Конденсат выдыхаемого воздуха бронхиальная астма

…анализ конденсата выдыхаемого воздуха является перспективным исследованием благодаря простой неинвазивной технике получения материала из нижних дыхательных путей для определения различных биомаркеров.

В последние годы анализу выдыхаемого воздуха придается все большее значение в диагностике болезней органов дыхания, для мониторинга воспаления и оксидантного стресса легких.

В выдыхаемом воздухе могут определяться различные газы, такие как оксид азота (NO), оксид углерода, этан, пентан и гидрокарбонаты. Тяжелые нелетучие субстанции (медиаторы воспаления, цитокины, оксиданты) могут быть определены в конденсате выдыхаемого воздуха, что открывает новые перспективы для исследования выдыхаемого воздуха.

Многие болезни легких, включая бронхиальную астму, хроническую обструктивную болезнь легких, бронхоэктазы, муковисцидоз, интерстициальные заболевания легких, характеризуются хроническим воспалением и оксидантным стрессом. «Золотым стандартом» оценки воспаления в стенке бронхов является фибробронхоскопия с выполнением биопсии.

Для получения нелетучих медиаторов и маркеров воспаления в дыхательных путях требуется проведение инвазивных методов исследования, таких как бронхоальвеолярный лаваж и получение индуцированной мокроты. Эти процедуры не могут проводиться повторно через короткий промежуток времени, особенно у тяжелых больных, детей и в амбулаторной практике. Также показано, что индуцирование мокроты ингаляцией гипертонического раствора хлорида натрия может приводить к бронхоконстрикции.

Этим можно объяснить растущий интерес к анализу конденсата выдыхаемого воздуха как к простому неинвазивному методу оценки степени воспаления в дыхательных путях, дифференциальной диагностике легочных заболеваний, мониторинга эффективности проводимого лечения.

Конденсат выдыхаемого воздуха получают путем охлаждения выдыхаемого воздуха. тот метод является неинвазивным, не оказывает влияния на функцию легких и воспаление. Для получения 1-3 мл конденсата необходимо 10-15 минут спокойного дыхания.

В настоящее время в конденсате выдыхаемого воздуха обнаружены нелетучие соединения, включая белки, липиды и оксиданты. Первые исследования по выявлению поверхностно-активных свойств конденсата выдыхаемого воздуха, в том числе легочного сурфактанта, были проведены в нашей стране Г.И. Сидоренко и др. в 1980 г., М.В. Курик и др. в 1987 г. В последние годы число субстанций, определяемых в конденсате выдыхаемого воздуха, неуклонно растет. Основные из них – медиаторы воспаления и оксиданты.

ПЕРЕКИСЬ ВОДОРОДА

Перекись водорода (Н2О2) продуцируется воспалительными клетками (эозинофилами, нейтрофилами и макрофагами). Избыток Н2О2 оказывает цитотоксическое действие на бронхиальный эпителий, способствует высвобождению медиаторов воспаления и развитию гиперреактивности бронхов. Повышение уровня Н2О2 в дыхательных путях может приводить к увеличению ее уровня в выдыхаемом воздухе. Концентрация Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха повышена в 5 раз у курильщиков по сравнению с некурящими.

Концентрация Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха увеличина по сравнению со здоровыми людьми у врослых больных бронхиальной астмой и у детей с обострением и ремиссией бронхиальной астмы. Увеличение содержания Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха у больных с бронхиальной астмой коррелирует со снижением объема форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1).

Также Antczak A. et al. в двойном слепом плацебо контролируемом исследовании показали, что у больных бронхиальной астмой, получавших лечение ингаляционными глюкокортикостероидами, уровень Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха значительно уменьшился по сравнению с пациентами, получавшими плацебо. У больных бронхиальной астмой концентрация Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха коррелирует с эозинофилией мокроты, но не выявлено связи с гиперреактивностью бронхов.

Уровень Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха повышен у больных со стабильной хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) по сравнению со здоровыми людьми, и дальнейшее его обнаружено при обострении болезни. Не было достоверных различий в концентрации Н2О2 курящих, бывших курильщиков и некурящих больных с ХОБЛ. Также в двойном слепом плацебоконтролируемом исследовании с двумя параллельными группами установлено, что длительный прием ацетилцистеина снижает уровень Н2О2 конденсате выдыхаемого воздуха у больных со стабильной ХОБЛ.

У взрослых больных с клинически стабильным муковисцидозом не выявлено изменений Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха. У детей муковисцидозом, которые переносили обострение легочной инфекции, уровень Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха снизился, тогда как клиническое состояние больных улучшилось лишь после антибактериальной терапии.

Повышение концентрации Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха по сравнению со здоровыми обнаружено у пациентов с бронхоэктазами, и была выявлена обратная корреляция между уровнем Н2О2 и ОФВ1. Также увеличенный уровень Н2О2 в конденсате выдыхаемого воздуха обнаружен у больных с респираторным дистресс-синдромом и у больных с раком легкого после лобэктомии и пульмонэктомии, что рассматривается как проявление оксидантного стресса.

ЭЙКОЗАНОИДЫ

Эйкозаноиды – метаболиты арахидоновой кислоты – являются медиаторами воспаления, ответственными за сокращение гладкой мускулатуры, вазоконстрикцию/вазодилатацию, повышение сосудистой проницаемости, гиперсекрецию слизи, кашель и приток воспалительных клеток. К ним относятся простагландины, тромбоксан, изопростаны и лейкотриены (ЛТ).

Неинвазивное определение а анализ этих медиаторов в конденсате выдыхаемого воздуха для оценки эффективности антагонистов лейкотриенов или ингибиторов томбоксана более эффективны, чем анализ крови, мочи и бронхоальвеолярный лаваж.

8-Изопростан отражает клеточные эффекты оксидативного стресса и, следовательно, воспалительного процесса в дыхательных путях. У пациентов с легкой степенью бронхиальной астмы обнаружено увеличение концентрации 8-изопростана в конденсате выдыхаемого воздуха в 2 раза по сравнению сло здоровыми людьми, а при тяжелой форме заболевания его уровень был в 3 раза выше чем у больных с легкой бронхиальной астмой, независимо от лечения ингаляционными глюкокортикостероидами.

Концентрация 8-изопростана также была повышена у курильщиков, но не столь значительно, как у больных ХОБЛ.

Уровень 8-изопростана в конденсате выдыхаемого воздуха у больных муковисцидозом был повышен в три раза и негативно коррелирован с ОФВ1.

Isola N. et al. показали, что содержание 8-изопростана в конденсате выдыхаемого воздуха у больных с идиопатическим фиброзирующим альвеолитом было достоверно выше и коррелировало с тяжестью заболевания. Это позволяет использовать 8-изопростан в качестве биомаркера активности воспаления при этом заболевании.

Уровень ЛТВ4 и цистеиновых ЛТ в конденсате выдыхаемого воздуха повышен у пациентов с бронхиальной астмой по сравнению со здоровыми людьми, при утяжелении астмы их содержание увеличивается. Повышение концентрации ЛТВ4 наблюдалось также при ХОБЛ, в то время как содержание ЛТЕ4 увеличивается только при бронхиальной астме. Уровень ЛТ в конденсате выдыхаемого воздуха моет быть маркером при оценке эффективности лечения антагонистами ЛТ у пациентов с ХОБЛ и бронхиальной астмой.

ПРОДУКТЫ, СВЯЗАННЫЕ С NO

Многочисленные исследования, показали, что определение NO в конденсате выдыхаемого воздуха является достаточно чувствительным методом для оценки активности воспалительного процесса и тяжести течения бронхиальной астмы.

Высокий уровень нитратов был обнаружен в конденсате выдыхаемого воздуха больных бронхиальной астмой, особенно в период обострения. Содержание нитротирозина, стабильного продукта распада пероксинитрита, повышено в конденсате выдыхаемого воздуха у больных с легкой бронхиальной астмой и снижено у пациентов с тяжелой бронхиальной астмой, получающих базисную терапию ингаляционными глюкокортикостероидами.

Уровень нитрозотиола уменьшался через 3 недели после лечения будесонидом в дозе 400 мкг/сутки, чего не наблюдалось при лечении низкими дозами (100 мкг/сутки). Напротив, быстрое дозозависимое снижение уровня нитритов/нитратов в конденсате выдыхаемого воздуха обнаружено у пациентов с бронхиальной астмой. Это позволяет предположить, что уровень нитритов/нитратов более чувствителен к противовоспалительному лечению.

