Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии Литвин Лолиана Стефановна
480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Литвин Лолиана Стефановна. Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии : диссертация . кандидата медицинских наук : 14.00.36 / Литвин Лолиана Стефановна; [Место защиты: ГП «ГНЦ «Институт иммунологии»»].- Москва, 2007.- 138 с.: ил.
Глава 1 Обзор литературы 10
Экспериментальные модели бронхиальной астмы (БА) у животных 10
Моделирование бронхиальной астмы у мышей 17
Краткосрочные модели БА 22
Долгосрочные модели БА 24
1.3 Практическое применение моделей БА на мышах 29
Изучение патогенеза БА 29
Использование моделей БА на мышах для доклинических исследований фармакологических препаратов 33
Изучение механизмов аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) и исследование новых форм лечебных аллергенов 35
Глава 2 Материалы и методы 40
Аллергены и основные реагенты, использованные в работе 40
Способы и схемы иммунизации животных 41
Определение аллерген-специфического IgE методом пассивной кожной анафилаксии 47
Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) 47
Оценка системной анафилаксии у мышей с экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмой (ЭБА) и после экспериментальной АСИТ (ЭАСИТ) 48
Гистологическое исследование легких, клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей при моделировании ЭБА 49
Исследование клеточного состава периферической крови 49
Методика забора и оценки клеточного состава БАЛ у мышей 49
Гистологическое исследование легких 50
2.8 Методика оценки дыхательной функции мышей на введение
неспецифического и специфического раздражителей 51
Установка для регистрации пневмограмм у мышей 51
Регистрация пневмограмм 55
2.9 Методы статистической обработки 56
Глава 3 Результаты собственных исследований 58
Оценка различных схем иммунизации ОА при моделировании аллергического воспаления в дыхательных путях мышей 58
Сравнение иммунологических и морфологических показателей при моделировании аллергического ответа в дыхательных путях мышей линии BALB/c и гибридов (СВА х C57BL/6)F1 60
Характеристика разработанной модели ЭБА у мышей 61
Динамика образования аллерген-специфических IgE антител 61
Оценка уровней суммарных аллерген-специфических IgG антител 63
Оценка реакции системной анафилаксии у мышей 64
Оценка клеточного состава периферической крови 66
Оценка клеточного состава БАЛ 68
Гистологическое исследование легких 73
Оценка неспецифической и специфической реактивности бронхов 82
3.4 Оценка ЭАСИТ модельным аллергеном овальбумином (ОА), химически
модифицированным сукцинилированием (сОА) и сОА в комплексе с
иммуномодулятором полиоксидонием (ПО) 90
Сравнительная оценка уровней аллерген-специфических IgE- и IgG-антител до, в течение и после ЭАСИТ 90
Сравнительная оценка клеточного состава периферической крови и БАЛ у мышей после ЭАСИТ 95
Сравнительная оценка морфологической картины легких у мышей после ЭАСИТ 100
Анализ пневмограмм мышей различных групп после ЭАСИТ 106
Сравнительная оценка выраженности системной анафилаксии у мышей после ЭАСИТ . ПО
Глава 4 Обсуждение полученных результатов 112
Перечень условных сокращений:
АСИТ — аллерген-специфическая иммунотерапия
БАЛ — бронхо-альвеолярный лаваж
БСА — бычий сывороточный альбумин
ГР — гиперреактивность бронхов
ГІДА — гомоцитотропные антитела
ИФА — иммуноферментный анализ
ПКА — пассивная кожная анафилаксия
сОА — сукцинилированный овальбумин
ТФР-р — трансформирующий фактор роста (3
ФСБ — фосфатно-солевой буфер
ЭАСИТ — экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия
ЭБА — экспериментальная IgE-зависимая бронхиальная астма
Бронхиальная астма (БА) является наиболее распространенным во всем мире хроническим заболеванием, представляющим значительную социальную проблему, как для детей, так и для взрослых. Очевидно, что за последние 20 лет распространенность этого заболевания заметно возросла, особенно среди детей [49]. По данным эпидемиологического исследования, проведенного в России, общее число больных БА приближается к 7 млн. человек [7]. В номенклатуре, представленной Европейской Академией Аллергологии и Клинической иммунологии, выделяют аллергическую (IgE-зависимая и не IgE-зависимая) и не аллергическую Б А [71]. В большинстве случаев, особенно у детей и молодых людей, развитие БА связано с IgE-опосредованными (атопическнми) механизмами [30]. Участие атопических механизмов доказано у 40% больных БА [114]. Представление о БА как о хроническом воспалительном заболевании дыхательных путей стало важным достижением и определило направление поиска терапевтических подходов для профилактики и контроля воспалительного процесса при БА. Несмотря на широкое применение различных противоастматических и противоаллергических фармакологических препаратов, отмечается повсеместный рост числа больных страдающих этим заболеванием, а также отмечается устойчивая тенденция к увеличению числа больных с тяжелыми формами БА [7].
На современном этапе медицинской науки значительная часть знаний о механизмах лежащих в основе того или иного заболевания получены с использованием экспериментальных моделей, адекватных различным заболеваниям человека. Исследования in vivo, также являются начальным и основополагающим этапом в изучении безопасности и эффективности новых лечебных препаратов. К настоящему времени, по данным зарубежной литературы, уже описаны протоколы индукции моделей бронхиальной астмы у животных, в частности у линейных мышей [17,42]. Большинство протоколов индукции IgE-зависимой бронхиальной астмы предполагает использование
адъювантов. Преимущественное использование мышей для моделирования бронхиальной астмы связано с большим разнообразием реагентов для изучения генетических и иммунных механизмов развития заболевания. Мыши могут быть сенсибилизированы к различным видам аллергенов и развивать аллерген-индуцированное воспаление в дыхательных путях, а также бронхиальную гиперреактивность. Существуют определенные сходства между параметрами моделей аллергической бронхиальной астмы мышей и характеристиками бронхиальной астмы человека, заключающиеся в морфологических изменениях дыхательных путей и ткани легких, в характере антительного ответа, а также участвующих в развитии и поддержании аллергического воспаления эффекторных клеток и молекул [25]. Анализ отечественной научно-практической литературы привел к заключению об отсутствии данных о разработке и использовании для доклинических исследований адекватной модели аллергической (IgE-зависимой) бронхиальной астмы у мышей. Поэтому, разработка экспериментальной модели бронхиальной астмы является актуальной и перспективной в нашей стране.
Разработка модели БА на мышах позволит в дальнейшем изучать механизмы, приводящие к развитию заболевания, оценивать безопасность и эффективность новых лечебных препаратов перспективных для лечения и профилактики БА.
Единственным к настоящему времени методом терапии аллергических
заболеваний атопической природы, воздействующего на все патогенетически
значимые звенья аллергического процесса и обладающего длительным
противоаллергическим эффектом, является аллерген-специфическая
иммунотерапия (АСИТ) [92]. В настоящее время разрабатываются и внедряются не только новые способы ее проведения, но и новые формы лечебных аллергенов. Такие аллергены должны обладать сниженной аллергенной и сохраненной иммуногенной активностью [4]. Это может быть достигнуто модификацией аллергенов, в том числе химической, а также использованием разнообразных природных и синтетических носителей — адъювантов [2,10,64].
Очевидно, что для доклинического изучения свойств гипоаллергенных вакцин и их терапевтической эффективности целесообразно использовать модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей. Проведение доклинических исследований новых форм аллергенов на модели ЭБА с использованием принципа АСИТ может всесторонне охарактеризовать влияние аллерговакцины на манифестацию и течение IgE-зависимой БА.
Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей и оценить возможность ее применения для доклинических исследований новых подходов к АСИТ.
Разработать схему моделирования IgE-зависимой БА у мышей путем введения модельного аллергена овальбумина (ОА) без использования адъюванта;
Изучить динамику накопления аллерген-специфических IgE- и IgG-антител в ходе моделирования ЭБА;
Провести оценку клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей с ЭБА;
Провести гистологическое исследование легких у мышей с ЭБА;
Оценить бронхиальную реактивность у мышей с ЭБА;
Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей с ЭБА;
Провести сравнительную ЭАСИТ ^модифицированным, модифицированным (сукцинилированием) аллергеном и комплексом модифицированного аллергена с полиоксидонием на модели ЭБА;
Изучить динамику накопления аллерген-специфических IgE- и IgG-антител в ходе и позавершении ЭАСИТ;
Провести оценку клеточного состава БАЛ и периферической крови у мышей после ЭАСИТ;
10. Провести гистологическое исследование легких у мышей после ЭАСИТ;
11.Оценить бронхиальную реактивность у мышей после ЭАСИТ;
12.Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у
мышей после ЭАСИТ. Научная новизна работы:
Впервые в России разработана и охарактеризована краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей без использования адъюванта.
Впервые в России проведено исследование дыхательной функции мышей в ответ на введение неспецифического раздражителя метахолина.
Впервые на модели IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей проведена экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия химически модифицированным аллергеном.
Показано преимущество ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и иммуномодулятора полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном. Практическая значимость:
Разработанная краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей позволит оценивать безопасность и эффективность новых форм лечебных аллергенов и фармакологических препаратов, перспективных для профилактики и лечения IgE-зависимых заболеваний, в частности атопической бронхиальной астмы.
Экспериментальная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы также может быть использована для изучения патогенетических механизмов лежащих в основе развития этого заболевания.
источник
Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему: Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии
Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии
Литвин Лолиана Стефановна
Разработка модели экспериментальной 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии.
14.00.36 — аллергология и иммунология
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»
Научный руководитель: кандидат медицинских наук М.Р, Хаитов
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидзе Ведущая организация: Российский государственный
медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Защита диссертации состоится «АУ 2007 г в часов на
заседании диссертационного совета Д 208.017 01 в Государственном научном центре Институте иммунологии Федерального медико-биологического агентства по адресу 115478, г Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2 Факс (495)117-10-27
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра Института иммунологии Федерального медико-биологического агентства
доктор медицинских наук Л.С. Сеславина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Бронхиальная астма (БА) является наиболее распространенным во всем мире хроническим заболеванием, представляющим значительную социальную проблему, как для детей, так и для взрослых Очевидно, что за последние 20 лет распространенность этого заболевания заметно возросла, особенно среди детей [G1NA, 2006] По данным эпидемиологического исследования, проведенного в России, общее число больных БА приближается к 7 млн человек [Княжеская Н П , 2002] В номенклатуре, представленной Европейской Академией Аллергологии и Клинической иммунологии, выделяют аллергическую (lgE-зависимая и не lgE-зависимая) и не аллергическую формы бронхиальной астмы [Johansson, 2002] В большинстве случаев, особенно у детей и молодых людей, развитие бронхиальной астмы связано с lgE-опосредованными (атопическими) механизмами [Bukantz et al ,1993] Участие атопических механизмов доказано у 40% больных БА [Реагсе et al ,1999]. Представление о БА как о хроническом воспалительном заболевании дыхательных путей стало важным достижением и определило направление поиска терапевтических подходов для контроля воспалительного процесса при БА Несмотря на широкое применение различных фармакологических препаратов для терапии БА, отмечается повсеместный рост числа больных страдающих этим заболеванием, а также отмечается устойчивая тенденция к увеличению числа больных с тяжелыми формами БА [Княжеская Н П , 2002] В связи с этим актуальность проблемы бронхиальной астмы для научных и клинических исследований очевидна
На современном этапе медицинской науки значительная часть знаний о механизмах, лежащих в основе того или иного заболевания, получены с использованием экспериментальных моделей на животных, адекватных различным заболеваниям человека Исследования in vivo, также являются начальным и основополагающим этапом доклинического изучения безопасности и эффективности новых лечебных препаратов
К настоящему времени, по данным зарубежной литературы, существуют протоколы воспроизведения моделей бронхиальной астмы у животных, в частности у линейных мышей [Epstein et al, 2004, Adkinson et al, 2003] Боль-
шинство протоколов индукции модели экспериментальной igE-зависимой бронхиальной астмы (ЭБА) предполагают применение адъювантов Преимущественное использование мышей для моделирования БА связано с большим разнообразием реагентов для изучения генетических и иммунных механизмов развития заболевания Мыши могут быть сенсибилизированы к различным аллергенам и развивать аллерген — индуцированное воспаление в дыхательных путях, а также бронхиальную гиперреактивность Существуют определенные сходства между параметрами модели бронхиальной астмы у мышей и характеристиками бронхиальной астмы человека, заключающиеся в морфологических изменениях дыхательных путей и ткани легких, в характере антительного ответа, а также участвующих в развитии и поддержании аллергического воспаления эффекторных клеток и молекул [Воусе et а!, 2005]. Анализ отечественной научно-практической литературы привел к заключению об отсутствии данных о разработке в России и использовании для доклинических исследований адекватной модели IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей Поэтому, разработка ЗБА является актуальной и перспективной в нашей стране
Разработка модели IgE-зависимой бронхиальной астмы на мышах позволит в дальнейшем изучать, механизмы, приводящие к развитию заболевания, оценивать безопасность и эффективность новых лечебных препаратов, перспективных для лечения и профилактики заболевания
Единственным к настоящему времени методом терапии аллергических заболеваний атопической природы, воздействующего на все патогенетически значимые звенья аллергического процесса и обладающего длительным противоаллергическим эффектом, является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ) [Mailing et al, 2004] В настоящее время разрабатываются, и внедряются не только новые способы ее проведения, но и новые формы лечебных аллергенов Такие аллергены должны обладать сниженной аллергенной и сохраненной иммуногенной активностью [Гущин И С ,1998]. Это может быть достигнуто модификацией аллергенов, в том числе химической, а также использованием разнообразных природных и синтетических носителей-адъювантов [Бабахин А А, 2004, Петров Р В , 2001, Horner et al, 2001]
Очевидно, что для доклинического изучения свойств новых аллерговак-цин и их терапевтической эффективности целесообразно использовать модель 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы у мышей Проведение доклинических исследований новых форм лечебных аллергенов на модели ЭБА с использованием принципа АСИТ поможет всесторонне охарактеризовать влияние аллерговакцины на манифестацию и течения 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы
Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную модель 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы у мышей и оценить возможности ее применения для доклинических исследований новых подходов к АСИТ Задачи исследования:
1 Разработать схему моделирования ЭБА у мышей путем введения модельного аллергена овальбумина (ОА) без использования адъюванта,
2 Изучить динамику накопления аллерген-специфических 1дЕ- и 1дв- антител в ходе моделирования ЭБА,
3 Провести оценку клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАП) и периферической крови у мышей с ЭБА,
4 Провести гистологическое исследование легких у мышей с ЭБА,
5 Оценить бронхиальную реактивность у мышей с ЭБА,
6 Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей с ЭБА,
7 Провести сравнительную экспериментальную АСИТ (ЭАСИТ) немоди-фицированным, модифицированным (сукцинилированием) аллергеном и комплексом модифицированного аллергена с иммуномодулятором полиоксидонием на модели ЭБА,
8 Изучить динамику накопления аллерген-специфических 1дЕ- и 1дЭ- антител в ходе и по завершении ЭАСИТ,
9 Провести оценку клеточного состава БАЛ и периферической крови у мышей после ЭАСИТ,
10 Провести гистологическое исследование легких у мышей после ЭАСИТ,
11 Оценить бронхиальную реактивность у мышей после ЭАСИТ,
12. Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей после ЭАСИТ Научная новизна:
Впервые в России разработана и охарактеризована краткосрочная модель экспериментальной lgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей без использования адъюванта
Впервые в России проведено исследование дыхательной функции мышей в ответ на введение неспецифического раздражителя метахолина
Впервые на модели lgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей, проведена экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия химически модифицированным аллергеном
Показано преимущество ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и иммуномодулятора полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном
Практическая значимость: Практическая значимость настоящего исследования заключается в разработке краткосрочной модели lgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей, которая позволит оценивать безопасность и эффективность новых форм лечебных аллергенов и фармакологических препаратов, перспективных для профилактики и лечения lgE-зависимых аллергических заболеваний, в частности, атопической бронхиальной астмы
Экспериментальная модель lgE-зависимой бронхиальной астмы, может быть использована для изучения патогенетических механизмов лежащих в основе развития этого заболевания
Апробация работы: Результаты исследований докладывались на конкурсе научных работ молодых специалистов Института иммунологии 2005 года *, на ежегодном съезде Американской Академии Аллергологии, Астмы и Иммунологии (Сан Диего, США, 23-27февраля 2007г.), на XXVI конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (Готеборг, Швеция, 9-13 июня 2007г), на VIII конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, Россия, 27-29 июня 2007г)
*научная работа заняла Н-е — место
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 работ Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами, 43 рисунками и фотографиями Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов Список литературы включает 154 источника (15 отечественных, 139 зарубежных)
Материалы и методы исследований Собственные экспериментальные данные получены на 250 мышах линии ВА1.В/С и мышах гибридах (СВА х С57В1_/6)Р1, обоих полов, весом 18-20г Животные поступали из питомника «Столбовая» ГУНЦБМТ РАМН Для постановки реакции пассивной кожной анафилаксии использовали беспородных белых крыс-самцов весом 250-300г, полученных из питомника РОНЦ РАМН Вся работа с животными проводилась в соответствии с «Положением об этическом отношении к лабораторным животным», согласно приказу директора ГНЦ Институт иммунологии от 07 07 2003 и приказа МЗ РФ от 19 06 2003 №267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации»
Для индукции ЭБА, проведения ЭАСИТ, а также проведения диагностических манипуляций использовали следующие методы введения аллергенов и препаратов внутрибрюшинное (в/б), интраназальное (и/н), аэрозольное, подкожное (п/к), внутривенное (в/в) Проведение иммунизации проводилось с соблюдением правил асептики и антисептики 1.1. Схема краткосрочной модели ЭБА
В пяти независимых экспериментах для моделирования ЭБА использовали мышей самок линии ВА1_В/с весом 18-20 гр Мыши были разделены на 3 группы (п=5) экспериментальная, контроль сенсибилизации, биологический контроль В качестве модельного аллергена использовали овальбумин (ОА, вщта) Моделирование ЭБА осуществляли путем в/б введений ОА (1 Омкг на мышь) в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) Курс в/б введений ОА составлял, 7 дней (одна инъекция в день) Через неделю мышам вводили и/н по 50 мкп ОА (концентрация ОА 10 мг/мл, доза 500 мкг/мышь), ежедневно в течение 8 дней
Мышей из группы контроль сенсибилизации, сенсибилизировали по схеме опытных групп Через неделю мышам вводили и/н по 50 мкл физиологического раствора, ежедневно в течение 8 дней Животным из группы биологического контроля в аналогичных условиях опыта в том же объеме вводили физиологический раствор Кровь от мышей всех групп забирали из ретроор-битального синуса на 8, 14 и 24 день от начала сенсибилизации Пуловые и индивидуальные сыворотки хранили в холодильнике при -50 °С до использования
Уровни гомоцитотропных анти-ОА 1дЕ антител (анти-ОА ГЦА) в пуловых сыворотках крови и суммарных анти-ОА 1дв антител (АТ) в индивидуальных и пуловых сыворотках определяли методами пассивной кожной анафилаксии и иммуноферментного анализа Пневмографию у мышей вышеуказанных групп осуществляли через 24 часа после завершения и/н аппликаций аллергена Забор легких для гистологического исследования, бронхо-альвеолярного ла-важа (БАЛ), получение мазков крови в каждой группе мышей проводили через 48 часов после завершения и/н введений ОА 1.2.Схема ЭАСИТ на модели ЭБА
В двух независимых экспериментах, для оценки эффективности ЭАСИТ на модели ЭБА, проводилась гипосенсибилизация нативным аллергеном (ОА), модифицированным сукцинилированием ОА (сОА) и сОА в комплексе с иммуномодулятором полиоксидонием (ПО) ЭАСИТ проводили в интервале между периодом сенсибилизации (в/б ОА) и серией и/н аппликаций ОА Мыши, сенсибилизированные по схеме ЭБА, были разделены на 5 групп (п=10) Животные 1 гр (контроль ЭБА) получали 16 п/к инъекций физиологического раствора Экспериментальные животные 2 гр получали 16 п/к инъекций раствора ОА в возрастающих дозах с 50 мкг/кг до 5×104 мкг/кг, мыши 3 гр получали 7 п/к инъекций сОА в интервале доз от 6×103 мкг/кг до 5×104 мкг/кг, мыши 4 гр получали 5 п/к инъекций сОА в интервале доз от 6×103 мкг/кг до 5×104 мкг/кг, причем три из них в виде комплекса сОА с иммуномодулятором полиоксидонием, однократная доза ПО 5×103 мкг/кг Мыши 5 гр (контроль адъюванта), получали п/к ПО, доза и количество инъекций как в группе 4 После ЭАСИТ мыши всех групп были подвергнуты серии и/н аппликаций ОА по схеме ЭБА
1.3. Определение аллерген-специфического IgE методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА)
Анти-ОА ГЦА в пуловых сыворотках крови определяли с помощью реакции ПКА ПКА воспроизводили описанным ранее методом [Ovary, 1977]
1.4. Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ
Исследование уровней аллерген-специфических IgG-AT в сыворотках крови мышей проводили с использованием стандартного протокола, разработанного Sigma Учет цветной ферментативной реакции производили с помощью спектрофотометра «Titertek Multiskan Plus» (Labsystems, Finland) 1 5 Оценка системной анафилаксии
Мышей BALB/c сенсибилизировали по схеме воспроизведения модели ЭБА, через 24 часа после последней и/н аппликации OA мышам вводили в/в OA в различных дозах (0,25мг/кг, 0,625 мг/кг,1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 25 мг/кг) Оценку выраженности системной анафилаксии у мышей BALB/c с ЭБА проводили с использованием бальной методики, предложенной [Rupa и Mine, 2006]
