в мире разработана и охарактеризована краткосрочная модель ¡^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой у мышей без использования адъюванта Полученная модель ЭБА характеризуется развитием ранней и поздней фазы аллергического ответа в дыхательных путях, повышением аллерген-специфических 1§Е-антител в периферической крови, выраженной гиперреактивностью бронхов на воздействие неспецифического бронхо-констриктора метахолина. Данные признаки адекватны патологическим из-

менениям, характерным для острого воспаления при атопической бронхиальной астме человека

Впервые предложен метод полуколичественного анализа гистологических изменений легких мышей при моделировании бронхиальной астмы

Практическая значимость. Разработанная модель БА на лабораторных мышах может использоваться для оценки эффективности и безопасности потенциальных лекарственных средств или их форм в процессе лечения и профилактики заболевания на доклиническом этапе, Особое значение имеет возможность применения данной модели для нахождения новых подходов к антиген-специфической терапии модифицированными аллергенами пыльцы тимофеевки

Предложенная модель может применяться и при изучении патогенетических механизмов развития бронхиальной астмы

Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе на додипломном этапе высшего медицинского образования и в учебных программах повышения квалификации специалистов по аллергологии и иммунологии

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на VIII Российском конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (27-29 июня 2007 г., Москва, Россия), И Международном конгрессе «Иммунитет и болезни» (10-14 сентября 2007 г , Москва, Россия) XXVII конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (7-11 июня 2008 г, Барселона, Испания). Основные результаты диссертационной работы отражены в 6 публикациях

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 125 страницах машинописного текста Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов Диссертация иллюстрирована 11 таблицами, 26 рисунками,

включая фотографии. Список использованной литературы включает 153 источника из них 16 отечественных и 137 зарубежных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Собственные экспериментальные данные были получены с использованием самок мышей линии ВАЬВ/с весом 18-20 г, полученных из питомника ГУНЦБМТ РАМН Постановку реакции пассивной кожной анафилаксии проводили на беспородных белых крысах-самцах весом 200-280 г, полученных из питомника РОНЦ РАМН. Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом МЗиСР РФ №267 от 19 06 2003 г «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» и «Положением об этическом отношении к лабораторным животным ГНЦ Института иммунологии ФМБА России» В настоящей работе использовался лиофилизиро-ванный экстракт пыльцы тимофеевки полевой (получен и паспортизирован в лаборатории моделирования иммунологических процессов, зав — к м н А И Мартынов, контрольное определение массовой доли азота выполнено в табо-ратории микроанализа НИИ Элементорганических соединений им. А Н. Несмеянова РАН, зав — к х.н А Г Буяновская)

1.1. Схема краткосрочной модели ЭБА. Животных опытной группы (21 мышь) иммунизировали внутрибрюшинно 20 мкг/мышь экстракта пыльцы тимофеевки (из расчета по содержанию белка) в 0,5 мл физиологического раствора по схеме 7 раз через день. Через три недели после окончания интра-перитонеальных инъекций проводили 8-кратное ежедневное интраназальное введение аллергенного экстракта (вб) в дозе 500 мкг/мышь (в объеме 50 мкл) Контрольная группа (21 мышь) получала ложные иммунизацию и провокацию внутрибрюшинные и интраназальные введения физиологического раствора по вышеизложенной схеме Забор крови из ретроорбитального синуса проводили на 27 и 43 дни эксперимента Уровень анти-Об-^Е-антител в пуловых сыворотках определяли методом пассивной кожной анафилаксии. На 42-е сутки пневмотахографически определялись амплитуда и период ды-

хания (у 7 животных контрольной и опытной группы) На 43-й день эксперимента проводили забор БАЛ (у 7 мышей каждой группы) и легких (также у 14 животных) Схема эксперимента представлена на рис 1

# — забор БАЛ и легких для гистологического исследования

Рисунок 1, Схема краткосрочной модели экспериментальной бронхиальной астмы на аллерген пыльцы тимофеевки

1.2. Определение awra-G6 IgE-антител. Постановку реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) проводили, руководствуясь описанной ранее методикой [Ovary Z, 1977] Результаты представляли в форме двоичного логарифма величины, обратной титру гомоцитотропных Об-специфических IgE-антител в пуловых мышиных сыворотках.

1.3. Оценка клеточного состава периферической крови. Проводили забор периферической крови из ретроорбитального синуса Каплю полученной крови наносили на предметное стекло и получали мазок по методике, описанной в руководстве [Кисели Д., 1962] После высушивания проводили фиксацию материала в метиловом спирте в течение 10-15 минут. Затем мазки окрашивали азуром и эозином по Романовскому. В полученном препарате

под увеличением светового микроскопа 10×100 подсчитывали относительное содержание лейкоцитов (лейкоцитарную формулу) на 200-300 клеток, ней-трофилов, моноцитов, лимфоцитов и эозинофилов по известным морфологическим критериям [Никитин В М, 1949].