Уровень нитрозотиола и нитритов в конденсате выдыхаемого воздуха повышен у больных с ХОБЛ по сравнению со здоровыми курильщиками. Достоверная негативная корреляция между ОФВ1 и продуктами нитротирозина показана у пациентов с ХОБЛ в отличие от больных бронхиальной астмой и здоровых субъектов. Это свидетельствует о важной роли метаболитов NO в воспалении дыхательных путей при ХОБЛ.

Достоверное повышение уровня нитритов/нитратов и нитротирозина в конденсате выдыхаемого воздуха обнаружено у детей с обострением муковисцидоза и у взрослых пациентов с тяжелым течением заболевания.

ПРОТЕИНЫ И ЦИТОКИНЫ

Данные, касающиеся содержания белков в конденсате выдыхаемого воздуха, противоречивы. У курильщиков обнаружено повышение содержания общего белка в конденсате выдыхаемого воздуха по сравнению с некурящими. Содержание интерлейкина-1, растворимого интерлейкина-2 (ИЛ-2) рецепторного протеина, ИЛ-6, фактора некроза опухоли в конденсате выдыхаемого воздуха при различных легочных заболеваниях отличалось. Уровень ИЛ-8 в конденсате выдыхаемого воздуха умеренно повышен у больных муковисцидозом в стадии ремиссии, тогда как у пациентов с обострением заболевания его концентрация была значительно выше.

ДРУГИЕ ВЕЩЕСТВА

В конденсате выдыхаемого воздуха определяют более 100 химических соединений, в том числе показатели липидного, белкового, углеводного обмена, мочевую и щавелевую кислоты, острофазовые реагенты (С-реактивный белок, серомукоид), микроэлементы и др.

Увеличение содержание ацетилхолина, серотонина и гистамина в конденсате выдыхаемого воздуха было связано с тяжестью воспаления дыхательных путей, бронхиальной обструкцией и бронхиальной гиперреактивностью при бронхиальной астме и остром бронхите.

Высокий уровень ацетилхолина, катехоламинов, гистамина и серотонина, а также низкий уровень кортизола и тироксина в конденсате выдыхаемого воздуха обнаружен у шахтеров в ранней стадии антракосиликоза.

В конденсате выдыхаемого воздуха у больных атопической бронхиальной астмой выявлены низкая концентрация магния и увеличенный уровень кальция.

У больных с муковисцидозом в конденсате выдыхаемого воздуха увеличен уровень натрия и хлорида, что коррелирует с потовым тестом и тяжестью течения заболевания. Эти данные могут представлять определенный клинический интерес и требуют дальнейших комплексных исследований.

источник

Среди значимых проблем мирового здравоохранения заслуженное место занимает бронхиальная астма (БА). В разных странах распространённость БА находится в диапазоне от 1 до 18%. Согласно современному определению Глобальной инициативы по БА (GINA — от англ. Global Initiative for Asthma)

«Бронхиальная астма — хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором принимают участие многие клетки и клеточные элементы с развитием бронхиальной гиперреактивности, приводящей к бронхообтрукции, которая часто бывает обратимой» [2, 3].

Высокая распространенность и неуклонный рост в последние годы данной патологии определяют важное социально-экономическое и медицинское значение этой проблемы, необходимость исследования механизмов развития заболевания с целью разработки эффективных методов диагностики, профилактики и патогенетической терапии [4].

В последние годы внимание ученых привлекают короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК) – это монокарбоновые кислоты с длиной цепи до 8 атомов углерода. Они образуются, главным образом, в результате микробной ферментации углеводов, липидов, белков [5].

Абсорбированные КЖК вносят существенный вклад в обеспечение локальных и системных функций организма, в частности, являются одним из источников энергии, воздействуют на экспрессию различных генов, регулируют процессы пролиферации, дифференцировки, апоптоза эпителиоцитов, клеток иммунной системы [6, 7, 8, 9, 10, 11]. Вероятно, изменения со стороны данных биологически активных веществ могут иметь значение в развитии данной этого заболевания.

Ввиду вышеизложенного, целью работы явилось: изучить количественные сдвиги в спектре короткоцепочечных жирных кислот в конденсате выдыхаемого воздуха у больных бронхиальной астмой в период обострения.

Материалы и методы. Обследовано 20 больных (11 мужчин и 9 женщин) в возрасте 23-55 лет с диагнозом: бронхиальная астма среднетяжелое течение, обострение средней степени тяжести. В контрольную группу вошло 20 практически здоровых лиц в соотношении сопоставимом по полу и возрасту с больными.

Оценку спектра КЖК в биосубстрате проводили по методике М.Д. Ардатской (2004) [1], включающей два этапа: процесс пробоподготовки и непосредственно газожидкостной хроматографии.

Мы модифицировали данную методику. Полученный конденсат выдыхаемого воздуха экстрагировали в эфире, серной кислоте, внутреннем стандарте ( α,α-диметилмасляная кислота) при встряхивании в течение 10 мин и центрифугировали при 3000 об/мин в течение того же времени. Затем образовавшийся супернатант подвергали выпариванию до сухого остатка с последующим добавлением гексана. Анализ образца проводили на хроматографе «Кристалл-2000М» (Россия) с плазменно- ионизационным детектором, определяли количество: С2 – уксусной, С3 – пропионовой, С4 – масляной, isoС4 – изомасляной, С5 — валериановой, С6 – капроновой, С7 – гептановой кислот.

Статистическую значимость различий показателей в сопоставимых группах оценивали по критерию Манна-Уитни. Числовые данные приведены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-го; 75-го процентилей).

Результаты исследования. В конденсате выдыхаемого воздуха во всех исследуемых группах преобладала пропионовая кислота, на долю которой приходилось 77,8% у здоровых лиц и 82,4% – у пациентов с обструктивной болезнью легких.

Таблица 1 Содержание жирных кислот c короткой углеводородной цепью в конденсате выдыхаемого воздуха у больных бронхиальной астмой в период обострения (нМоль/мг) (Me (25-й; 75-й))

источник

Л. В. Львова, канд. биол. наук

… не обременительный для пациента, пригодный для использования в амбулаторных и даже домашних условиях метод исследования конденсата выдыхаемого воздуха все больше и больше привлекает внимание клиницистов.

С каждым вдохом в наш организм проникают аллергены, патогенные микроорганизмы и отнюдь не безвредные оксиданты окружающей среды — табачный дым, озон, окислы азота. В норме их пагубному влиянию надежно противостоит жидкость, выстилающая нижние отделы дыхательных путей и состоящая из множества летучих и нелетучих соединений. В случае легочной патологии та же жидкость, но уже с измененным качественным и количественным составом может служить источником информации о повреждении дыхательных путей, воспалительных процессах и эффективности лечения. Для полноценного же использования источника информации всего-то и нужно, что собрать и проанализировать конденсат выдыхаемого воздуха. Придя к такому выводу, белорусские кардиологи, пожалуй, первыми начали работать над созданием устройства для сбора конденсата при обычном дыхании человека. В начале 80-х годах уже прошлого, ХХ века, такой прибор был разработан. Правда, направление исследований пришлось менять, как говорится, на ходу, поскольку первоначальные предположения о достаточно высоком содержании в конденсате липидов, входящих в состав сурфактанта не оправдались. К тому же со временем стало ясно, что даже использование весьма внушительного объема конденсата, в несколько раз превышающего обычно используемые дозы, позволяет обнаружить лишь следовые количества липидного фосфора, хотя он и является основным компонентом сурфактанта легких. В результате усилия ученых сосредоточились на определении других, не менее информативных для клиники легочных заболеваний, соединениях: цитокинах и эйкозаноидах, окиси азота и продуктах ее метаболизма, электролитах и активных формах кислорода.

Сегодня за неимением стандартной методики сбор конденсата осуществляется различными способами. Но наибольшей популярностью среди специалистов пользуется метод, при котором пациент дышит через ротовой мундштук со специальным клапаном: подобная конструкция, предотвращая смешивание вдыхаемого и выдыхаемого воздуха, тем самым обеспечивает поступление в конденсор исключительно выдыхаемого воздуха. Во избежание разрушения некоторых маркеров (к примеру, 8-изопростана или лейкотриенов) во время сбора конденсата конденсор охлаждается либо тающим льдом, либо рефрижераторным устройством. С учетом того, что загрязнение слюной может исказить результаты анализа (к примеру, большое количество эйкозаноидов в слюне детей-астматиков может повлиять на уровень эйкозаноидов в конденсате) сбор конденсата проводят под постоянным контролем его загрязнения слюной, в частности, по активности α-амилазы.