Шкала оценки симптомов анафилаксии у мышей в баллах: 0 — нет симптомов,1 — почесывание и отечность мордочки, легкий шок, включая замедленность движений, 2 — диарея, набухание рта, парез глаз, 3 — одышка, проблемы с дыханием,4 — тремор и конвульсии, 5 — смерть
1.6.Исследование клеточного состава периферической крови Приготовление мазков крови, их фиксация и окраска осуществлялась с
использованием техники подробно описанной в методическом руководстве [Кисели Д , 1962] Мазки окрашивали азуром и эозином по Романовскому, подсчитывали процентное соотношение клеток Клетки определяли и дифференцировали на мононуклеары (лимфоциты, моноциты), нейтрофилы и эозино-филы по стандартным морфологическим критериям. Подсчитывали 100 клеток в каждом микропрепарате Разрешение микроскопа 100 х1 5 х10
1.7. Методика забора и оценки клеточного состава БАЛ у мышей
После умерщвления эфиром, выделяли трахею, в средней трети трахеи делали разрез, через который вводили металлическую канюлю с тупым концом, фиксируя канюлю лигатурой С помощью одноразового шприца, присоединенного к канюле, в легкие вводили среду RPMI с добавлением 10% эм-
бриональной телячьей сыворотки (t°= 37°), в объеме 0,5 мл Шприцем отсасывали введенную в легкие жидкость, и переносили в отдельные стерильные пробирки («Eppendorf») Процедуру проводили дважды Общий объем полученного лаважа составлял 1мл. БАЛ от каждого животного, собранный в отдельные пробирки, центрифугировали при 150 g в течение 10 минут После центрифугирования осадок ресуспендировали. Общее количество клеток БАЛ подсчитывал ось в камере Горяева Для дифференцировки клеток БАЛ, готовили мазки на предметном стекле Мазки фиксировали в метаноле, окрашивали азуром и эозином по Романовскому и подсчитывали процентное соотношение клеток [Tanaka et аГ, 2002] Оценка клеточного состава БАЛ в препаратах производилась с использованием иммерсионной микроскопии Клетки определяли и дифференцировали на мононукпеары (лимфоциты, макрофаги), нейтрофилы и эозинофилы по стандартным морфологическим критериям Подсчитывали 200 клеток в каждом микропрепарате Разрешение микроскопа 100×1 5×10
1.8. Гистологическое исследование легких
Для гистологического анализа легкие фиксировали в 10% формалине Обезвоживание и проводку образцов, заливку в парафин проводили ручным способом Микротомирование парафиновых блоков для получения срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли с помощью ротационного микротома Reichert Jung Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, заключали в пихтовый бальзам под покровные стекла для получения постоянных микропрепаратов. Микроскопический анализ гистологических препаратов проводили на микроскопе Opton с разрешением 40×1,5×10.
Оценка состояния дыхательной функции мышей с ЭБА и контрольных групп проводилась с использованием пневмотахометрической установки, любезно предоставленной нам отделом токсикологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения Система регистрации сигналов основана на использовании акустического датчика (микрофона), помещенного в специальную камеру Датчик находился в контакте с телом животного в области проекции его брюшной стенки. Получаемый электрический сигнал уси-
ливался и подавался на самописец Датчиком являлся элекретный микрофон, обладающий достаточно высокой чувствительностью, его диапазон часто включал низкочастотную область, что обеспечивало регистрацию низкочастотных вибраций, характерных для работы дыхательной системы Пневмо-граммы регистрировали на бумажном носителе полиграфа, который подавался с постоянной скоростью (10мм/с) Подача бумажного носителя полиграфа с определенной скоростью до воздействий на мышь и после, позволяла сравнивать временные процессы регистрируемой пневмограммы в реальном масштабе Амплитуду и продолжительность дыхательных актов на пневмограмме оценивали с помощью метода усреднения значений за период анализа (60 сек) При этом для анализа выбирался интервал, в котором частота повторяемости амплитудного значения была не менее 95% О характере влияния на дыхательную функцию судили по отношению значений показателей до воздействия (А) к их значениям после воздействия (Б), выраженному в процентах. При этом за 100% принимались данные исходных измерений. Также производили оценку величины бронхоспазма (ВБ) для каждого животного в группе и среднее значение ВБ для группы ВБ = 100%- Ак0неч%. где Аконвч%-среднее значение амплитуды дыхательных актов выраженное в % Пневмограммы регистрировали до и после внутривенного введение возрастающих доз (50-100-200 мкг/кг) неспецифического раздражителя метахолина 1.10. Методы статистической обработки
Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М), стандартную ошибку среднего (±SEM) и стандартное отклонение среднего (±SD) в программе Microsoft Excel Для сравнения групп использовался дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису Для проведения последующего попарного сравнения групп, применялся U-критерий Манна-Уитни в программе Statistica 6,0 (Stat Soft Inc, США) Значения р 3гр>2гр
Наиболее выраженное уменьшение признаков аллергического воспаления было выявлено у мышей, подвергнутых ЭАСИТ комплексом модифицированного ОА и ПО
Оценка относительных показателей клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа в группах, подвергшихся ЭАСИТ, свидетельствовала в пользу достоверного снижения относительного числа эозинофилов Наиболее выраженное снижение достигалось в случае ЭАСИТ модифицированным аллергеном и иммуномодулятором полиоксидонием (р триВ4ннсго »падения ОА
Рис. 9. Выраженность системной анафилаксии (в баллах) у мышей ВАЬВ/с, >»■ -‘.л
ЭАСИТ после внутривенного введения ОА в дозе 0,625 мг/кг.
Можно заключить, что гипосенсибилизация с применением комплекса модифицированного аллергена и полиоксидония, достигалась в меньшие сроки, более выражено и при меньшей антигенной нагрузке. Представляется, что данный подход может быть использован для безопасной и эффективной АСИТ в клинической практике
1 Разработана краткосрочная модель 1дЕ-зависимой бронхиальной астмы у мышей линии ВАЬВ/с без использования адъюванта
2 Установлено достоверное увеличение количества эозинофилов в брон-хо-альвеолярном лаваже, периферической крови и в перибронхиальной ткани легких у мышей с ЭБА, характеризующее развитие аллергического воспаления в легких
3 Уровень аллерген-специфических 1дЕ-антител существенно повышался после интраназальных провокаций аллергеном Значительный уровень сенсибилизации при моделировании ЭБА подтверждался развитием системной анафилаксии на введение аллергена
4. С помощью пневмографии установлено, что у мышей с ЭБА развивалась неспецифическая бронхиальная гиперреактивность
5. Показано преимущество ЭАСИТ на модели ЭБА модифицированным аллергеном в комплексе с иммуномодулятором полиоксидонием по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифициро-ванным аллергеном
6 Установлено, что высокий уровень аллерген-специфических ¡дв-антител и снижение уровня аллерген-специфических 1дЕ-антител может быть достигнут меньшим количеством инъекций комплекса модифицированного аллергена и полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или не модифицированным аллергеном
7. Установлено, что у мышей, подвергнутых ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и полиоксидония, определялось наиболее выраженное снижение признаков аллергического воспаления в легких.
8 Установлено, что значительный уровень гипосенсибилизации после ЭАСИТ, подтвержденный снижением развития системной анафилаксии
на введение модельного аллергена, наблюдался во всех группах мышей, подвергнутых ЭАСИТ 9 Полученная модель ЭБА на мышах, может быть использована в доклинических исследованиях при оценке эффективности препаратов для профилактики и лечения бронхиальной астмы
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Khaitov M R , Litvin L S , Babakhin A A, Stecenco О N , Voronkova L N , Ivanova A S , Barsegyan G G. The evaluation of various schemes of ovalbumin administration in murine bronchial asthma modeling Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2005, suppl 1, p 80.