1.4. Получение и оценка клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Под эфирным наркозом животных умерщвляли, после чего препаровальными иглами закрепляли на предметном столике брюшной поверхностью вверх Кожные покровы передней части тела мышей обрабатывали 70% этиловьм спиртом Выполняли последовательные разрезы кожи, подкожной клетчатки, поверхностных фасций от нижнегрудинной области до верхнего отдела шеи, отсепаровывали мышцы, выделяли трахею В переднюю поверхность средней трети трахеи вводили затупленную инъекционную иглу Затем через нее шприцем вводили 0,5 мл предварительно подготовленной теплой среды (RPMI 1640, 10% эмбриональная телячья сыворотка, 0,2% этилендиаминтетраацетат натрия)-Шприцем отсасывали введенную в легкие жидкость, перенося ее в отдельные стерильные пробирки объемом 1,5 мл типа Eppendorf Процедуру введения и забора среды из легких повторяли дважды, получая, таким образом, 1 мл клеточной взвеси от каждой мыши

Полученный БАЛ центрифугировали при 150g в течение 15 минут Сливали надосадочную жидкость, клеточный осадок ресуспендировали и наносили на предметное стекло Готовили и окрашивали мазок по методике, использованной при получении цитологических препаратов периферической крови С помощью иммерсионной световой микроскопии (увеличение 10×100) подсчитывали процентное содержание моноцитов, лимфоцитов, ней-трофилов, эозинофилов и эпителиоцитов бронхоальвеолярного тракта на 300400 клеток мазка.

1.5. Приготовление и гистологическое исследование микропрепаратов легких. Некропсия мышей методом шейной дислокации осуществлялась под эфирным наркозом Передняя поверхность грудной клетки обрабатывалась 70% этиловым спиртом Производились последовательные разрезы

кожи, поверхностных фасций, мышц. По правой парастернальной линии хирургическими ножницами разъединялись грудино-ключичные сочленения Затем поэтапно выделялись правое и левое легкие Полученные органы помещались в 10 мл флаконы с 10% раствором формалина. После длительной фиксации в формалине ручным способом проводили обезвоживание, проводку и заливку образцов в парафин Микротомированием парафиновых блоков получали срезы легких толщиной 5-6 мкм Полученные препараты окрашивались гематоксилин-эозином и фиксировались в пихтовом масле Гистологическое исследование микропрепаратов легких мышей осуществляли на световом микроскопе при увеличении 10×15 раз Помимо качественной проводили полуколичественную оценку воспалительных изменений и ремодели-рования бронхов (по методике [Ептз Б Р., 2005], с изменениями) При этом выраженность того или иного признака оценивалась в баллах (порядковой шкале) Приготовление микропрепаратов легких лабораторных мышей и их оценка проводилась в лаборатории моделирования иммунологических процессов ГНЦ Института иммунологии ФМБА России (зав — к м.н А И. Мартынов) Фотосъемка срезов легких выполнялась в лаборатории стандартизации групп крови Гематологического научного центра РАМН (зав — проф. С И. Донсков, ст науч сотрудник — к б н И.В Дубинкин)

Читайте также:  Бенджамин фикус при астме

1.6. Оценка бронхиальной гиперреактивности. Параметры ФВД регистрировались с помощью пневмотахографической установки, предоставленной нам Отделом токсикологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (г. Москва). Принцип регистрации базировался на записи кривой дыхательных движений передней брюшной стенки мыши Животных помещали в пенал и фиксировали с помощью подвижной задней стенки для ограничения локомоторной активности После периода адаптации (30 с — 1 мин) производили серию записей пневмотахограмм при постоянной скорости движения бумаги 10 мм/с и коэффициенте усиления напряжения входного сигнала полиграфа (10 мВ/см) Регистрацию параметров функции внешнего дыхания проводили до и после введения неспецифическо-

го бронхоконстриктора метахолина в хвостовую вену мыши (через 1, 3 и 5 мин) На пневмотахограммах первично оценивались амплитуда и период дыхательных актов в эпохах записи не менее 30 с. При этом, анализу подвергался временной интервал, в течение которого амплитуда сигнала варьировала минимально (до 10%) Измеряли и рассчитывали следующие итоговые для каждого животного показатели среднюю амплитуду дыхания по многократным измерениям амплитуд волн на пневмотахограме (мм и мВ) за эпоху анализа, среднюю продолжительность дыхательных актов по многократному измерению расстояний между вершинами двух ближайших волн на пневмо-тахограмме (мм и мс), отношение средней амплитуды дыхания через 1, 3 и 5 мин после введения метахолина к средней амплитуде дыхания до введения бронхоконстриктора, принимаемого за 100% (%), отношение средней продолжительности дыхательных актов через 1, 3 и 5 мин после введения метахолина к исходному значению этого параметра до введения метахолина, принимаемого за 100% (%),