Как и любой метод, исследование конденсата выдыхаемого воздуха имеет свои достоинства и недостатки. Говоря о достоинствах, приверженцы метода обычно упоминают:

• простоту и воспроизводимость результатов;
• компактность прибора и возможность проведения исследования в поликлинических и даже домашних условиях;
• сопоставимость изменений, обнаруживаемых при исследовании конденсата, с изменениями, выявленными традиционными методами — анализе бронхоальвеолярной лаважной жидкости или индуцированной мокроты;
• безопасность для слизистой бронхов и отсутствие фактора разведения, имеющих место при бронхоскопии и последующем исследовании бронхоальвеолярной лаважной жидкости;
• доступность для пациентов любого возраста — от новорожденных до лиц преклонного возраста;
• возможность получения результата при спонтанном дыхании и при механической вентиляции легких.

Говоря о недостатках, они, прежде всего, сетуют на отсутствие стандартной методики сбора конденсата. Их волнует, что нет гарантии испарения воды с капелек жидкости, образующихся при конденсации выдыхаемых паров; что для правильного получения конденсата выдыхаемого воздуха прибор для его сбора нужно испытывать с помощью аэрозольных растворов, содержащих известные концентрации определяемых веществ; что отсутствует специфичность конденсата выдыхаемого воздуха в отношении того или иного анатомического образования и что до сих пор не ясно, из какого именно отдела нижних дыхательных путей происходят аэрозольные частицы.

В конденсате выдыхаемого воздуха взрослых содержание перекиси водорода выше, чем у детей. Казалось бы, этот показатель должен зависеть от возраста. Но у здоровых детей количество выдыхаемой перекиси водорода не зависит от возраста. Впрочем, с полом и с состоянием функции легких оно тоже никоим образом не коррелирует. Зато у детей-астматиков с различной тяжестью заболевания явно прослеживается взаимосвязь между выдыхаемой перекисью водорода, количеством эозинофилов в мокроте и гиперреактивностью дыхательных путей. Причем у тяжелых астматиков кортикостероидная терапия снижает только концентрацию выдыхаемой закиси азота. Уровень перекиси водорода по-прежнему остается повышенным. Вероятно, по причине избыточного количества супероксидных радикалов, продуцируемых преобладающими в бронхах нейтрофилами.

По той же причине у курильщиков пятикратно — в сравнении с некурящими — увеличивается уровень выдыхаемой перекиси водорода. При хронических обструктивных заболеваниях легких он возрастает еще больше. И что интересно: по статистике хроническими обструктивными заболеваниями страдает 10%, максимум — 20% курильщиков, что явно противоречит бытующему ныне мнению о ведущей роли курения в развитии подобной патологии. Не менее любопытно и то, что у курящих и некурящих больных нет существенных различий в концентрации выдыхаемой перекиси водорода. Как нет связи между количеством выкуриваемых сигарет и уровнем перекиси водорода. Вывод отсюда простой: для хронических обструктивных заболеваний легких окислительный стресс, действительно, характерен. Только далеко не всегда возникновение этого стресса обусловлено курением.

С изопростанами ситуация несколько иная.

По некоторым данным в конденсате выдыхаемого воздуха курильщиков содержится гораздо больше 8-изопростана, чем у больных хроническими обструктивными заболеваниями легких. При легком течении астмы уровень выдыхаемого 8-изопростана превышает норму вдвое, а при тяжелом — и того больше, в три раза. Причем вне зависимости от проводимой стероидной терапии, что, на взгляд исследователей, указывает на неспособность кортикостероидов ингибировать окислительный стресс. Но этот же факт свидетельствует о том, что изопростаны можно использовать в качестве маркеров выбора при оценке тяжести окислительного стресса у больных астмой.

Вместе с тем развитие бронхиальной астмы сопровождается усилением интенсивности перекисного окисления липидов и снижением антиоксидантной активности конденсата выдыхаемого воздуха. По мере увеличения тяжести заболевания сдвиг в сторону преобладания свободно-радикальных процессов нарастает и достигает максимума при среднетяжелом течении заболевания. А это означает, что по уровню продуктов перекисного окисления липидов (к примеру, маланового диальдегида) и активности антиоксидантных ферментов (к примеру, супероксидисмутазы) конденсата можно судить об активности метаболического процессах в легких.

Как известно, при астме и хронических обструктивных заболеваниях легких в клетках усиливается экспрессия циклооксигеназы-2, ответственной за продуцирование тромбоксанов и простагландинов, одни из которых обладают противовоспалительным действием, а другие — к примеру, ПгЕ 2 — препятствуют образованию активных форм азота.

Теоретически и в том, и в другом случае их содержание в конденсате выдыхаемого воздуха должно возрастать. В действительности все выглядит иначе: по сравнению со здоровыми людьми у больных хроническими обструктивными заболеваниями легких возрастает уровень выдыхаемых простагландинов (ПгЕ 2 и ПгЕ 2 ), а у астматиков — уровень тромбоксана В 2 . Вдобавок при бронхиальной астме в конденсате выдыхаемого воздуха ощутимо повышается содержание целого ряда лейкотриенов — активных участников формирования заболевания.

То, что окись азота реагирует с супероксиданионом с образованием S-нитрозотиолов и что промежуточные продукты обмена закиси азота способны модифицировать структуру различных биомолекул, а в конденсате выдыхаемого воздуха идентифицируются нитрозо- и нитропроизводные типа 3-нитротирозина навело исследователей на мысль о получении информации о состоянии метаболизма окиси азота и его роли в воспалительном процессе дыхательных путей и окислительном стрессе. Дальше — больше. После того, как в конденсате выдыхаемого воздуха, самостоятельно собранного больными бронхиальной астмой в домашних условиях, было обнаружено высокое содержание нитритов, стало ясно, что такой тест идеально подходит в качестве «домашнего» маркера обострения бронхиальной астмы.

В ходе последующих исследований выяснилось, что в трахеальной жидкости детей-астматиков с дыхательной недостаточностью существенно снижается уровень S-нитрозотиолов, а через три недели после начала лечения стероидами их содержание в конденсате по-прежнему оставалось сниженным. В отличие от уровня нитритов/нитратов этот показатель оказался весьма чувствительным к противовоспалительной терапии. При ингаляционном введении кортикостероидов уровень нитритов/нитратов в конденсате снижался, а степень его снижения напрямую зависела от дозы стероидов. Вместе с тем увеличение концентрации выдыхаемого нитротирозина неизменно сопутствовало ухудшению легочной функции больных. Избыточную продукцию нитротирозина исследователи объяснили накоплением агрессивных промежуточных продуктов, образующихся при взаимодействии окиси азота с активными формами кислорода. Сам же показатель предложили считать прогностическим признаком ухудшения течения астмы.

Концепция «одни дыхательные пути — одна болезнь» появилась недавно, буквально в последние годы, когда выяснилось, насколько тесно связаны аллергический ринит и бронхиальная астма. Особенно у детей-атопиков: у них астма часто начинается либо с ринита, либо одновременно с ним. Да и основа у обоих заболеваний одна и та же — IgE-опосредованное воспаление слизистой оболочки верхних (при аллергическом рините) и нижних (при бронхиальной астме) дыхательных путей.

События при этом развиваются по следующему сценарию.

Начинается все со встречи Т-лимфоцитов и антиген-представляющих клеток. Встречаясь, они вступают во взаимодействие. Их взаимодействие, стимулируя образование интерлейкина-4 и одновременно подавляя секрецию -интерферона, тем самым вынуждает Ig-M-несущие клетки переключиться на синтез IgE. В то же время под действием интерлейкина-4 усиливается продуцирование низкоаффинного рецептора IgE — молекулы CD23.

Словом, дисрегуляция секреции интерлейкина-4 играет ключевую роль в развитии аллергопатологии. Подтверждение тому — корреляция повышенного уровня интерлейкина-4 в дыхательных путях астматиков с уровнем гиперреактивности и эозинофилии мокроты. (Видимо, интерлейкин, меняя состояние молекул адгезии на эндотелиальных клетках легких, способствует привлечению эозонофилов в дыхательные пути.)