2 Litvin L S, Khaitov M R., Babakhin A.A, Stecenco О N , Voronkova L N , Ivanova A S Asthma modeling using BALB/c and (CBAxC57BL/6)F1 mice The Proceedings of EAACI2006 Congress, Vienna, p 203-204
3 Литвин Л С , Хаитов M P , Бабахин A A, Стеценко О H , Воронкова Л H , Иванова А С , Барсегян Г Г Разработка экспериментальной модели бронхиальной астмы Оценка различных способов иммунизации при моделировании экспериментального аллергического ответа Российский Аллергологический журнал, 2005, №1, с 35-42
4 Бабахин А А, Литвин Л С , Хаитов М.Р., Воронкова Л.Н., Стеценко О H , Иванова А.С., Барсегян Г Г Оценка различных способов иммунизации при моделировании атопической бронхиальной астмы у мышей Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (18-22 апреля 2005 г, Москва). M , 2005, с 735-736
5 Литвин Л С , Хаитов M Р , Бабахин А А Модели экспериментальной атопической бронхиальной астмы Патофизиология и экспериментальная терапия, 2006, №3, с 26-28
6. Литвин Л С , Хаитов M Р , Бабахин А А, Стеценко О H , Борзова Н.В, Иванова А С., Барсегян Г.Г Характеристика экспериментальной модели бронхиальной астмы, полученной без использования адъюванта. Аллергология и иммунология, 2007, т.8, №1, с 40
7. Babakhin A A., Litvin LS, Andreev SM, Stecenco ON, Voronkova L.N., Ivanova A S , Khaitov M.R , Barsegyan G G., DuBuske IV, DuBuske L M Allergen-specific immunotherapy using a highly modified allergen and the immunomodulator polyoxidonium in a murine model of allergic asthma Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, v 119, №1, s 59
8 Babakhin AA, Litvin LS, Stecenco ON, Voronkova L N, Borzova NV., Ivanova A S , Barsegyan G G , DuBuske L M , Khaitov M R Development and charactenzation of a short-term asthma model using BALB/c mice. J Allergy, 2007, v 62 (s 83), p.252-253
9 Babakhin A A, Litvin L S, Andreev S.M , Stecenco О N , Voronkova L N , Borzova N V, Ivanova A S , Khaitov M R , Barsegyan G G , DuBuske IV, DuBuske L M. Experimental desensitization using a modified allergen absorbed onto a synthetic Immunomodulator in a murine model of allergic asthma J Allergy, 2007, v 62 (s 83), p 252-253
10 Литвин Л .С., Бабахин A A, Стеценко O.H., Воронкова Л H , Борзова Н.В , Иванова А С , Барсегян Г Г, Хаитов М.Р Характеристика краткосрочной без-адьювантной модели lgE-зависимой бронхиальной астмы (БА) у мышей BALB/c ФИПИС, 2007, т 11, №5, с. 3-9
Подписано в печатьО О? г Формат 60×84/16 Тираж 100 экз Заказ 499 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им НН БлохинаРАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24
источник
Важность X-секретируемой фосфолипазы A2 группы в аллерген-индуцированном воспалении дыхательных путей и ремоделировании в модели астмы у мышей
КОРРЕСПОНДЕНЦИЯ Уильям Р. Хендерсон младший: joangb@u.washington.edu ИЛИ Майкл Х. Гелб: gelb@chem.washington.edu
Метаболиты арахидоновой кислоты, эйкозаноиды, являются ключевыми медиаторами воспаления дыхательных путей, вызванных аллергеном, и ремоделирования при астме. Доступность свободного арахидоната в клетках для последующего биосинтеза эйкозаноида контролируется фосфолипазой A2s (PLA2s), в первую очередь цитозольным PLA2-α. 10 секретируемых PLA2s (sPLA2s) также были идентифицированы, но их функция в генерации эйкозаноида плохо изучена. Мы исследовали роль группы X sPLA2 (sPLA2-X), sPLA2 с наивысшей активностью клеточного фосфолиполиза in vitro, в острой и хронической моделях астмы мыши in vivo. Легкие мышей sPLA2-X — / — по сравнению с мышами sPLA2-X + / + имели значительное снижение инфильтрации, вызванной овальбумином, с помощью CD4 + и CD8 + Т-клеток и эозинофилов, метаплазии кубических клеток, утолщения слоя гладких мышц, субэпителиальных фиброз и уровни Т-хелперных клеточных цитокинов типа 2 и эйкозаноидов. Эти данные направляют внимание на sPLA2-X как новую терапевтическую мишень для астмы.
Используемые сокращения: БАЛ, бронхоальвеолярный лаваж; cysLT, цистеинил лейкотриен; cPLA2-α, цитозольная группа IVA PLA2; EIA, иммуноферментный анализ; т.е. интраназальный; LTB4, LTC4, LTD4 и LTE4, лейкотриен B4, C4, D4 и E4 соответственно; МОХ, метоксим; PAS, периодическая кислота Schiff; PGD2 и PGE2, простагландин D2 и E2, соответственно; PLA2, фосфолипаза A2; RL, сопротивление легких; RT, в реальном времени; sPLA2, секретируемый PLA2; sPLA2-X, группа X sPLA2.
Возбуждение дыхательных путей, вызванное аллергеном при астме, характеризуется инфильтрацией дыхательных путей эозинофилом и CD4 + и CD8 + Т-клетками и сопровождается структурными изменениями дыхательных путей (т. Е. Ремоделированием дыхательных путей), включая метаплазию кубиков, увеличение массы гладких мышц и субэпителиальный фиброз от чрезмерного осаждения компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген и ламинин (обзор см. в ссылках 1, 2). Лейкотриены и простагландины представляют собой соответственно метаболиты 5-липоксигеназы и циклооксигеназы арахидоновой кислоты (то есть эйкозаноиды), которые важны для патогенеза астмы. Выделение 5-липоксигеназных продуктов лейкотриена В4 (LTB4), цистеиниловых лейкотриенов (cysLTs) C4, D4 и E4 и продуктов циклооксигеназы простагландина D2 (PGD2) и тромбоксана A2 из воспаленных дыхательных путей приводит к гиперреактивности дыхательных путей и обструкции воздушного потока гликопротеинами слизи. Данные из моделей на животных и пациентов с астмой свидетельствуют о том, что эти эйкозаноиды являются ключевыми молекулами, которые способствуют воспалению дыхательных путей в качестве мощных хемоаттрактантов для эозинофилов, Т-клеток и других воспалительных клеток; вызывают плазменную экстравазацию и отеки; модулировать функцию гладких мышечных клеток дыхательных путей; и индуцировать высвобождение внеклеточных матричных компонентов (3-5).
Доступность свободного арахидоната в клетках и, таким образом, биосинтез лейкотриенов и других эйкозаноидов, включая простагландины, жестко контролируется регулируемым действием фосфолипазы A2s (PLA2s), высвобождающей эту жирную кислоту путем гидролиза sn-2-эфира глицерофосфолипидов присутствуют в качестве основных компонентов клеточных мембран. Клетки млекопитающих содержат множественные типы PLA2 (6), но общепринято, что цитозольная группа IVA PLA2-α (cPLA2-α, также известная как группа IVA PLA2, PLA2G4A) играет ключевую роль в опосредованном агонистом высвобождении арахидоната для биосинтеза эйкозаноидов. Это основано на исследованиях с ингибиторами cPLA2-α (7-10) и cPLA2-α-дефицитными мышами (11-13). Геном млекопитающих также кодирует 10 секретируемых PLA2 (sPLA2s). Роль этих ферментов в биосинтезе эйкозаноидов гораздо менее ясна. Нарушение гена V sPLA2 группы (PLA2G5) у мышей приводит к
50% -ному снижению количества продуцирования LTC4 и PGE2 в стимулированных зимозаном перитонеальных макрофагах (14). Было показано, что группы IIA, V и X sPLA2 координируются с cPLA2-α, чтобы увеличить выделение арахидоната из культивируемых клеток (15-20), но механизм этого координатного действия между cPLA2-α и sPLA2 неизвестен.