1.7. Алгоритм статистического анализа. Проводился описательный анализ количественных и порядковых данных с расчетом значений среднего арифметического (М), стандартного отклонения (SD), 95% доверительного интервала (ДИ) для среднего, медианы (Med) и интерквартильного размаха (IQR) для всех экспериментальных групп Сравнение достоверности различий количественных и порядковых признаков между группами проводилось по следующему алгоритму После проверки допущений для применения параметрического многофакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями (GLM), проводился расчет статистической значимости модели по критерию След Пилая В случае обнаружения достоверных различий при уровне альфа ошибки 0,05 проводилось межгрупповое сравнение значений признаков с использованием t-критерия Стьюдента или статистики Манна-Уитни (в зависимости от характера выборочных распределений, равенства дисперсий и других допущений) С учетом поисковой специфики исследования, поправки на множественные сравнения не проводилось Для оценки зна-

чимости различий экспериментальных групп по значениям полуколичественных шкал патоморфологических изменений легких дополнительно применялся критерий Хи-квадрат, А результаты, полученные в ПКА, также обрабатывались с учетом специального эмпирического критерия, предложенного Fox DA [Fox DA, 1976] Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программного пакета SPSS 13.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Через 14 дней после завершения фазы сенсибилизации титры анти-Ge антител в реакции ПКА не определялись и были ниже пороговых 1 4 Однако после проведения провокационных введений G6 было зафиксировано выраженное повышение концентрации специфических IgE в пуловой сыворотке крови мышей опытной группы (до величины 1 128), подтвержденное параллельной постановкой реакции ПКА на 4 крысах (соответствующие уровни антител. 7, 7, 7, 6). Для сравнения, в контрольной группе ни на 27-й, ни на 43-й день aHTH-G6-IgE не обнаруживались Многомерный двухфакторный анализ (GLM) показал достоверность модели (р Крючков, Николай Александрович :: 2008 :: Москва

1.1. Бронхиальная астма человека.

1.1.1. Влияние на общественное здоровье.

1.1.2. Клетки и медиаторы воспаления.

1.1.4. Гистологические изменения и ремоделирование дыхательных путей.

1.1.5. Генетические факторы предрасположенности.

1.1.6. Аллергены и другие внешние факторы.

1.2. Моделирование бронхиальной астмы.

1.1.6. Использование животных для моделирования бронхиальной астмы.

1.2.3. Овальбуминовые модели на лабораторных мышах.

1.2.4. Модели на лабораторных мышах с использованием причинно-значимых аллергенов.

1.2.5. Лабораторно-инструментальные методы при моделировании бронхиальной астмы.

1.3. Преимущества и недостатки мышиных моделей бронхиальной астмы.

Глава 2. Материалы и методы.

2.2. Аллергены, реагенты и расходные материалы.

2.3. Схема иммунизации лабораторных мышей для определения аллергенности экстракта пыльцы тимофеевки.

2.4. Схема пилотного эксперимента для определения оптимальной сенсибилизирующей дозы аллергена пыльцы тимофеевки.

2.5. Схема эксперимента для проверки эффективности сниженной интраназаль-ной дозы экстракта пыльцы тимофеевки.

2.6. Схема эксперимента для подтверждения сенсибилизирующей активности экстракта пыльцы тимофеевки в дозе 20 мкг/мышь (краткосрочная модель экспериментальной бронхиальной астмы).

2.7. Определение антиген-специфических ^Е-антител методом пассивной кожной анафилаксии.

2.8. Оценка клеточного состава периферической крови.

2.9. Методика получения бронхоальвеолярного лаважа у лабораторных мышей и оценка его клеточного состава.

2.10. Приготовление микропрепаратов легких и их гистологическое исследование

2.11. Пневматахографическая оценка функции внешнего дыхания мышей при введении неспецифического бронхоконстриктора.

2.11.1. Пневматахографическая установка.

2.11.2. Регистрация и анализ пневматахограмм.

2.12. Методы статистического анализа.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Динамика образования специфических ^Е-антител при трехкратной иммунизации мышей аллергеном тимофеевки и его комбинациями с адъювантами.

3.2. Подбор оптимальной дозы аллергена пыльцы тимофеевки для моделирования экспериментальной бронхиальной астмы.

3.3. Проверка эффективности сниженной дозы экстракта пыльцы тимофеевки (250 мкг/мышь) при моделировании экспериментальной бронхиальной астмы.

3.4. Характеристика разработанной модели.

3.4.1. Динамика содержания анти-вб ^Е-антител в сыворотке крови.

3.4.2. Относительный клеточный состав периферической крови.

3.4.3. Относительный клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа.

3.4.4. Гистологическое исследование легких.

3.4.5. Оценка функции внешнего дыхания с использованием метахолина.

Введение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Крючков, Николай Александрович, автореферат

Бронхиальная астма (БА) — одно из наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний. По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), в мире живет 300 млн. человек, болеющих астмой, а ежегодная смертность от этой патологии составляет 100-250 тыс. человек [2,18,19,27,28]. Примерно 1% от всех потерь лет жизни с поправкой на нетрудоспособность (DALY) обусловлены этой патологией. По данным поперечных исследований, в нашей стране 5,6-7,3% взрослых и 6-11% детей страдает астмой

К настоящему времени, течение БА контролируется стандартной терапией, замедляя развитие заболевания и радикально улучшая качество жизни пациентов. Однако у 10-20% больных заболевание протекает в тяжелой форме, плохо поддающейся терапевтической коррекции противовоспалительными и антибронхоконстрикторными препаратами [7].