Если говорить о γ-интерфероне, то снижение его уровня приводит к замедлению пролиферации клеток-хелперов и, как следствие, активизации воспалительного процесса. Системное же содержание обоих цитокинов в сыворотке крови у астматиков и больных ринитом отражает течение заболевания: обострение болезни сопровождается дисбалансом в содержании интерлейкина и интерферона. Повышение системного уровня IgE у таких больных наблюдается далеко не всегда. И это неудивительно, поскольку IgE синтезируется в основном плазматическими клетками, локализованными в слизистых оболочках дыхательных путей. Обычно повышенное содержание IgE определяется в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, назальном секрете или индуцированной мокроте. По логике вещей он должен присутствовать и в конденсате выдыхаемого воздуха. Это ученые поняли давно. Но обнаружить IgE, впрочем, как интерлейкин-4 и γ-интерферон, не могли, пока российские специалисты с целью повышения чувствительности определения этих соединений не разработали специальную методику подготовки конденсата.

Полезную информацию можно извлечь не только из биохимических или иммунологических показателей. Биофизические параметры конденсата — модуль вязкоэластичности (ВЭэ), поверхностное натяжение (ПНэ) и время релаксации экспирата (ВРэ) — тоже представляют определенную ценность. Подтверждение тому — результаты изучения этих параметров методом анализа формы осесимметричных капель с помощью канадского компьютерного аппарата ADSA-Toronto у больных с системной красной волчанкой и разной степени активности заболевания.

Основываясь на полученных данных, исследователи пришли к заключению, что высокое поверхностное натяжение (т. е. более 55 мН/м) может свидетельствовать о наличии бронхоконстрикции, а низкий модуль вязкоэластичности (т. е. менее 30 мН/м) — о развитии легочной гипертензии.

При системной красной волчанке без поражения легких и плевры первый показатель увеличивается, а второй, наоборот, уменьшается по сравнению с нормой. При возникновении люпус-пневмонита и люпус-плеврита изменения модуля вязкоэластичности усиливаются и к ним присоединяются изменения времени релаксации экспирата (таблица). По предположению исследователей, снижение модуля ВЭэ (менее 43 мН/м) и ВРэ (менее 247 с) указывает на уже имеющуюся патологию органов дыхания или на возможность ее развития.

Что касается изучения биофизических параметров конденсата у пациентов с различными клинико-лабораторными вариантами поражения почек, то здесь тоже удалось обнаружить немало интересного.

Хотя бы то, что, несмотря на выявленную корреляцию биофизических параметров с показателями азотовыделительной функции почек, поверхностного натяжения с уровнем креатинемии и модуля вязкоэластичности с содержанием в крови креатинина, мочевины и оксипуринола, наличие или отсутствие почечной недостаточности на биофизических параметрах практически не сказывается (таблица). Тем не менее исследователи не исключают возможности изменения обоих параметров на терминальной стадии почечной недостаточности, когда в конденсате регистрируется высокий уровень небелковых азотистых продуктов. Но это лишь предположение, поскольку подобных больных среди обследованных не нашлось.

Таблица. Биофизические параметры конденсата выдыхаемого воздуха у больных с системной красной волчанкой и у здоровых лиц (Н. М. Степанова «Межфазная тензиометрия и реометрия конденсата выдыхаемого воздуха у больных с системной красной волчанкой в процессе лечения»)

Вместе с тем им удалось показать, что системной красной волчанке без поражения почек свойственно повышение поверхностного натяжения при одновременном снижении модуля вязкоэластичности экспирата и что развитие люпус-нефрита сопровождается уменьшением времени релаксации, а присоединение нефротического синдрома влечет за собой дальнейшее падение ВРэ на фоне увеличения модуля ВЭэ.

Исходя из этого, исследователи выдвинули гипотезу, согласно которой низкие значения времени релаксации (менее 247 с) могут служить дополнительным критерием вовлечения в патологический процесс почек, а увеличение модуля вязкоэластичности (более 38 нМ/м) в сочетании с уменьшением времени релаксации (менее 187 с) — указывать на развитие нефротического синдрома.

Выдвинутые предположения, конечно же, нуждаются в дополнительной проверке. Но то, что традиционное патогенетическое лечение системной красной волчанки абсолютно не влияет на биофизические параметры конденсата, факт доказанный.

Некоторые показатели конденсата выдыхаемого воздуха можно использовать в качестве диагностических и прогностических критериев в перинатологии и неонатологии — утверждают исследователи.

Для выявления гипоксии плода они предлагают проводить определение жирнокислотного состава конденсата альвеолярной влаги беременной женщины, чтобы затем использовать эти данные для расчета коэффициента гипоксии плода или, проще говоря, отношения суммы жирных кислот с четным числом атомов углерода к сумме жирных кислот с нечетным числом атомов углерода. У новорожденных они рекомендуют определять количество выдыхаемых продуктов перекисного окисления липидов, поскольку по их данным при бронхолегочной патологии содержание продуктов липопероксидации в выдыхаемом воздухе увеличивается. Причем степень накопления продуктов перекисного окисления липидов может служить дифференциально-диагностическим критерием воспалительных заболеваний бронхолегочной системы и респираторного дистресс-синдрома.

И что немаловажно: «попутно» исследователям удалось получить убедительные доказательства неблагоприятного влияния продленной искусственной вентиляции легких на свободно-радикальный и жирнокислотный статус ребенка, максимально проявляющегося с пятых, иногда — с седьмых суток респираторной терапии.

Поиски неинвазивных методов диагностики хеликобактериоза для российских ученых закончились разработкой газоанализатора выдыхаемого воздуха, позволяющего определять показатель инфицированности пациента Helicobacter pylory.

Принцип действия газоанализатора основан на определении продукции аммиака до и после приема нагрузки — водного раствора карбамида нормального изотопного состава.

Среди достоинств предлагаемого прибора нельзя не упомянуть звуковую и визуальную индикацию последовательности операций с пробой и пациентом, математическую обработку данных в режиме реального времени и, конечно, схему защиты системы пробоотвода, благодаря которой значительно повышается надежность и точность измерений, поскольку соединительный капилляр остается практически чистым, даже в случае повышенной влажности выдыхаемого воздуха или загрязнения его слюной. Высокую точность диагностирования обеспечивает и учет базального уровня концентрации газа, зависящий от индивидуальных особенностей пациента: кислотности желудка, объема легких, курения, употребления алкоголя и демографических признаков.

Само обследование проводится в один этап и занимает не более десяти минут.

(Для сравнения. Обследование с помощью дыхательного «Хелик-Тест» проводится в два этапа и длится в среднем четырнадцать минут. К тому же, судя по результатам сравнительного анализа, газоанализатор, разработанный российскими специалистами, обеспечивает более высокую точность диагностирования.)

источник

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.25) на тему: Новые биомаркеры — среднелетучие метаболиты в конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких

Автореферат диссертации по медицине на тему Новые биомаркеры — среднелетучие метаболиты в конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких

Анохина Татьяна Николаевна

НОВЫЕ БИОМАРКЕРЫ — СРЕДНЕЛЕТУЧИЕ МЕТАБОЛИТЫ В КОНДЕНСАТЕ ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ И ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт пульмонологии» Федерального медико-биологического агентства России

доктор медицинских наук, профессор Баранова Ирина Александровна доктор медицинских наук, профессор Белобородова Наталья Владимировна

Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «07» марта 2012 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г.Москва, ул. 11-я Парковая, д. 32)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г.Москва, ул. 11-я Парковая, д. 32)

Автореферат разослан «01» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) относятся к социально значимым заболеваниям, распространенность которых неуклонно растет [Чучалин А.Г., 2007]. Согласно прогнозу ВОЗ, до 2020 года ожидается дальнейший рост числа больных БА и ХОБЛ [Murray C.J., 1996; Чучалин А.Г., 2004], что обусловлено высокой распространенностью табакокурения [GATS, 2009], загрязнением окружающей среды [Боев В.М., 1999; Delfino R.J., 2002] и повторяющимися инфекциями респираторного тракта [Rubin B.K. et al., 2011].

Многие ученые справедливо предполагают, что имеющиеся официальные статистические данные не отражают истинной распространенности БА и ХОБЛ, которая в действительности значительно выше. По всей видимости, это обусловлено недостаточным выявлением БА и ХОБЛ среди населения. Гиподиагностика БА и ХОБЛ является международной проблемой [Черняк Б.А., 2008; Patel S.P., 2008; Hill К. et al., 2010].