Систематическое исследование межфазных кинетических и связывающих свойств полного набора мышиных и человеческих sPLA2 показывает, что группа X sPLA2 (sPLA2-X; PLA2G10) выделяется как имеющая наибольшую активность фосфолиполиза при добавлении в культивируемые клетки (21, 22) , Исходя из этих данных и того факта, что sPLA2-X экспрессируется в человеческих (23, 24) и мышечных легких (это исследование), мы исследовали возможную роль sPLA2-X в модели астмы мышей путем образования sPLA2-X-дефицитного мышь для изучения воспаления и ремоделирования, вызванного аллергеном. В этом первоначальном исследовании мы исследовали модель заболевания животных, а не эксперименты с одиночными клеточными типами in vitro, поскольку sPLA2-X является секретируемым ферментом и может эффективно действовать внеклеточно во многих, если не во всех, типах клеток млекопитающих, чтобы высвободить арахидоновую кислоту. Поэтому исследования с культивируемыми клетками млекопитающих не могут пролить свет на поведение sPLA2-X в тканях. Это другая ситуация, чем с cPLA2-α, которая действует в цитоплазме.
Мутацию гена sPLA2-X мыши осуществляли путем ретровирусной опосредованной инсерции канистры с экзоном-ловушкой (см. Материалы и методы). Анализ последовательности ДНК показал, что кассета для улавливания находится в интроне между экзонами 3 и 4 гена sPLA2-X. Анализ в реальном времени (RT) -PCR с использованием праймеров, гибридизующихся с экзонами 2 и 4 и кДНК, полученных из яичка яичка, толстой кишки и желудка, выявил
1000-кратное снижение уровней мРНК sPLA2-X в мышце sPLA2-X — / — однопометник дикого типа. Мы также искали белок sPLA2-X в экстрактах желудка, используя чувствительный иммуноферментный анализ с временным разрешением (25). Когда анализировали 24 мкг белка лизата желудка с помощью мыши sPLA2-X + / +, был обнаружен 0,2 нг белка sPLA2-X, тогда как белок sPLA2-X не был обнаружен, когда 34 мкг лизатного белка от мыши sPLA2-X — / — был использован.
Важное понимание механизмов хронического воспаления и ремоделирования при астме происходит от моделей животных, которые воспроизводят основные морфологические и физиологические особенности астмы человека. Чтобы изучить влияние дефицита sPLA2 in vivo на фенотип астмы, мы использовали OVA в качестве модельного аллергена для индуцирования аллерген-специфической легочной болезни у мышей дикого типа и sPLA2-X — / -. В протоколе острой бронхиальной астмы (3) мышам с ОВО, сенсибилизированным с четырьмя дозами показания ОВА, к 29-му дню, болезнь, поразительно похожая на аллергию, вызванную астмой человека, включая (а) циркулирующие уровни аллергена-специфического IgE; (b) заметный приток эозинофилов и Т-клеток в дыхательные пути; (c) повышенные уровни гликопротеинов слизи, цитокинов Th2 клеток (IL-4, IL-5 и IL-13) и лейкотриенов и других эйкозаноидов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL); и (d) гиперреактивность легких к метахолину по сравнению с контрольными мышами, обработанными физиологическим раствором. Когда интраназальные (in) OVA-вызовы периодически повторяются в протоколе хронической астмы (4, 26), к 76-му дню мышей имеют поразительные особенности ремоделирования дыхательных путей, включая (а) метаплазию кубических клеток, (б) увеличенный слой клеток гладкой мускулатуры масса и (в) обширное субэпителиальное осаждение коллагена и утолщение стенки дыхательных путей.
экспрессию sPLA2-X в легких и селезенку sPLA2-X — / — и мышей дикого типа в модели острой астмы изучали иммуноцитохимия. sPLA2-X экспрессировали в эпителии дыхательных путей в легких у мышей, обработанных физиологическим раствором, дикого типа, но не у sPLA2-X — / — мышей (фиг.1). После сенсибилизации и испытания OVA экспрессия sPLA2-X значительно увеличивалась в столбчатых клетках, выстилающих дыхательные пути мышей дикого типа, но оставалась необнаруженной у sPLA2-X — / — мышей (фиг.1 и фиг.5), доступной по адресу http: // www.jem.org/cgi/content/full/jem.20070029/DC1). Конфокальная иммунофлуоресцентная микроскопия продемонстрировала колокализацию sPLA2-X с эпителиальными клетками дыхательных путей, экспрессирующими гликопротеин муцина 5AC (рис.2). Макрофаги способствовали экспрессии sPLA2-X в дыхательных путях, поскольку альвеолярные макрофаги, выделенные из жидкостных клеток BAL из обработанных OVA мышей дикого типа (но не sPLA2-X — / — мышей), проявляли сильную реакционную способность для sPLA2-X иммуноцитохимией ( Рисунок 3). Семенные мононуклеарные клетки также экспрессировали sPLA2-X у мышей sPLA2-X + / +, но не у sPLA-X — / — мышей (рис. S2). Никакой реакции окрашивания для sPLA2-X не наблюдалось при проведении иммуноцитохимии с преиммунной сывороткой (фиг. S2).
Отсутствие экспрессии sPLA2-X в легких sPLA2-X — / — мышей. Лунную ткань получали на 29-й день (модель острой астмы) у мышей sPLA2-X + / + и sPLA2-X — / -, обработанных либо OVA, либо физиологическим раствором, и исследовали методом иммуноцитохимии для экспрессии sPLA2-X. Стрелки указывают на пероксидазоположительные клетки в дыхательных путях (AW), экспрессирующих sPLA2-X. Дополнительные участки дыхательных путей мышей sPLA2-X + / +, обработанных OVA, показаны на рисунке S1. Отсутствие экспрессии sPLA2-X в селезеночной ткани sPLA2-X — / — мышей показано на рисунке S2. Бары, 50 мкм.
Колокализация sPLA2-X с эпителиальными клетками дыхательных путей, экспрессирующими гликопротеин муцина 5AC у обработанных OVA диких мышей дикого типа. Красная флуорофора (Alexa Fluor 594) локализация sPLA2-X (слева), зеленая флуорофора (Alexa Fluor 488) локализация муцина 5AC (средняя) и колокализация sPLA2-X с муциновыми 5AC-позитивными эпителиальными клетками дыхательных путей (справа). Бар, 20 мкм.
sPLA2-X в альвеолярных макрофагах мышей дикого типа. Альвеолярные макрофаги выделяли на 29 день у мышей sPLA2-X + / + и sPLA2-X — / -, обработанных либо OVA, либо физиологическим раствором, и исследовали иммуноцитохимией для экспрессии sPLA2-X. Бар, 50 мкм.