Разработка новых подходов к лечению, диагностике и профилактике астмы остается актуальной задачей и невозможна без выяснения патогенетических механизмов развития болезни. Многочисленные исследования с участием людей, связанные, главным образом, с применением бронхоскопии и гистологического исследования материалов, полученных при биопсии и аутопсии, внесли значительный вклад в понимание проблемы. Но непреодолимые ограничения этического и технического характера не дают возможности ответить на множество вопросов, касающихся этиологии и патогенеза БА. Поэтому все более широкое применение находят биологические модели, позволяющие воспроизводить характерные признаки патологии у животных.

Уже разработаны методы индукции экспериментальной бронхиальной астмы (ЭБА) у крыс, морских свинок, овец, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов. Использование каждого из перечисленных животных имеет свои , преимущества и недостатки [29,74,142,143]. Однако, после успешного вос-‘ произведения признаков гиперпродукции ^Е, аллерген-индуцированного воспаления дыхательных путей и гиперреактивности бронхов у лабораторных мышей, стало ясно, что именно эти млекопитающие оптимальны для моделирования БА [78,84,132,142]. И тому есть несколько причин. Во-первых, удается обеспечить высокую степень соответствия ключевых гистологических, иммунных и функциональных феноменов экспериментальной патологии и астмы человека. Во-вторых, имеются эффективные лабораторно-инструментальные методы оценки функции внешнего дыхания, иммунологических показателей и морфологических изменений у грызунов. В-третьих, хорошо отработана технология получения чистых линий, трансгенных и но-каутных мышей. В-четвертых, мыши являются удобным экспериментальным объектом по причине невысоких материально-трудовых затрат на их содержание и питание и короткого репродуктивного цикла.

Наиболее используемым аллергеном для моделирования БА является овальбумин. Этот препарат имеет хорошо изученную структуру, свойства, налажен его коммерческий выпуск, что в сочетании с невысокой стоимостью делает его доступным для рутинного применения в исследовательской практике. С целью сенсибилизации ОА вводят интраперитонеально, при этом часто комбинируя с адъювантом, например, гидроксидом алюминия (алю-мом) или неполным адъювантом Фрейнда [10,120,142]. Наиболее используемые схемы предусматривают 7-8-кратное введение через день по 10-20 мкг аллергена или 2-3-кратное через 2-4 дня по 10 мкг в комбинации с алюмом. Адъювант способствует быстрой перестройке иммунного ответа в ТЬ2напралении и развитию ярких проявлений ^Е-ответа в ущерб точности и 8 физиологичности» воспроизведения маркеров БА. Поэтому все большее место отводится безадьювантным моделям, точнее имитирующим патогенез заболевания человека [11,51].

Кроме того, резко возрос интерес к использованию в процессе индукции ЭБА так называемых причинно-значимых аллергенов, вызывающих развитие и обострение заболевания у человека. Уже получены мышиные модели с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли [17, 71,73,76,77,93,94], маслины [39], пыльцы амброзии [134,147,79] и березы [46]. Такой подход, помимо прочего, позволяет изучать эффективность и безопасность антиген-специфической иммунотерапии (АСИТ) на доклинических этапах. К настоящему времени отсутствуют модели ЭБА с использованием большей части клинически-значимых аллергенов. Среди последних особое значение для нашей страны имеет пыльца дикорастущих и сельскохозяйственных трав: тимофеевки, полыни, овса и др.

В России к началу 2008 была воспроизведена лишь одна модель БА -краткосрочная с использованием овальбумина, подробно описанная в нескольких русскоязычных работах [8-11]. В то же самое время, было найдено 837 зарубежных исследований, посвященных той же проблеме. Это свидетельствует о необходимости заметно активизировать отечественную исследовательскую работу в этом направлении.

Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную безадъ-ювантную модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы у мышей с использованием экстракта пыльцы тимофеевки полевой. Задачи:

1. Изучить 1§Е-ответ мышей линии ВАЬВ/с на введение экстракта пыльцы тимофеевки.

2. Разработать оптимальную схему моделирования экспериментальной бронхиальной астмы у мышей путем введения экстракта пыльцы тимофеевки в отсутствие адъюванта.

3. Изучить динамику накопления аллерген-специфических гомоцито-тропных ^Е-антител в крови мышей в ходе моделирования бронхиальной астмы.