Не менее актуальной является проблема дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ. В соответствии с международными консенсусами диагноз БА и ХОБЛ основан на наличии характерных симптомов и изменении функции внешнего дыхания [Rabe K.F. et al., 2007; Bateman E.D. et al., 2008]. Однако сходные клинические проявления могут быть отмечены при обоих заболеваниях [Guerra S., 2005; Decramer М. et al., 2005], а обратимая бронхиальная обструкция определяется не только у пациентов с БА, но и у больных ХОБЛ [Fabbri L.M. et al., 2003; Richter D.C. et al., 2008]. Дифференциальная диагностика БА и ХОБЛ чрезвычайно важна из-за различий в показателях заболеваемости и смертности, в клиническом исходе, подходах к терапии. Традиционные методы обследования не всегда позволяют отличить пациентов с БА и ХОБЛ. Особенно диагностика затруднена в период обострения заболевания, когда проведение провокационных тестов противопоказано.

Большие надежды в медицинской диагностике различных заболеваний связывают с анализом уже известных и поиском новых биомаркеров. К биомаркерам относятся биологические молекулы, которые содержатся в различных биологических жидкостях (кровь, моча, цереброспинальная жидкость и др.), в тканях и являются признаком нормального или патологического процесса в организме. Новыми и интенсивно развивающими направлениями современной науки являются постгеномные технологии: геномика, протеомика, транскриптомика, метаболомика [Nicholson J.K., 2006; Вельков В.В., 2007]. Метаболомика имеет преимущества перед другими технологиями в отношении медицинской диагностики, выявлении биомаркеров заболеваний, так как профиль метаболитов является наиболее информативной характеристикой фенотипа и

отражает физиологические и патофизиологические процессы, протекающие в организме, инициируемые как внутренними, так и внешними факторами [Beecher C.W.W., 2003; DettmerK., 2007].

Идеальным биологическим образцом для анализа метаболизма в легких может служить конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ). Известно, что КВВ отражает состав жидкости, покрывающей нижние дыхательные пути, которая содержит как летучие, так и нелетучие вещества [Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002]. Анализ КВВ позволяет получать углубленные представления о состоянии метаболических процессов в нижних отделах респираторного тракта и их роли в патогенезе легочных заболеваний [Хасина М.А. и соавт., 2008]. Сбор КВВ не оказывает влияния на состав получаемого образца и функцию легких, с легкостью воспроизводим у детей и пациентов с тяжелой ДН [Horvath I. et al., 2005; Borrill Z.L. et al., 2008]. Низкие концентрации веществ в КВВ долгое время ограничивали применение этого метода в медицинской практике. Прогресс масс-спектрометрической техники позволил определять сотни тысяч различных химических соединений в КВВ в ультранизких концентрациях [Moser В. et al., 2005].

Разные механизмы воспалительного процесса при БА и ХОБЛ приводят к продукции различных метаболитов, которые могут быть определены в выдыхаемом воздухе и КВВ методами аналитической химии. Это создает предпосылки для использования этих методов в диагностике и поиске новых биомаркеров обструктивных заболеваний. Предполагают, что анализ среднелетучих органических соединений (СлОС), сконцентрированных в КВВ, может лучше отражать состав эндогенных выдыхаемых органических соединений по сравнению с анализом выдыхаемого воздуха [Родионов A.A. и соавт., 2007].

Исследовать возможность применения анализа среднелетучих метаболитов в КВВ для диагностики БА и ХОБЛ.

1. Определить среднелетучие метаболиты, содержащиеся в КВВ, и сравнить их состав и содержание у здоровых добровольцев, больных БА и ХОБЛ.

2. Изучить взаимосвязи различных среднелетучих метаболитов в КВВ с клиническими и функциональными показателями у больных БА и ХОБЛ.

3. Выявить среднелетучие метаболиты в КВВ, которые могут быть потенциальными биомаркерами БА и ХОБЛ.

4. Оценить возможность применения анализа профилей среднелетучих метаболитов в

КВВ для диагностики БА и ХОБЛ.

В представленной работе впервые:

— В КВВ здоровых добровольцев, больных БА и ХОБЛ обнаружены в ультранизкой концентрации 0.1-10 ррЬ экзогенные и эндогенные среднелетучие метаболиты, относящие к различным классам органических химических соединений: насыщенные жирные кислоты (НЖК), эфиры спирты, кетоны, фенолы, углеводороды.

— Выявлены изменения содержания среднелетучих метаболитов в КВВ при обструктивной патологии легких: снижение содержания пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты в КВВ при БА и повышение содержания хинолина в КВВ при ХОБЛ по сравнению со здоровыми добровольцами.

— Выявлены различия качественного и количественного состава среднелетучих метаболитов в КВВ при патологии легких: при БА по сравнению с ХОБЛ снижено содержание тексанола, чаще встречается ундециловая кислота, 2-феноксиэтанол и реже -деканол.

— Установлено, что у больных ХОБЛ экспрессия НЖК в КВВ коррелирует с клиническими симптомами (суммарным баллом шкалы симптомов по Paggiaro Р.Ь., 1998; одышкой по шкале МЯС), физикальными данными (ЧДД, ЧСС), показателями газообмена (рСОг, НСОз» артериальной крови), СДЛА и имеет обратную взаимосвязь с ЭрОг, ФЖЕЛ.

— Выявлено, что у больных БА экспрессия НЖК в КВВ обратно взаимосвязана с показателями ФВД (ОФВ), ФЖЕЛ и индексом Тиффно).

— Установлено, что распознавание здоровых, больных БА и ХОБЛ по профилю среднелетучих метаболитов в КВВ возможно с точностью 75-83%.

— Выявлены среднелетучие метаболиты (инданон, деканол, этил цитрат, 2-феноксиэтанол, Б2, 83, Э5, 57, 59), которые являются потенциальными биомаркерами БА и ХОБЛ.

— Разработан математический метод дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ, основанный на анализе профилей среднелетучих метаболитов в КВВ.

Исследование профиля среднелетучих метаболитов в КВВ — неинвазивный метод оценки состояния метаболических процессов в дыхательных путях в норме и при патологии легких.

Использование среднелетучих метаболитов в КВВ в качестве вспомогательных диагностических критериев БА и ХОБЛ позволит более точно проводить диагностику этих заболеваний и своевременно назначить патогенетическую терапию.

Полученные данные о взаимосвязи содержания среднелетучих метаболитов в КВВ с показателями ФВД можно использовать для оценки нарушений вентиляционной функции легких у пациентов, которые не могут выполнить форсированные дыхательные маневры.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Патологический процесс в дыхательных путях при БА и ХОБЛ сопровождается изменением в КВВ состава и содержания среднелетучих метаболитов, которые можно отнести к новым биомаркерам этих заболеваний.

2. Экспрессия среднелетучих метаболитов в КВВ связана с клиническими симптомами и функциональными показателями у больных БА и ХОБЛ.

3. Анализ профилей среднелетучих метаболитов в КВВ и использование линейных методов теории распознавания образов позволяют проводить дифференциальную диагностику БА и ХОБЛ.

Связь работы с научными программами

Исследование выполнено в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (номер государственной регистрации темы 01201168288).

Внедрение в практику здравоохранения

Исследование профилей среднелетучих метаболитов в КВВ внедрено в качестве дополнительного метода диагностики БА и ХОБЛ в пульмонологическом и аллергологическом отделениях ГБУЗ «ГКБ № 57 ДЗМ» г. Москвы. Материалы исследования включены в лекционный курс кафедры пульмонологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития (бывший РГМУ).

Основные положения диссертационной работы, материалы исследования были представлены и всесторонне обсуждены на:

— XVII, XIX Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Казань, 2007; Москва, 2009), работа была удостоена первого места на конкурсе «Молодых ученых» (Москва, 2009);

— XVIII, XIX, XX, XXI ежегодных конгрессах Европейского респираторного общества (Берлин, 2008; Вена, 2009; Барселона, 2010; Амстердам, 2011);

— 51-м конгрессе Германского общества пульмонологов (Ганновер, 2010);

— I, II, III Научно-практической конференции «Актуальные вопросы респираторной медицины» (Москва, 2009-2011);

— совместной научной конференции ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России и МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2010);

— совместном заседании Ученого совета ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития (Москва, январь 2012).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста. Состоит из введения, глав обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Иллюстрирована 10 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 27 отечественных и 158 зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал исследования.

В одномоментном поперечном исследовании приняли участие 70 человек в возрасте 19-75 лет, в том числе 20 больных с БА, 20 — с ХОБЛ и 30 здоровых добровольцев.

— больные обоего пола в возрасте от 18 до 75 лет;

— подтвержденный диагноз БА [в соответствии с критериями GINA, 2007];

— подтвержденный диагноз ХОБЛII и III стадии [критерии GOLD, 2008];

— длительность заболевания более 5 лет;

— наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании.

— туберкулез и другие заболевания легких, кроме БА и ХОБЛ;

— хронические инфекционные заболевания верхних дыхательных путей (гаймориты и другие);

— тяжелые сопутствующие заболевания сердечно-сосудистой системы, органов пищеварения, мочеполовой и нервной системы;

— постоянный прием системных глюкокортикостероидов;

— злоупотребление алкоголем, прием наркотиков;

— беременность и кормление грудью;

— отказ от участия в исследовании.

Больные БА и ХОБЛ находились на стационарном лечении в аллергологическом и пульмонологическом отделениях городской клинической больницы №57 г. Москвы в связи с обострением заболевания, а также наблюдались амбулаторно в ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России.

Все пациенты с БА имели анамнестически сенсибилизацию к бытовым, эпидермальным и пыльцевым аллергенам. Больные БА амбулаторно получали базисную терапию (ингаляционные ГКС, бета2-симпатомиметики длительного действия) и бронхолитики короткого действия в режиме по потребности.

Пациенты с ХОБЛ на амбулаторном этапе получали базисную терапию (М-холинолитики и бета2-симпатомиметики длительного действия), бронхолитики короткого действия в режиме по потребности. 11 больных ХОБЛ (55%) получали ингаляционные ГКС (в составе комбинированного препарата) в средних и высоких дозах.

Группу сравнения составили 30 здоровых некурящих добровольца (13 мужчин и 17 женщин) в возрасте от 19 до 63 лет (средний возраст 25,4±9,6 лет) с нормальными показателями функции легких, у которых в анамнезе отсутствовали указания на атопию, хронические заболевания легких и острые респираторные симптомы в течение последних 2-х месяцев.

Общеклиническое обследование включало в себя изучение жалоб, анамнеза жизни и заболевания, оценку физикальных данных, методы лабораторного и инструментального

обследования (общий и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, общий анализ мокроты, ЭКГ, рентгенографию органов грудной клетки).

Оценку клинических симптомов при БА (кашель, мокрота, одышка, хрипы) проводили однократно по 4-х балльной шкале (0 — отсутствие симптома, 3 — максимальное проявление симптома). Также оценивали число приступов удушья и потребность в симпатомиметиках короткого действия.

Оценку контроля БА проводили с использованием «АСТ-теста» (Asthma Control Test), включающего 5 вопросов, ответы на которые представлены в виде пятибалльной оценочной шкалы. Результатом теста является сумма ответов в баллах, значение теста менее 20 баллов соответствует неконтролируемому течению БА.

Оценку клинических симптомов при ХОБЛ проводили с помощью модифицированной шкалы симптомов больных ХОБЛ (Paggiaro P.L., 1998), основанной на взвешенной балльной оценке одышки, кашля, продукции мокроты и цвета мокроты.

Количественную оценку одышки у больных БА и ХОБЛ проводили по шкале Medical Research Council Dyspnea Scale (MRC), в которой 0 баллов — одышка не беспокоит, за исключением очень интенсивной нагрузки; 4 балла — одышка при минимальной физической активности [Mahler et al., 1985].

Исследование функции внешнего дыхания (ФВД) проводили с помощью прибора Master Screen Spiro фирмы «Erich JAEGER» (Германия) в соответствии с рекомендациями Европейского респираторного общества (ERS). Определяли общепринятые показатели легочной вентиляции, статические и динамические объемы. Оценивали объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ0, форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), ОФВ1/ФЖЕЛ (модифицированный индекс Тиффно), прирост ОФВ1 на ингаляцию 400 мкг сальбутамола. Полученные результаты сопоставляли с должными величинами, вычисленными по формулам, предложенным консенсусом ERS и ATS [Miller M.R. et al., 2005], а их интерпретацию осуществляли с использованием методических рекомендаций [Чучалин А.Г., 2009]. Пиковую скорость выдоха (ПСВ) оценивали пикфлоуметром Personal Best (Respironics, США).

Транскутанное измерение насыщения гемоглобина артериальной крови проводили при помощи портативного пульсоксиметра Опух 9500 (Nonin Medical Inc., США).

Неинвазивную оценку гемодинамики проводили методом допплер-эхокардиографии на ультразвуковых анализаторах Logic-S6 (General Electric, США). Оценивалось систолическое давление (СДЛА) в a. Pulmonalis в мм рт.ст.

КВВ всем обследуемым собирали однократно, пациентам с БА и ХОБЛ в первый-второй день поступления в стационар. Для сбора КВВ использовали аппарат EcoScreen (Erich JAEGER, Германия), снабженный клапанной системой, которая позволяет осуществлять вдох из окружающей атмосферы, а выдох — в устройство с конденсатором паров выдыхаемого воздуха, то есть клапан не позволяет смешиваться вдыхаемому и выдыхаемому воздуху. Метод основывается на так называемом принципе противотока. Вещества охлаждаются приблизительно до -10 °С.

Сбор КВВ проводили в утренние часы после двукратного ополаскивания ротовой полости водой. КВВ собирали в течение 10 минут в сидячем положении при спокойном дыхании обследуемого. Для исключения носового дыхания использовали специальные зажимы для носа. С целью стандартизации сбора КВВ применяли прибор Eco Vent (Erich JAEGER, Германия), который позволяет контролировать такие показатели, как время, объем выдыхаемого воздуха, частоту дыхания, пиковую скорость выдоха, минутную вентиляцию, жизненную емкость легких во время процедуры. Измеряли объем собранного конденсата и немедленно помещали его в герметичные сухие термоустойчивые ДНК- и РНК-очищенные стерильные полипропиленовые одноразовые пробирки типа Эппендорф (Scientific Specialties Inc., США) объемом 1,7 мл. Пробирки с материалом немедленно замораживались в морозильнике при температуре -70 °С. Собранные образцы хранились при данной температуре до проведения анализов сроком не более 1 месяца.

Уровень pH КВВ измеряли немедленно после получения образца с помощью ф32 рН-метра (Весктап, США) со стеклянным микроэлектродом. Для анализа требовалось 0,3 мл КВВ. Предварительно калибровали прибор стандартными растворами с pH 4,00; 7,00 и 10,00. Измерение pH каждого образца КВВ проводили четырехкратно. Из полученных значений вычисляли среднюю величину pH образца КВВ.

Определение среднелетучих органических соединений (метаболитов) в КВВ.

Определение профилей СлОС в КВВ у обследуемых проводили в лаборатории концентрирования кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (руководитель группы хроматомасс-спектрометрии — д.х.н., профессор И.А. Ревельского).

С этой целью был разработан способ определения СлОС различной полярности на ультраследовом уровне в КВВ. Данный метод основан на жидкостной экстракции определяемых веществ, их сорбционном концентрировании вне аналитической системы из экстракта объёмом 100 мкл, термодесорбции и анализе концентрата методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии (ГХ-МС). Схема определения СлОС в КВВ представлена на (рис. 1).

Сорбционное концентрирование 100 мнл экстракта в гкло№ ^ паро газовой смеси

Концентрат аналогов на сорбенте

Ввод концентрата тер^одесорбцией гриз00″ С винкектор хроматографа

Рис 1. Схема проведения эксперимента по анализу образцов КВВ.

Образцы КВВ насыщали хлоридом натрия, затем проводили экстракцию с использованием органического растворителя (метилтретбутиловый эфир). Концентрирование части экстракта объемом 100 мкл проводили на сорбенте Тепах GC (2 мг) и сверхтонком кварцевом волокне (около 1 мг). Сорбент располагался в кварцевом лайнере, через который пропускали поток азота со скоростью 100 мл/мин и подавали экстракт со скоростью 25 мкл/мин. Перенос концентрата аналитов с сорбента в инжектор хроматографа проводили путем термодесорбции при 300 °С в течение 3 мин в по td ie гелия. Разделение проводили на хроматографе Trace GC ultra (Thermo Electron сотр.), детектирование — на масс-спектрометре Trace DSQ (Thermo Electron corp.). Для разделения использовали среднеполярную капиллярную колонку RTX-200MS (Restek corp.) длиной 30 м, диаметром 0.32 мм, с неподвижной фазой толщиной 0.25 мкм на основе трифторпропилметилполисилоксана. Температура инжектора хроматографа составляла 250 °С. Выдерживали температуру колонки на уровне 35 °С в течение 5 мин,

затем термостат хроматографа нагревали от 35 °С до 250 °С со скоростью 57мин. Газ носитель — гелий. Сканирование проводили в диапазоне масс от 35 до 350 а.е.м. в режиме электронной ионизации. Идентификацию СлОС в КВВ проводили путем сравнения с масс-спектрами веществ из библиотеки NIST/EPA/NM Mass Spectral Library 2005.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 for Windows (StatSoft, Inc., США). Признаки, имеющие нормальное распределение, представлены как M±SD, где М — среднее арифметическое, SD — стандартное отклонение. При установлении непараметрического распределения признаков, данные представлены как Me (25%-75%), где Me — медиана, 25%-75% — интерквартильный размах (значения 25-го и 75-го процентилей, соответственно). Достоверность различий одноименных показателей между двумя независимыми группами определяли при помощи t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. Различия считались статистически достоверными при р 0,05).

Уровень рН КВВ у больных с обострением БА и ХОБЛ был достоверно ниже, чем у здоровых добровольцев и составил 6,04±0,39 и 6,15±0,40, напротив 6,99±0,26; р Рфе„ол;

источник

Диагностическая значимость цитокинового профиля конденсата выдыхаемого воздуха у пациентов с бронхиальной астмой

Дугарова Ирина Далаевна

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ КОНДЕНСАТА ВЫДЫХАЕМОГО

ВОЗДУХА У ПАЦИЕНТОВ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14.01.25 – пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва — 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт пульмонологии» Федерального медико-биологического агентства России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Анаев Эльдар Хусеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Осипова Галина Леонидовна

ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России

доктор медицинских наук, профессор Ненашева Наталия Михайловна

Российская медицинская академия последипломного образования

Ведущая организация:

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Защита состоится «……..» ……………………… 2010 г. в.……. часов
на заседании диссертационного совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32)

Автореферат разослан «……..» ……………………… 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Анаев Э.Х.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма (БА) является глобальной проблемой мирового здравоохранения. Люди всех возрастов во всем мире страдают этим хроническим заболеванием, и в случае тяжелого неконтролируемого течения эта болезнь ограничивает и значительно ухудшает качество жизни человека и подчас заканчивается летальным исходом. Эта болезнь приводит к потере трудоспособности и снижает участие пациента в жизни семьи [GINA, 2006].

Несмотря на большое число исследований, начиная от эпидемиологических и заканчивая изучением тонких механизмов реализации болезни на молекулярном уровне, в понимании БА, её течении, механизмах развития и подходах к лечению, существует много неясностей и противоречий, что заставляет продолжать исследования в данной области [Чучалин А.Г., 2007].

В настоящее время наибольшее значение для диагностики БА имеют клинические и функциональные тесты. Однако симптомы болезни не всегда отражают природу и степень выраженности воспаления, о чем свидетельствуют слабовыраженные взаимосвязи между значениями функциональных тестов и маркеров воспаления [Robroeks C.M. et al., 2007].

БА является комплексным хроническим воспалительным заболеванием с вовлечением многих структурных клеток и клеток воспаления, с высвобождением медиаторов воспаления, которые приводят к формированию основных патофизиологических механизмов заболевания [Barnes P.J., 1996]. На данный момент известно около 50 цитокинов и хемокинов, играющих важную роль в патогенезе БА [Barnes P.J., 2007], однако их роль в управлении патофизиологическими процессами до конца не изучена.

Исследование маркеров воспаления в легких обычно осуществляется при использовании метода индуцированной мокроты [Berlyne G.S. et al., 2000; Hargreave F.E., 2007], бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), бронхобиопсий [Adelroth E., 1998], а также сыворотки крови и мочи для оценки системных эффектов. Однако получение БАЛ и бронхобиоптатов являются инвазивными, травматичными методами, вызывающими множественные побочные эффекты, вследствие чего не могут проводиться через короткий промежуток времени, а также у тяжелых больных, детей и в амбулаторной практике [Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002].

В последние годы в клиническую практику широко внедряются неинвазивные методы диагностики и контроля лечения БА, в частности исследование биомаркеров в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) [Horvath I. et al., 2005]. Анализ КВВ позволяет оценить активность воспаления в легких и уточнить состояние местного воспаления в дыхательных путях, а также оценить роль цитокинов в нем. Однако работы, посвященные изучению концентраций цитокинов, как ключевого звена воспаления при БА, носят единичный, разрозненный, не систематизированный и дискуссионный характер.

Цель исследования:

Изучить значение цитокинов атопии (ИЛ-4, ИЛ-13), провоспалительных (ИЛ-6, ФНО-), противовоспалительного (интерферон-) и хемокина (ИЛ-8) в КВВ и сыворотке крови, установить взаимосвязь между концентрацией цитокинов и клинико-функциональными показателями у больных БА среднетяжелого течения в разные фазы течения заболевания.

Задачи исследования:

1. Определить содержание различных цитокинов в КВВ и сыворотке крови у здоровых субъектов и больных БА в период обострения и ремиссии.
2. Установить диагностическую значимость концентрации цитокинов в КВВ для оценки активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА.
3. Провести сравнительную оценку концентраций цитокинов в КВВ и сыворотке крови у больных БА в разные периоды заболевания.
4. Изучить взаимосвязь уровня цитокинов с клинико-функциональными показателями БА в разные периоды течения заболевания.

Научная новизна

В представленной работе впервые:

• проведено определение цитокинового профиля КВВ у пациентов со среднетяжелым течением БА в разные фазы течения заболевания;
• показано, что частота определения различных интерлейкинов, ИФН- и ФНО- в КВВ выше, чем в сыворотке крови;
• полученные значения неинвазивных маркеров определяют степень активности местного воспаления в дыхательных путях при БА;
• показано, что высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ свидетельствует о степени тяжести обострения заболевания;
• установлено, что обострение при БА проявляется воспалительным отеком в слизистой оболочке стенки бронхов и гиперсекрецией слизи, о чем свидетельствует достоверное увеличение объема КВВ и снижение его рН;
• выявленная высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ у пациентов с атопической БА указывает на наличие фенотипа заболевания с преобладанием Th2-типа иммунного ответа;
• обнаружена обратная корреляционная взаимосвязь между уровнем ИЛ-4 в КВВ со степенью бронхиальной обструкции в фазе обострения БА;
• выявлена прямая взаимосвязь между содержанием ИЛ-13 в КВВ с показателями функции внешнего дыхания (ФВД) у пациентов с БА в период ремиссии, что свидетельствует о персистирующем характере воспаления в дыхательных путях;
• обнаружена прямая корреляционная зависимость между эозинофилией крови и коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН- в КВВ, что отражает взаимосвязь системной реакции организма с активностью местного воспаления.

Практическая значимость

1. Анализ цитокинов в КВВ следует использовать в качестве неинвазивного метода оценки активности воспалительного процесса в дыхательных путях при БА.
2. Определение концентрации различных интерлейкинов, ИФН- и ФНО- в КВВ позволяет оценить эффективность проводимого лечения.
3. Исследование цитокинов в КВВ, отражающих природу и особенности местного воспаления, позволяет корректировать дальнейшую тактику ведения пациентов с БА.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Анализ цитокинового профиля (различных интерлейкинов, ИФН- и ФНО-) КВВ более четко отражает активность местного воспалительного ответа в дыхательных путях при БА, чем исследование сыворотки крови.
2. Высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ у пациентов с обострением БА, а также их взаимосвязь с легочной функцией указывает на преобладание Th2-типа иммунного ответа и персистирующий воспалительный процесс в дыхательных путях при ремиссии заболевания.
3. Выявленная прямая зависимость между эозинофилией крови и коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН- в КВВ указывает на взаимосвязь системной реакции организма с местным воспалением.

Внедрение в практику здравоохранения

Исследование цитокинов в КВВ внедрено в качестве дополнительного метода диагностики у больных БА в аллергологическом отделении ГКБ №57 г.Москвы. Материалы исследования включены в лекционный курс на кафедре пульмонологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

— 17-м, 19-м Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Казань, 2007; Москва, 2009);

— Научной сессии НИИ пульмонологии Росздрава (Рязань, 2007);

— 3-ей международной научной конференции (Улан-Удэ, 2008);

— Ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Берлин, 2008);

— Ежегодном конгрессе Германского общества пульмонологов (Маннхайм, 2009);

— Совместном заседании Ученого совета ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 23.06.2010.).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в журнале, входящем в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста. Состоит из введения, глав обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Иллюстрирована 15 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель включает 21 отечественных и 143 зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общее количество пациентов, участвовавших в исследовании, составило 28 больных БА и 14 здоровых добровольцев.

Обязательными клиническими и функциональными критериями для включения в исследование были: больные обоего пола в возрасте от 18 до 60 лет; пациенты с подтвержденным диагнозом БА среднетяжелого течения [в соответствии с критериями GINA, 2006]; наличие атопии в анамнезе, подтвержденной кожными пробами (prick-test) и повышением уровня общего иммуноглобулина Е (IgЕ) сыворотки крови; длительность заболевания более 2-х лет; базисная терапия ингаляционными глюкокортикоидами (ГК) в дозе 1000 мкг (в пересчете на беклометазон); обратимая обструкция дыхательных путей (КБДОФВ112% от должного и 200 мл); наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании.

наличие ХОБЛ, туберкулеза и других заболеваний легких, в т.ч. пневмония в течение последних 6 месяцев; тяжелые сопутствующие заболевания сердечно-сосудистой системы, органов пищеварения, мочеполовой и нервной системы; прием системных ГК; курение (ИКЧ 10 пачка/лет); злоупотребление алкоголем и наркотиками в анамнезе; хронические инфекционные заболевания верхних дыхательных путей (гаймориты и другие); беременность и кормление грудью.

В исследование было включено 28 больных БА средней степени тяжести заболевания (диагноз подтвержден данными анамнеза, клинической картиной, рентгенологическими, функциональными методами диагностики), из них 14 пациентов в стадии обострения средней тяжести и 14 — в стадии стабильного течения заболевания. Контрольную группу составили 14 человек – здоровые добровольцы (ИКЧ 5 пачка/лет), не страдающие аллергическими и хроническими, в т.ч. бронхолегочными заболеваниями.

Пациенты в стадии обострения находились на стационарном лечении в аллергологическом отделении ГКБ №57 с 2006 по 2009 год, остальные пациенты наблюдались амбулаторно в ФГУ НИИ пульмонологии.

Характеристика больных БА и здоровых добровольцев, включенных в исследование, представлена в табл. 1.

Характеристика больных БА, включенных в исследование.

Во время первой инкубации антиген цитокина (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13) связывается с иммобилизованными в лунках антителами одним сайтом связывания. После промывки добавляются вторые биотилированные моноклональные антитела против антигена (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13). Во время второй инкубации эти антитела связываются с иммобилизованным антигеном (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13), захваченным во время первой инкубации. После удаления избытка вторых антител добавляется стрептавидин-пероксидаза, которая связывается с биотилированными антителами с формированием сэндвич-комплекса из 4-х реагентов. После третьей инкубации и промывки удаляется несвязавшийся фермент, после чего добавляется субстратный раствор, который взаимодействует с ферментом с образованием цветного комплекса. Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации цитокина (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13), присутствующего в образце. Оптическая плотность содержимого ячеек определялась с использованием автоматического фотометра для микропланшетов при длине волны 450 нм. Концентрация цитокинов определялась по калибровочной кривой «оптическая плотность/концентрация», используя данные по концентрациям стандартов.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 for Windows. Все численные данные представлены как mean±SD. Достоверность различий одноименных показателей внутри одной группы определяли при помощи парного t-критерия. Различия считались статистически достоверными при p 0,05).

Уровень рН КВВ у больных с обострением и ремиссией БА был достоверно ниже, чем у здоровых добровольцев (6,12±0,47 и 6,41±0,49 напротив 6,99±0,36; p 0,05).

Повышение провоспалительной группы цитокинов при БА описано и в других работах. Так, при измерении цитокинов в сыворотке крови у пациентов с БА обнаружены более высокие значения, в частности ИЛ-6, у пациентов с тяжелым течением БА по сравнению со среднетяжелым течением заболевания [Дюсембаева Н.К. и др., 2006]. Это объясняется провоспалительными свойствами цитокинов, в частности, они способны активировать воспалительный процесс путем воздействия на провоспалительные факторы транскрипции, которые отвечают за запуск воспалительного процесса.

Взаимосвязь ИЛ-6 с воспалительным процессом описывается и в ряде других работ. Повышенный уровень ИЛ-6 в назальных смывах был обнаружен у детей, перенесших риновирусную инфекцию (Zhou Y. et al., 2001). Другими исследователями продемонстрировано повышение концентрации ИЛ-6 в КВВ у женщин с гормональным вариантом БА [Carpagnano G.E. et al., 2009].

ИЛ-8 не удалось определить ни в одном образце КВВ. В сыворотке крови ИЛ-8 определили в стадии обострения у 4 больных, в стадии ремиссии — у 4 пациентов, в группе контроля — у 3 человек. По своим свойствам ИЛ-8 относится к группе хемокинов. Было показано, что ИЛ-8 вызывает активацию и хемотаксис лейкоцитов [Teran L.M. et al., 1996]. Также было обнаружено, что ИЛ-8 в индуцированной мокроте удается определить лишь у больных с тяжелым течением БА. Этот факт объясняет, почему мы не смогли определить ИЛ-8 в КВВ у больных атопической формой БА среднетяжелого течения. Связь повышенного уровня ИЛ-8 и содержания нейтрофилов в индуцированной мокроте у пациентов с тяжелым течением БА описывает ряд исследователей, объясняя это наличием персистирующей вирусной инфекции у данной категории больных [Shannon J. et al., 2008].

Концентрация ФНО- в КВВ у больных БА в стадии обострения составила 4,35±2,14 пг/мл, в фазе ремиссии — 4,06±1,18 пг/мл, а в группе здорового контроля — 3,80±1,45 пг/мл (p>0,05). Уровень ФНО- в сыворотке крови в группе обострения составил 3,19±2,94 пг/мл, в группе ремиссии — 2,61±2,13 пг/мл и 3,09±2,01 пг/мл — в группе здоровых добровольцев. Однако различия были незначимыми.

ФНО-, как и ИЛ-6, относится к провоспалительной группе цитокинов. Согласно имеющимся данным, ФНО- повышает гиперреактивность дыхательных путей и число нейтрофилов в индуцированной мокроте [Yates D.H. et al., 1993]. Также были получены сильные корреляционные взаимосвязи между содержанием ФНО- и трансформирующего фактора роста- (TGF-) в КВВ с концентрацией метахолина при проведении провокационного теста и недельным разбросом значений пиковой скорости выдоха (ПСВ) [Matsunaga K. et al., 2007]. Роль ФНО- в развитии бронхообструктивных нарушений была подтверждена в исследовании с использованием антител к рецептору ФНО- у больных с тяжелой БА. На фоне лечения этим препаратом отмечалась положительная динамика, в т.ч. снижение гиперреактивности бронхов [Hanania N., 2010].

Концентрация ИФН- в КВВ была ниже у пациентов с обострением БА, но разница была недостоверной. Данный маркер относится к группе Th1-цитокинов. Исследования показали, что он способен снижать аллергический тип воспаления, уменьшая эозинофилию и явления гиперреактивности дыхательных путей. При анализе цитокинового профиля у детей с БА установлено достоверное снижение содержания ИФН- в КВВ [Shahid S.K. et al., 2002]. Также снижение уровня ИФН- в сыворотке крови обнаружено у пациентов с тяжелым течением БА [Hamzaoui A. et al., 2009]. Это подтверждает подавление Th1-иммунного ответа и преобладание аллергического механизма воспаления при БА.

С целью оценки баланса Th1- к Th2-типу воспалительной реакции в патогенезе БА проводили определение соотношения ИЛ-4 к ИФН- в КВВ. У пациентов с БА этот коэффициент был выше, чем у здоровых, однако разница была незначимой.

В работе Shahid et al. (2002) показан дисбаланс между Th2- и Th1-ответом при БА, о чем свидетельствовало достоверное повышение уровня ИЛ-4 и коэффициента соотношения ИЛ-4/ИФН-, а также снижение концентрации ИФН- в КВВ у детей с БА по сравнению с группой здорового контроля. Другие исследователи продемонстрировали, что коэффициент ИЛ-4/ИФН- был повышен в группе больных БА по сравнению с больными атопическим дерматитом, и его уровень снижался на фоне терапии ГК [Brunetti L. et al., 2008]. Таким образом, с помощью данного коэффициента можно оценивать эффективность проводимого лечения.

источник