На 29-й день, через 24 часа после финала. OVA у животных из каждой экспериментальной группы (т. Е. Острой модели астмы), был определен эффект дефицита sPLA2-X на воспаление и гиперреактивность, вызванную аллергеном. Обработанные OVA мыши sPLA2-X + / + имели шестикратное увеличение общих клеток, выделенных в жидкости БАЛ, по сравнению с контролем солевой группы (фиг.4а);
50% жидкостных клеток БАЛ были эозинофилами у обработанных OVA мышей sPLA2-X + / +. Общее количество воспалительных клеток и эозинофилов в жидкости БАЛ обработанных OVA sPLA2-X — / — мышей было значительно снижено по сравнению с контролем дикого типа (фиг.4а). Посредством световой микроскопии и морфометрии приток OOS-обработанных мышей sPLA2-X + / + при введении эозинофилов и мононуклеарных клеток в легкие вокруг дыхательных путей и кровеносных сосудов, метасклероз клеток кубиков в дыхательных путях и гиперсекреция слизи и интерстициальный отек наблюдались у мышей, (Фиг.4, b и c и рис. S3, см. Http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20070029/DC1). Это увеличение инфильтрации полных воспалительных клеток и эозинофилов, гиперсекреция кубических клеток и гиперсекреция слизи и отек интерстиция дыхательных путей были заметно снижены у мышей sPLA2-X — / -, обработанных OVA, по сравнению с мышами sPLA2-X + / + (фиг.4, b и c, и на фиг.53). Используя инвазивную плетизмографию для определения устойчивости к легким (RL), гиперреактивность дыхательных путей к аэрозолизированному метахолину была значительно увеличена у мышей дикого типа, обработанных ОВА, по сравнению с контролем солевого раствора (фиг.4d). Напротив, легочные реакции у мышей sPLA2-X — / — не были существенно различны между группами OVA и солевым лечением (фиг.4d). Реакция дыхательных путей in vivo на аэрозольный метахолин также определялась на 29-й день у сознательных, свободно движущихся, спонтанно дышащих мышей с использованием неинвазивной плетизмографии всего тела, и те же тенденции для значений Пена наблюдались как для инвазивных измерений RL (неопубликованные данные).
Нарушение воспаления дыхательных путей, вызванное аллергеном, и гиперреактивность у мышей sPLA2-X — / -. (а) жидкость БАЛ была получена в день 29 из обработанных физиологическим раствором (n = 5) и обработанных OVA (n = 9) мышей sPLA2-X + / + (+ / +) и обработанных солевым раствором (n = 7) и OVA (n = 8) sPLA2-X — / — мышей (- / -), и было определено количество полных клеток и процент и количество эозинофилов. (b) Продольные участки обработанных солевым раствором и OVA sPLA2-X + / + и sPLA2-X — / — мышей окрашивали гематоксилином и эозином. Стрелки указывают на воспалительные клетки. AW, дыхательные пути; BV, кровеносные сосуды. Бары, 100 мкм. (c) Интенсивность общего воспалительного клеточного инфильтрата (0-4 + шкала), количество эозинофилов на единицу площади (2200 мкм2) и отек дыхательных путей (0-4 + шкала) в легких на 29 день определяли по морфометрический анализ. (d) Гиперчувствительность к аллергену гиперчувствительности дыхательных путей была оценена с помощью инвазивной плетизмографии на 29 день у мышей дикого типа (+ / +) и sPLA2-X — / — (- / -) в качестве степени бронхоконстрикции в аэрозольный метахолин (0,1325 , 6,25, 12,5, 25 и 50 мг / мл). RL рассчитывали, как описано в Материалах и методах, и показаны как процент от исходного ответа на аэрозольный нормальный физиологический раствор. *, Р LTB4> PGD2. Метаболит 13,14-дигидро-15-кето-PGE2 составил 91% от общего уровня PGE2 у обработанных ОВА диких мышей дикого типа. Как определено методом жидкостной хроматографии-электрораспылительной тандемной масс-спектрометрии, дробное распределение LTC4, LTD4 и LTE4 было сходным в жидкости BAL из OVA- и обработанных физиологическим раствором мышей дикого типа, при этом LTE4 выделял преобладающий cysLT (то есть соответствующий Дробные распределения LTC4: LTD4: LTE4 у мышей, обработанных OVA- и солевым раствором, sPLA2-X + / + составляли 0,11: 0,26: 0,63 и 0,10: 0,25: 0,65 соответственно). Уровни PGD2, PGE2, LTB4 и cysLTs в жидкости BAL у мышей sPLA2-X — / — мышей, не вызывающих аллергенов, существенно не отличались от уровней контроля за физиологическим раствором (рис.9, a-d). Дробное распределение LTC4, LTD4 и LTE4 в БАЛ-среде мышей SPLA2-X — / — мышей, обработанных OVA- и солевым раствором, было таким же, как и для контролей дикого типа (0,11: 0,26: 0,63 для обработанных OVA sPLA2 -X — / — мышей и 0,10: 0,25: 0,65 для обработанных солевым раствором мышей sPLA2-X — / -). На 76-й день по сравнению с контролем солевого раствора (хроническая модель) продукты циклогеоксигеназы (PGE2) и 5-липоксигеназы (т.е. cysLTs) арахидоновой кислоты были существенно увеличены в жидкости БАЛ дикого типа, но не sPLA2-X- / — мышей после лечения ОВА (неопубликованные данные).
источник
Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии Литвин Лолиана Стефановна
480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Литвин Лолиана Стефановна. Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии : диссертация . кандидата медицинских наук : 14.00.36 / Литвин Лолиана Стефановна; [Место защиты: ГП «ГНЦ «Институт иммунологии»»].- Москва, 2007.- 138 с.: ил.