4. Провести оценку гистологических изменений легких мышей при моделировании БА

5. Разработать и провести первичную проверку применимости полуколичественной системы анализа гистологических изменений легких мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

6. Оценить изменения относительного клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

7. Оценить изменения лейкоцитарной формулы периферической крови у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

8. Провести пневмотахографическую оценку функции внешнего дыхания у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

Впервые в мире разработана и охарактеризована краткосрочная модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой у мышей без использования адъюванта

Впервые предложен метод полуколичественного анализа гистологических изменений легких мышей при моделировании бронхиальной астмы. Практическая значимость:

Разработанная модель бронхиальной астмы на лабораторных мышах может использоваться для оценки эффективности и безопасности потенци

10 альных лекарственных средств или их форм в процессе лечения и профилактики заболевания на доклиническом этапе. Особое значение имеет возможность применения данной модели для нахождения новых подходов к антиген-специфической терапии модифицированными аллергенами пыльцы тимофеевки.

Предложенная модель может использоваться и при изучении патогенетических механизмов развития бронхиальной астмы.

источник

Цель работы. разработать экспериментальную модель бронхиальной астмы на мышах, используя экстракт клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus (Der p). Материалы и методы. Мышей BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно в различных дозах (по белку) лиофили-зированного экстракта Der p три раза с трехнедельным интервалом в смеси с Al(OH) 3. Через 8 нед после последней иммунизации мышам вводили разрешающую дозу (челленджировали) Der p в течение 5 дней подряд путем ин-траназальных аппликаций (ИНА) или аэрозольно. Все мыши были разделены на 5 групп: группа 1 — иммунизация 50 мкг/мышь Der p (по белку) в смеси с 2 мг/мышь Al(OH) 3 и челленджирование Der p путем ИНА; группа 2 — иммунизация так же, как и в группе 1, и челленджирование Der p аэрозольно; группа 3 — иммунизация 100 мкг/мышь Der p (по белку) в смеси с 2 мг/мышь Al(OH) 3 и челленджирование Der p путем ИНА; группа 4 — иммунизация так же, как и в группе 3, и челленджирование Der p аэрозольно; группа 5 (отрицательный контроль) — иммунизация и челленджирование (ИНА) фосфатным солевым буфером.

Цель работы. разработать экспериментальную модель бронхиальной астмы на мышах, используя экстракт клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus (Der p). Материалы и методы. Мышей BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно в различных дозах (по белку) лиофили-зированного экстракта Der p три раза с трехнедельным интервалом в смеси с Al(OH) 3. Через 8 нед после последней иммунизации мышам вводили разрешающую дозу (челленджировали) Der p в течение 5 дней подряд путем ин-траназальных аппликаций (ИНА) или аэрозольно. Все мыши были разделены на 5 групп: группа 1 — иммунизация 50 мкг/мышь Der p (по белку) в смеси с 2 мг/мышь Al(OH) 3 и челленджирование Der p путем ИНА; группа 2 — иммунизация так же, как и в группе 1, и челленджирование Der p аэрозольно; группа 3 — иммунизация 100 мкг/мышь Der p (по белку) в смеси с 2 мг/мышь Al(OH) 3 и челленджирование Der p путем ИНА; группа 4 — иммунизация так же, как и в группе 3, и челленджирование Der p аэрозольно; группа 5 (отрицательный контроль) — иммунизация и челленджирование (ИНА) фосфатным солевым буфером. Спустя 24 ч после последнего челленджирования во всех группах измеряли гиперреактивность бронхов (ГРБ) в ответ на различные концентрации метахолина с помощью использования плетизмографии всего тела. Через 48 ч после последнего челленджирования во всех группах осуществляли забор крови для оценки лейкоцитарного состава, выполняли бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) для выявления клеток воспаления и проводили гистологическое исследование легких. Г истопатологические изменения в легких (аллергическое воспаление) были оценены при помощи использования полуколичественной балльной системы. Анти-Der p IgE, IgG1 и IgG2a в индивидуальных сыворотках определяли твердофазным ИФА через 7 дней после последней иммунизации и через 48 ч после челленджирования. Результаты. Уровни анти-Der p IgE в группах 1-4 как до, так и после челленджирования были существенно выше, чем в группе 5 (отрицательный контроль). Наивысший уровень анти-Der p IgE наблюдался в группе 2 до и после челленджирования. Уровни анти-Der p антител изотипов IgG1 IgG2a в группах 1-4 на всех сроках наблюдения были выше, чем в группе 5 (отрицательный контроль). Б то же время максимальные уровни ан-ти-Der p IgG1 и IgG2a как после иммунизации, так и после челленджирования наблюдались в группе 3. Мыши в группах 1 и 3 (челленджирование путем ИНА) продемонстрировали максимальную ГРБ в ответ на метахолин. Анализ клеточного состава БАЛ показал выраженное увеличение числа эозинофилов в группе 3 (иммунизация 100 мкг/мышь Der p + челленджирование путем ИНА) в сравнении с другими группами. Не выявлено значительных различий в показателях лейкоцитарного состава периферической крови между экспериментальными группами. Гистологическая картина общего аллергического воспаления и перибронхиальная/периваскулярная инфильтрация воспалительными клетками (согласно балльной системе) была наиболее выражена в группе 3 в сравнении с другими группами. Заключение. Иммунизация (сенсибилизация) мышей Der p в дозе 100 мкг/мышь с Al(OH) 3 и челленджирование Der p интраназальными аппликациями является приемлемым подходом для моделирования аллергической астмы на мышах.

Читайте также:  Психопрофилактика при бронхиальной астме

источник

Иммунное воспаление при бронхиальной астме является основным патогенетическим звеном в развитии механизмов бронхиальной обструкции, таких как бронхоспазм, гиперсекреция вязкой слизи и отек слизистой оболочки бронхов. В то же время выраженность воспалительной реакции, ее персистенция и прогрессирование, как и регуляция иммунного гомеостаза в целом, контролируются физиологическими механизмами, реализуемыми сложными нейроиммуноэндокринными связями.

В настоящее время существуют исследования, подтверждающие наличие нарушений нейроэндокринной регуляции, а именно в гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системе при течении атопической бронхиальной астмы [2, 3, 4, 6, 9]. Более того, по мнению ряда авторов, дисфункция гипофизарно-надпочечниковой системы может носить первичный характер и являться одним из ведущих патогенетическим механизмов в формировании и персистировании хронического аллергического процесса [5, 10].

В связи с перечисленными данными для нас основной целью стало уточнение патогенетических механизмов развития бронхиальной астмы посредством изучения процессов нейроэндокринной регуляции и степени их нарушения при формировании аллергической воспалительной реакции бронхов, а также возможности лечебной коррекции выявленных изменений.

Для реализации поставленной задачи мы использовали экспериментальную животную модель аллергической бронхиальной астмы с последующей светооптической и электронномикроскопической оценкой органов иммунной и бронхолегочной системы, а также гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной (ГГНС) и гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной систем (ГГАКС).

В исследование были включены 50 половозрелых особей мышей-самцов линии BALB/c. Животные сенсибилизировались интраперитонеально двукратным введением 10 мкг овальбумина (Sigma), с последующим длительным (с 22 по 45 дни эксперимента) ингаляционным введением аллергена. Часть животных с 22 дня эксперимента получали лечение методом периодической гипобарической гипоксической стимуляции (ПГГС) в условиях экспериментальной барокамеры (вакуумная установка — высотомер №611224). Каждый сеанс состоял из подъема, пребывания на «высоте» 3500 м над уровнем моря (493,2 мм рт. ст) и спуска. Курс лечения состоял из 25 сеансов (21-45 дни эксперимента). Материал подвергался светооптическому, электронномикроскопическому, морфометрическому, иммуноцитохимическому исследованию.

При воспроизведении протокола эксперимента наблюдали морфофункциональные нарушения, свойственные бронхиальной астме: персистирующее воспаление в стенке внутрилегочных бронхов, характеризующееся инфильтрацией слизистой и подслизистой оболочек эозинофилами, тучными клетками, макрофагами, лимфоцитами, плазматическими клетками (рис. 1). Кроме того, мы наблюдали содружественную реактивность центральных и периферических органов иммуногенеза, проявляющуюся в лимфоретикулярной гиперплазии и плазмоцитарно-макрофагальной трансформации лимфатических узлов, тимуса и селезенки.

Рис. 1. Перибронхиальная инфильтрация полиморфноклеточными клетками, включая эозинофилы. Фиксация: 10 % нейтральный формалин. Окраска: гематоксилини Майера
и озин. Ув.: об. 40, ок. 10

При изучении ГГНС было выявлено, что с увеличением длительности эксперимента (через 14-22 суток) отмечалась резкая функциональная активация нонаптидергических нейросекреторных клеток (НСК). Это выражалось в возрастании объемов ядер и ядрышек НСК (особенно «светлых» функционально активных элементов). При этом увеличивалось относительное содержание пикноморфных и дистрофически измененных НСК в составе исследованных ядер гипоталамуса. В цитоплазме НСК и их аксонов на этом этапе регистрируются крупные аутофагосомы и липидные капли. Большое количество липосом определяется и в питуицитах задней доли гипофиза. Митохондрии набухают и вакуолизируются. Данные ультраструктурные изменения нами расценены как показатель локального внутриклеточного повреждения цитоплазмы НСК, развивающегося в состоянии их функционального напряжения.

При проведении морфометрического анализа состояния аксонов НСК на уровне нейрогипофиза оценивалось соотношение количества пептидергических секреторных гранул к числу «пустых» пузырьков (секреторные гранулы в состоянии опустошения). Обнаружено, что у мышей экспериментальной группы происходит значительное накопление заполненных нейропептидами гранул на уровне аксовазальных контактов нейрогипофиза (рис. 2). Все это свидетельствует о депонировании нейросекрета и задержке (блокировке) его высвобождения в общий кровоток. Последнее является признаком «изнашивания» системы и ограничения ее адаптивных возможностей.

Полученные результаты соответствуют современным представлениям о роли гипоталамической нонапептидергической нейроэндокринной системы (ГГНС) в поддержании тканевого и клеточного гомеостаза, обеспечении процессов адаптации и компенсации нарушенных функций различных органов висцеральных систем [1, 7, 8]. При этом в нашей работе в условиях создания экспериментальной модели бронхиальной астмы активация ГГНС происходит на фоне разбалансировки процессов продукции и высвобождения гуморальных факторов центрального звена нейроэдокринной регуляции, что, безусловно, приводит к дефициту данных адаптивных нейрогормонов в общем кровотоке.