Глава 1 Обзор литературы 10
Экспериментальные модели бронхиальной астмы (БА) у животных 10
Моделирование бронхиальной астмы у мышей 17
Краткосрочные модели БА 22
Долгосрочные модели БА 24
1.3 Практическое применение моделей БА на мышах 29
Изучение патогенеза БА 29
Использование моделей БА на мышах для доклинических исследований фармакологических препаратов 33
Изучение механизмов аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) и исследование новых форм лечебных аллергенов 35
Глава 2 Материалы и методы 40
Аллергены и основные реагенты, использованные в работе 40
Способы и схемы иммунизации животных 41
Определение аллерген-специфического IgE методом пассивной кожной анафилаксии 47
Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) 47
Оценка системной анафилаксии у мышей с экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмой (ЭБА) и после экспериментальной АСИТ (ЭАСИТ) 48
Гистологическое исследование легких, клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей при моделировании ЭБА 49
Исследование клеточного состава периферической крови 49
Методика забора и оценки клеточного состава БАЛ у мышей 49
Гистологическое исследование легких 50
2.8 Методика оценки дыхательной функции мышей на введение
неспецифического и специфического раздражителей 51
Установка для регистрации пневмограмм у мышей 51
Регистрация пневмограмм 55
2.9 Методы статистической обработки 56
Глава 3 Результаты собственных исследований 58
Оценка различных схем иммунизации ОА при моделировании аллергического воспаления в дыхательных путях мышей 58
Сравнение иммунологических и морфологических показателей при моделировании аллергического ответа в дыхательных путях мышей линии BALB/c и гибридов (СВА х C57BL/6)F1 60
Характеристика разработанной модели ЭБА у мышей 61
Динамика образования аллерген-специфических IgE антител 61
Оценка уровней суммарных аллерген-специфических IgG антител 63
Оценка реакции системной анафилаксии у мышей 64
Оценка клеточного состава периферической крови 66
Оценка клеточного состава БАЛ 68
Гистологическое исследование легких 73
Оценка неспецифической и специфической реактивности бронхов 82
3.4 Оценка ЭАСИТ модельным аллергеном овальбумином (ОА), химически
модифицированным сукцинилированием (сОА) и сОА в комплексе с
иммуномодулятором полиоксидонием (ПО) 90
Сравнительная оценка уровней аллерген-специфических IgE- и IgG-антител до, в течение и после ЭАСИТ 90
Сравнительная оценка клеточного состава периферической крови и БАЛ у мышей после ЭАСИТ 95
Сравнительная оценка морфологической картины легких у мышей после ЭАСИТ 100
Анализ пневмограмм мышей различных групп после ЭАСИТ 106
Сравнительная оценка выраженности системной анафилаксии у мышей после ЭАСИТ . ПО
Глава 4 Обсуждение полученных результатов 112
Перечень условных сокращений:
АСИТ — аллерген-специфическая иммунотерапия
БАЛ — бронхо-альвеолярный лаваж
БСА — бычий сывороточный альбумин
ГР — гиперреактивность бронхов
ГІДА — гомоцитотропные антитела
ИФА — иммуноферментный анализ
ПКА — пассивная кожная анафилаксия
сОА — сукцинилированный овальбумин
ТФР-р — трансформирующий фактор роста (3
ФСБ — фосфатно-солевой буфер
ЭАСИТ — экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия
ЭБА — экспериментальная IgE-зависимая бронхиальная астма
Бронхиальная астма (БА) является наиболее распространенным во всем мире хроническим заболеванием, представляющим значительную социальную проблему, как для детей, так и для взрослых. Очевидно, что за последние 20 лет распространенность этого заболевания заметно возросла, особенно среди детей [49]. По данным эпидемиологического исследования, проведенного в России, общее число больных БА приближается к 7 млн. человек [7]. В номенклатуре, представленной Европейской Академией Аллергологии и Клинической иммунологии, выделяют аллергическую (IgE-зависимая и не IgE-зависимая) и не аллергическую Б А [71]. В большинстве случаев, особенно у детей и молодых людей, развитие БА связано с IgE-опосредованными (атопическнми) механизмами [30]. Участие атопических механизмов доказано у 40% больных БА [114]. Представление о БА как о хроническом воспалительном заболевании дыхательных путей стало важным достижением и определило направление поиска терапевтических подходов для профилактики и контроля воспалительного процесса при БА. Несмотря на широкое применение различных противоастматических и противоаллергических фармакологических препаратов, отмечается повсеместный рост числа больных страдающих этим заболеванием, а также отмечается устойчивая тенденция к увеличению числа больных с тяжелыми формами БА [7].
На современном этапе медицинской науки значительная часть знаний о механизмах лежащих в основе того или иного заболевания получены с использованием экспериментальных моделей, адекватных различным заболеваниям человека. Исследования in vivo, также являются начальным и основополагающим этапом в изучении безопасности и эффективности новых лечебных препаратов. К настоящему времени, по данным зарубежной литературы, уже описаны протоколы индукции моделей бронхиальной астмы у животных, в частности у линейных мышей [17,42]. Большинство протоколов индукции IgE-зависимой бронхиальной астмы предполагает использование
адъювантов. Преимущественное использование мышей для моделирования бронхиальной астмы связано с большим разнообразием реагентов для изучения генетических и иммунных механизмов развития заболевания. Мыши могут быть сенсибилизированы к различным видам аллергенов и развивать аллерген-индуцированное воспаление в дыхательных путях, а также бронхиальную гиперреактивность. Существуют определенные сходства между параметрами моделей аллергической бронхиальной астмы мышей и характеристиками бронхиальной астмы человека, заключающиеся в морфологических изменениях дыхательных путей и ткани легких, в характере антительного ответа, а также участвующих в развитии и поддержании аллергического воспаления эффекторных клеток и молекул [25]. Анализ отечественной научно-практической литературы привел к заключению об отсутствии данных о разработке и использовании для доклинических исследований адекватной модели аллергической (IgE-зависимой) бронхиальной астмы у мышей. Поэтому, разработка экспериментальной модели бронхиальной астмы является актуальной и перспективной в нашей стране.
Разработка модели БА на мышах позволит в дальнейшем изучать механизмы, приводящие к развитию заболевания, оценивать безопасность и эффективность новых лечебных препаратов перспективных для лечения и профилактики БА.
Единственным к настоящему времени методом терапии аллергических
заболеваний атопической природы, воздействующего на все патогенетически
значимые звенья аллергического процесса и обладающего длительным
противоаллергическим эффектом, является аллерген-специфическая
иммунотерапия (АСИТ) [92]. В настоящее время разрабатываются и внедряются не только новые способы ее проведения, но и новые формы лечебных аллергенов. Такие аллергены должны обладать сниженной аллергенной и сохраненной иммуногенной активностью [4]. Это может быть достигнуто модификацией аллергенов, в том числе химической, а также использованием разнообразных природных и синтетических носителей — адъювантов [2,10,64].
Очевидно, что для доклинического изучения свойств гипоаллергенных вакцин и их терапевтической эффективности целесообразно использовать модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей. Проведение доклинических исследований новых форм аллергенов на модели ЭБА с использованием принципа АСИТ может всесторонне охарактеризовать влияние аллерговакцины на манифестацию и течение IgE-зависимой БА.
Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей и оценить возможность ее применения для доклинических исследований новых подходов к АСИТ.
Разработать схему моделирования IgE-зависимой БА у мышей путем введения модельного аллергена овальбумина (ОА) без использования адъюванта;
Изучить динамику накопления аллерген-специфических IgE- и IgG-антител в ходе моделирования ЭБА;
Провести оценку клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей с ЭБА;
Провести гистологическое исследование легких у мышей с ЭБА;
Оценить бронхиальную реактивность у мышей с ЭБА;
Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у мышей с ЭБА;
Провести сравнительную ЭАСИТ ^модифицированным, модифицированным (сукцинилированием) аллергеном и комплексом модифицированного аллергена с полиоксидонием на модели ЭБА;
Изучить динамику накопления аллерген-специфических IgE- и IgG-антител в ходе и позавершении ЭАСИТ;
Провести оценку клеточного состава БАЛ и периферической крови у мышей после ЭАСИТ;
10. Провести гистологическое исследование легких у мышей после ЭАСИТ;
11.Оценить бронхиальную реактивность у мышей после ЭАСИТ;
12.Провести сравнительную оценку выраженности системной анафилаксии у
мышей после ЭАСИТ. Научная новизна работы:
Впервые в России разработана и охарактеризована краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей без использования адъюванта.
Впервые в России проведено исследование дыхательной функции мышей в ответ на введение неспецифического раздражителя метахолина.
Впервые на модели IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей проведена экспериментальная аллерген-специфическая иммунотерапия химически модифицированным аллергеном.
Показано преимущество ЭАСИТ комплексом модифицированного аллергена и иммуномодулятора полиоксидония по сравнению с ЭАСИТ только модифицированным или немодифицированным аллергеном. Практическая значимость:
Разработанная краткосрочная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у мышей позволит оценивать безопасность и эффективность новых форм лечебных аллергенов и фармакологических препаратов, перспективных для профилактики и лечения IgE-зависимых заболеваний, в частности атопической бронхиальной астмы.
Экспериментальная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы также может быть использована для изучения патогенетических механизмов лежащих в основе развития этого заболевания.
источник