При анализе клеточных особенностей аденогипофиза были получены данные об активации цитофизиологических процессов у кортикотропоцитов, проявляющейся в усиленном накоплении в них секреторных гранул, гипертрофией комплекса Гольджи и канальцев эндоплазматического ретикулума.

Рис. 2. Блокировка высвобождения секреторных гранул в аксонах нейросекреторных клеток
гипоталамуса Ув. х 28000

Существенно, что усиление активности кортикотропоцитов у данных животных не только не сопровождается адекватной реакцией соответствующих зон надпочечников, но, напротив, они протекали на фоне морфологической редукции органа ГГАКС: отмечалось достоверное уменьшение протяженности клубочковой и особенно пучковой зон, при отсутствии существенных изменений сетчатой зоны. Иными словами, будучи эффекторным звеном ГГАКС, надпочечники не проявили структурных особенностей, свидетельствующих об их усилении функционирования, несмотря на очевидное возрастание активности кортикотропоцитов, продуцирующих АКТГ. Такое положение может свидетельствовать либо о затруднении выведения кортикотропина из аденогипофиза в общий кровоток, либо о потере чувствительности кортикоцитами надпочечников к аденогипофизарному влиянию, либо о сочетании обоих механизмов. Выявленные нами изменения в надпочечниках означают явное нарушение функционирования ГГАКС у мышей (особенно в отдаленные сроки наблюдений). В нашей работе мы не производили параллельного исследования содержания основных гормонов системы гипофизарно-надпочечникого взаимодействия, тем не менее, морфологические признаки указывают на редукцию и недостаточную функциональную активность эффекторного органа ГГАКС, с вероятным снижением глюкокортикоидов в кровотоке испытуемых животных и снижения их противовоспалительного эффекта на органы бронхолегочной системы.

Оценивая морфологическое состояние крупноклеточных ядер гипоталамуса и структур гипофиза у мышей, получавших баролечение, мы также отмечали усиление секреторной активности ГГНС и кортикотропоцитов аденогипофиза. Это проявлялось в увеличении размеров ядер и ядрышек «светлых» НСК, как супраоптических так и паравентрикулярных ядер гипоталамуса, набухании митохондрий, расширении канальцев эндоплазматического ретикулума и цистерн комплекса Гольджи. В нейрогипофизе отмечается выраженное (в 5 раз по сравнению с нелеченными животными) уменьшение содержания нейросекреторного материала в терминалях аксонов НСК, расширение синусоидных капилляров, увеличение числа фенестр эндотелиоцитов. Аксоны резко расширены и имеют просветленную цитоплазму, характерным является увеличение количества «пустых» пузырьков («остаточных гранул»). Вместе с тем следует контатировать, что доля элементарных гранул остается повышенной, относительно интактных мышей (табл. 1).

Соотношение количества пептидергических гранул к количеству пустых пузырьков в терминалях аксонов нейросекреторных клеток гипоталамуса
(в %) у мышей

Мыши с экспериментальной бронхиальной астмой без баролечения

Мыши с экспериментальной астмой, получившие баротерапию

Примечание: использование сетки (палетки) на электроннограмме при снятии морфометрических параметров по А.С. Якубов, В.А. Кац, 1984.

Для кортикотропоцитов аденогипофиза у описываемых животных мы также получили данные, свидетельствующие об их активации. Клетки увеличиваются в размерах, становятся более отростчатыми. У них гипертрофируются комплекс Гольджи, канальцы эндоплазматической сети, митохондрии. Секреторные гранулы с характерной электронноплотной сердцевиной локализуются как в области пластинчатого комплекса Гольджи, так и линейно вблизи плазматической мембраны. Количество секреторных гранул у данных мышей по сравнению с нелеченными животными уменьшается, что свидетельствует об активной экструзии секреторного материала.

У этой группы экспериментальных животных, по данным морфометрического анализа, установлено возрастание функционирования коры надпочечников не только по сравнению с нелеченными мышами, но и по сравнению с интактными животрными. Увеличивается протяженность клубочковой и пучковой зон коры надпочечников (табл. 2). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что в условиях гипобаротерапии происходит выраженная активизация ГГАКС как в части синтеза гормонов, так и в части их выведения в кровь с последующим усилением стероидогенеза в кортикоцитах надпочечников.

Протяженность (мкм) зон коры надпочечников
у экспериментальных животных

Мыши с моделью астмы без баротерапии

Мыши с моделью астмы, получившие баролечение

Бароадаптация вызывает в определенной степени понижение воспалительных реакций в бронхолегочной системе мышей. Данный метод коррекции умеряет сосудистую реакцию и эктравазацию плазмы, предотвращая деструктивные изменения в клетках и тканях. При этом величина периваскулярных полиморфно-клеточных, плазмоцитарных инфильтратов уменьшается, хотя и не ликвидируется полностью. Важно отметить, что в этих условиях в слизистой оболочке бронхов отмечается тенденция к уменьшению суммарного числа эозинофильных лейкоцитов (табл. 3).

Анализируя полученные нами результаты исследования, мы можем сделать определенное заключение о том, что воспроизведение модели экспериментальной бронхиальной астмы с развитием персистирующего аллергического воспаления в бронхах, происходит на фоне нарушений адаптивных реакций двух важнейших регуляторных систем: ГГНС и ГГАКС, а именно на фоне разбалансировки процессов продукции и высвобождения нейросекрета в крупноклеточных ядрах гипоталамуса, а также на фоне признаков морфологической редукции коры надпочечников, несмотря на явное усиление активности кортикотропоцитов. Более того, мы берем на себя ответственность утверждать, что сами эти нарушения представляют собой значимые патогенетические механизмы в развитии экспериментальной бронхиальной астмы.

Плотность эозинофилов в собственной пластинке слизистой оболочки внутрилегочных бронхов

Мыши с экспериментальной астмой без баролечения

Мыши с экспериментальной астмой, получившие баролечение

Лечение животных в условиях гипобарокамеры приводило к регрессии ультраструктурных признаков повреждения аксонов НСК, наблюдаемых у нелеченных мышей. Это проявляется в том, что соотношение количества пептидергических гранул и «пустых» пузырьков приближается к таковому, характерному для интактных мышей. Этот показатель важен, ибо он свидетельствует об установлении в ГГНС адекватных условий для процессов синтеза нейрогормонов (как в части продукции, так и в высвобождении).

При воздействии ПГГС установлено возрастание функционирования коры надпочечников не только по сравнению с нелеченными мышами, но и по сравнению с интактными животными. Увеличивается протяженность клубочковой и пучковой зон коры надпочечников. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что в условиях гипобаротерапии происходит выраженная активация ГГАКС как в части синтеза гормонов, так и в части их выведения в кровь с последующим усилением стероидогенеза в кортикоцитах надпочечников.

Таким образом, воздействие прерывистой гипоксической стимуляции приводило у экспериментальных животных не только к уменьшению степени эозинофильной воспалительной реакции в слизистой бронхов, регрессии активации органов иммунной системы, но и нормализации функционирования основных регуляторных нейроэндокринных систем.

Список литературы

  1. Акмаев И.Г., Гриневич В.В. Нейроиммуноэндокринология гипоталамуса — М.: Медицина, 2003. — 165 с.
  2. Вытрищак В.В. Эндокринные и иммунные аспекты формирования клинических вариантов бронхиальной астмы, возможности рациональной терапии: дис. . д-ра мед. наук. — 1993.
  3. Патоморфологические изменения гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы у больных бронхиальной астмой, погибших в астматическом статусе / А.А. Григоренко, С.А. Степанов, Н.Л. Ушакова, И.Ю. Макаров, С.Н. Рощин, О.П. Чижиков // Архив патологии. — 2002. — №2. — С. 7-10.
  4. Ландышев Ю.С. Бронхиальная астма: (нейроэндокринная система, иммунитет, клиника, диагностика, лечение) // М-во здравоохранения и соц. развития Рос. Федерации, Гос. образоват. учреждение высш. проф. образования Амур. гос. мед. акад. — Благовещенск: Изд-во АГМА, 2006. — 169 с.
  5. Лев Н.С. Нейропептиды и другие нейрогуморальные регуляторы в патогенезе бронхиальной астмы у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. — 2000. — №2. — С. 19-23.
  6. Мишук В.П., Ландышев Ю.С. Суточные ритмы эндокринной и дыхательной систем у больных бронхиальной астмой. — Благовещенск: Амурская государственная медицинская академия. — 2005. — 112 с.
  7. Поленов А.Л. Прямое действие гипоталамических нонапептидных нейрогормонов (ННГ) на секреторную функцию эндокринных желез // Нейробиологические аспекты современной эндокринологии. — 1991. — C. 45-46.
  8. Стадников А.А. Роль гипоталамических нейропептидов во взаимодействиях про- и эукариот: структурно-функциональные аспекты. — Екаринбург: УрО РАН, 2001. — 243 с.
  9. Buske-Kirschbaum А. Kristin von Auer, Silke Krieger, Stefan Weis Blunted Cortisol Responses to Psychosocial Stress in Asthmatic Children: A General Feature of Atopic Disease? // Psychosomatic Medicine — 2003. — №65. — P. 806-810.
  10. Corticotropin-releasing hormone deficiency allergen-induced airway inflammation in a mouse model of asthma / E.S. Silverman, D.T. Breault, J. Vallone, S. Subramanian, A.D. Yilmaz, S. Mathew // J Allergy Clin Immunol. — 2004. — Oct; 114(4). — P. 747-754.

Железнов Л.М., д.м.н., профессор, зав. кафедрой анатомии человека ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Оренбург;

Молдавская А.А., д.м.н., профессор кафедры анатомии человека Астраханской государственной медицинской академии, г. Астрахань.

источник

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *