Пептиды от болезни альцгеймера

Спусковым крючком патогенного молекулярного процесса, приводящего к болезни Альцгеймера, служат ионы цинка.

Нейродегенеративные заболевания, к которым относится и болезнь Альцгеймера, возникают из-за неправильного поведения некоторых нейронных белков. У любой белковой молекулы есть определённая пространственная трёхмерная форма – если из-за мутации правильная конформация у белка не получается, он не может выполнять свою функцию, и в таком случае клетка отправляет его в «мусорник».

Но некоторые из белков способны принимать альтернативную конформацию, в которой они становятся не просто бесполезными, а просто-таки токсичными, и при этом в «мусорник» их так просто не отправишь. Токсичность же их обусловлена тем, что в альтернативной пространственной укладке они способны образовывать крупные агрегаты, которые плохо влияют на важные клеточные процессы.

В случае болезни Альцгеймера такими «двуличными» молекулами оказываются бета-амилоидные пептиды, которые в норме служат нейропротекторами, а при патологии – то есть при синдроме Альцгеймера – вдруг начинают слипаться друг с другом, образуя массивные нерастворимые белковые отложения. Считается, что как раз такие крупные скопления белка и отравляют нервные клетки, которые из-за них перестают проводить электрический сигнал и вскоре погибают, уступая место амилоидным бляшкам.

Впрочем, в последнее время появляются данные, которые говорят о том, что вред от патогенных амилоидов проявляется ещё до того, когда они начинают вываливаться в осадок, что главный токсический эффект производят крупные объединения пептидов, которые до поры до времени остаются растворимыми, свободно плавая в цитоплазме.

Как бы то ни было, сейчас уже известно, как амилоидные пептиды слипаются, разрастаясь во всё более крупные комплексы – однако с чего всё начинается, до сих пор остаётся загадкой. Что заставляет две самые первые свободные молекулы соединиться друг с другом? Разобраться в этом попытались исследователи из Института молекулярной биологии им. Энгельгардта и факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета, опубликовавшие результаты своих экспериментов в Scientific Reports.

По словам Владимира Польшакова, ведущего научного сотрудника факультета фундаментальной медицины МГУ и одного из соавторов статьи, важную роль в инициализации молекулярных процессов, с которых начинается развитие синдрома Альцгеймера, играют ионы переходных металлов, прежде всего цинка.

Цинк играет важную роль в жизни любой клетки – например, некоторые белки, управляющие активностью генов, не смогут работать, если их структуру не скрепить цинковыми ионами – однако его взаимодействие с бета-амилоидами ни к чему хорошему, по-видимому, не приводит. Но вот как именно он с ними связывается и что именно тут происходит, до сих пор остаётся неясным.

Чтобы узнать это, нужно изучить структуру молекулярных комплексов – фрагментов амилоидных пептидов, взаимодействующих с ионом металла. Эксперименты проводили как с нормальным бета-амилоидным пептидом, так и с мутантным, в котором одна из аминокислот была заменена на другую, а также с изомеризованным пептидом, не отличавшимся по аминокислотному составу от нормального, но в котором в одной из аминокислот атомы располагались иначе (то есть она была изомером такой же аминокислоты, что находилась в том же положении в нормальном бета-амилоиде).

Про пептид-изомер было известно, что он появляется спонтанно, без участия ферментов, что его накопление усиливается с возрастом, и что у мышей он вызывает стремительное формирование альцгеймерических бляшек в мозге – в присутствии же цинка такие пептиды слипались друг с другом едва ли не мгновенно.

Нарастание амилоидов во всех трёх случаях – с нормальным пептидом, с изомеризованным и с мутантным – имеет свои особенности. Однако, как показал анализ молекулярных комплексов, проведенный с помощью ядерно-магнитного резонанса и ряда других методов, начальные стадии в каждой случае абсолютно одинаковы: во всех трёх вариантах всё начинается с того, что ион цинка скрепляет два пептида.

Скорость дальнейшей агрегации зависит от того, какой конкретный вид амилоидных пептидов участвует в процессе, насколько он склонен к слипанию, однако, как бы ни повернулись дальнейшие события, в начальной точке всегда будет димер с цинком в качестве межмолекулярной скрепки.

Предлагаемый «цинковый» механизм превращения хороших амилоидов в плохие согласуется не только с результатами экспериментов самих авторов работы, но и с результатами других лабораторий. И, хотя на вышеописанное взаимодействие, очевидно, могут влиять и другие молекулярные, клеточные и физиологические факторы, новые данные вполне можно использовать для создания лекарств, которые, предотвращая слипание пептидов с цинком, защищали бы мозг от синдрома Альцгеймера.

источник

Рынок пептидных разработок переживает сейчас небывалый бум, и врачи прогнозируют наступление «пептидной эры». Сегодня на мировом рынке представлено 60 пептидных препаратов, и почти 20% этих лекарств разработано и запатентовано в нашей стране. Одним из создателей этих препаратов является компания «Фарма Био», резидент Сколково.

Пептиды — это универсальные биорегуляторы, которые контролируют большинство биохимических процессов в организме. Преимущество пептидов перед другими типами медпрепаратов состоит в том, что они безопасны, быстро выводятся из организма, не накапливаясь, и имеют значительно меньше побочных эффектов, чем непептидные лекарства.

Клинические исследования по западным стандартам доказательной медицины — это не только испытание препарата на качество, но и компании — на финансовую устойчивость. Позволить себе это могут лишь те, кто уверен, что их препарат обладает огромным коммерческим потенциалом, и не просто уверен, а еще и сможет убедить в этом инвесторов. Заявку на международное качество научный коллектив «Фарма Био» сделал еще в 1990-е, когда глава компании известный ученый, доктор биологических и кандидат химических наук Владислав Дейгин вместе с соавторами продал международной фармкомпании свою разработку — иммуномодулятор тимоген. Сейчас еще одно детище профессора Дейгина, тимодепрессин, о совместной реализации которого на рынке СНГ у «Фарма Био» заключен договор с немецкой компанией Berlin Chemie/Menarini, проходит вторую стадию клинических испытаний в Соединенных Штатах. Компания, основанная в 2010 году при активном участии Института биоорганической химии РАН, сегодня имеет в своем продуктовом портфеле пять принципиально новых лекарственных препаратов пептидной природы.

Специалисты «Фарма Био» придумали новый подход к лечению таких тяжелых заболеваний, как, например, болезнь Альцгеймера. Компания разрабатывает пептидную вакцину, защищающую нейроны от отложений бета-амилоида. Именно эти отложения, согласно общепринятой в научном сообществе гипотезе, и являются причиной возникновения болезни Альцгеймера. Также препараты «Фарма Био» помогают от алкогольной зависимости и некоторых расстройств нервной системы.

Инновационных российских пептидных препаратов на отечественном рынке немного, в основном у нас производят западные дженерики. В России помимо «Фарма Био» разработками в области пептидных лекарств занимается еще шесть компаний. Но несмотря на это, ведущие врачи, работающие с пептидными соединениями, отмечают, что для клинических испытаний препаратов необходима хорошая экспериментальная база, коей не все производители могут похвастаться. «В медицине важно не только разрабатывать новые лекарства, но и выводить их на рынок, а такую компетенцию в нашей стране, к сожалению, могут продемонстрировать очень немногие. Чтобы преуспеть в этом, «Фарма Био» осуществляла патентную работу, налаживала международное сотрудничество с Канадой и США, рассказывают в биомедицинском кластере Сколково. И одним из важнейших преимуществ продуктов «Фарма Био», конечно, является приемлемая рыночная цена. Аналогичные лекарства в мире стоят от $1 тыс. и более за одну ампулу. К примеру, тимодепрессин, эффективный при лечении целого ряда аутоиммунных заболеваний (псориаз, ревматоидный артрит и др.), стоит 3 тыс. рублей, в то время как его западный аналог ремикейд обходится больным в десять раз дороже.

Препараты «Фарма Био» уже давно применяют многие клиники. По свидетельству профессора Николая Короткого, ведущего дерматовенеролога Российской детской клинической больницы, препарат тимодепрессин уже помог тысячам пациентов. «Тимодепрессин подходит для лечения многих патологий,— объясняет доктор.— Для меня же его ценность состоит еще и в том, что он применяется в детской практике». Юлия Виноградова, профессор Гематологического научного центра Минздрава России, которая за 20 лет своей практики работала со многими препаратами, очень высоко оценивает препараты «Фарма Био». По ее словам, главная проблема их аналогов — большое количество побочных действий и токсичность, которая практически полностью отсутствует у лекарств «Фарма Био». «В моей практике были пациенты, организм которых отвечал только на пятикратную дозу. И благодаря отсутствию токсичности препаратов дозу можно было увеличить даже в 50 раз и получать положительный эффект уже на совершенно другом уровне. Препятствием для лечения могло стать лишь то, что эти медикаменты не вошли в список бесплатных лекарств для наших больных»,— рассказывает профессор Виноградова.

«Я уверена, что многие отечественные препараты могут пройти суровую проверку за границей и получить восхитительные отзывы лучших врачей на Западе, но у нас в стране никто в них не поверит и не будет активно продвигать, пока эти препараты не придут к нам с Запада в виде совместных разработок под западными названиями. Издержки менталитета!» — говорит Юлия Виноградова.

Тем временем мировой рынок пептидов продолжает стабильно расти. Так, если в 2008 году, на фоне кризиса, объем продаж пептидных лекарств составлял $15,5 млрд, то в 2012-м он увеличился на 30% и составил $22,8 млрд. Сегодня около 300 пептидных препаратов, что в пять раз превышает число уже зарегистрированных, находится на различных стадиях исследований. И, по мнению экспертов, их количество будет неуклонно расти. Помимо Сколково над ними работают в Институте белка РАН в Пущино, в Екатеринбурге, Новосибирске, Санкт-Петербурге, Черноголовке. Тем не менее для разработки и вывода на рынок принципиально новых препаратов мирового уровня с хорошей патентной защитой необходимы инвестиции в сотни миллионов долларов и 10-12 лет исследований.

Поэтому, несмотря на постоянный рост интереса к пептидным разработкам в мире, перспективы других научных и фармацевтических компаний в России, стремящихся обосноваться в достаточно свободной нише рынка, сильно зависят от притока инвестиций. Специалисты, конечно, надеются, что это произойдет, но, возможно, не в ближайшем будущем.

(оценок: 1, среднее: 5,00 из 5)
Загрузка.

источник

1 отделение психиатрии, геттингенский университет, геттинген, отделение психиатрии и психотерапии, университет Эрланген-Нюрнберг, Эрланген, 3Брукер Далтроник, Лейпциг, 4Парацельс-Елена Клиник, Кассель, 5 отделение неврологии, Университет Ульма, Штайнхёвелстр, Ульм, Германия и 6Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США

Поскольку дифференциальный диагноз деменции, основанный на установленных клинических критериях, часто затруднен, биомаркеры для применимого диагностического тестирования в настоящее время подвергаются интенсивному исследованию. Амилоидные бляшки, депонированные в мозге пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, деменция с телами Леви (DLB) и деменцией болезни Паркинсона (PDD) в основном состоят из карбокси-терминально удлиненных форм амилоид-бета (Aβ) -пептидов, таких как Aβ1-42. Абсолютные уровни Aβ1-42 в CSF показали диагностическую ценность для диагностики болезни Альцгеймера, но дискриминация между болезнью Альцгеймера, DLB и PDD была низкой. Недавно установленный количественный анализ Aβ-натрий-додецилсульфат-полиакриламид-гель-электрофорез на основе мочевины с использованием западного иммуноблота (Aβ-SDS-PAGE / иммуноблот) показал высококонсервативную картину Aβ-пептида укороченных карбокси-концевых пептидов Aβ 1-37, 1 -38, 1-39 в дополнение к 1-40 и 1-42 в человеческом CSF. Мы использовали Aβ-SDS-PAGE / immunoblot для исследования CSF у 23 пациентов с болезнью Альцгеймера, 21 с DLB, 21 с PDD и 23 бездушными контрольными заболеваниями (NDC) для специфических для болезни изменений пептидных структур Aβ в его абсолютных и относительных величин. Диагностические группы были сопоставлены по возрасту и тяжести деменции. Настоящее исследование является первой попыткой оценить значение пептидных структур Aβ в CSF для дифференциальной диагностики трех нейродегенеративных заболеваний — болезни Альцгеймера, DLB и PDD. Паттерны Aβ-пептидов отображали специфические для болезни вариации, а отношение дифференциально измененных Aβ1-42 к уровням Aβ1-37 впоследствии различали все диагностические группы друг от друга на очень значительном уровне, за исключением DLB от PDD. Кроме того, новый новый пептид с Aβ-подобной иммунореактивностью постоянно наблюдался в CSF у всех 88 исследованных пациентов. Значительное процентное увеличение этого пептида в DLB позволило значительно различать ПДД. Используя точку отсечения 0,954%, этот маркер дал диагностическую чувствительность и специфичность 81 и 71% соответственно. Из нескольких строк указания мы рассматриваем этот пептид как представляющий собой окисленную α-спиральную форму Aβ1-40 (Aβ1-40 *). Увеличение численности Aβ1-40 *, вероятно, отражает специфическое для болезни изменение метаболизма Aβ1-40 в DLB. Мы заключаем, что Aβ-пептидные структуры отражают специфические для болезни патофизиологические пути различных синдромов деменции как различные нейрохимические фенотипы. Хотя образцы пептидов Aβ не соответствовали требованиям к единственному биомаркеру, их комбинированная оценка с другими биомаркерами является перспективной в диагностике нейрохимической деменции. Стоит отметить, что DLB и PDD демонстрируют различные клинические временные курсы, несмотря на их сходный невропатологический облик. Их различные молекулярные фенотипы подтверждают мнение о различных патофизиологических путях для каждого из этих нейродегенеративных заболеваний.

Амилоид-бета (Aβ) -пептиды образуют основной компонент амилоидных бляшек, депонированных в мозге пациентов, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера (Glenner and Wong, 1984), деменция с телами Леви (DLB) (Jendroska et al., 1997) ) и деменция болезни Паркинсона (PDD) (Jendroska et al., 1996).

Aβ-пептиды получают из трансмембранного предшественника-белка амилоида (APP), расщепляемого двумя ферментами, β- и γ-секретазой (Haas and Selkoe, 1993). Предполагается, что отдельные активности γ-секретазы ответственны за образование либо усеченных карбокси-терминально (Ct-усеченных), либо удлиненных (Ct-удлиненных) Aβ-пептидов в соответствии с Aβ1-40 (Citron et al., 1996). Расщепление APP на δ-секретазу приводит к получению удлиненного аминогруппы (A-удлиненного) Aβ-пептида (Simons et al., 1996).

Дифференциальный диагноз деменции, основанный на установленных клинических критериях, часто бывает затруднен в течение жизни, а селективное снижение Aβ1-42 в CSF пациентов с болезнью Альцгеймера широко изучено как диагностический биомаркер для обеспечения точности диагностики в течение жизни. Недавно проведенный экспертный опрос показал, что он адекватен применимому диагностическому тесту болезни Альцгеймера в дополнение к клиническим критериям (Andreasen et al., 2003). Снижение уровня Aβ1-42 также было зарегистрировано для пациентов с DLB (Andreasen et al., 2001; Mollenhauer et al., 2005) и PDD (Mollenhauer et al., 2005). Таким образом, специфичность этого открытия и, следовательно, его дифференциальная диагностическая ценность при различении разных подтипов деменций была низкой (Andreasen et al., 2001, 2003; Mollenhauer et al., 2005).

В количественном анализе на основе мочевины Aβ-натрий-додецилсульфат-полиакриламид-гель-электрофорез с западным иммуноблотом (Aβ-SDS-PAGE / immunoblot) недавно выявлено регулярное количество Ct-усеченных пептидов Aβ 1-37, 1-38, 1- 39 в дополнение к 1-40 и 1-42 в CSF. Этот образец пептида Aβ выявил специфические для болезни вариации в его абсолютных и относительных количествах в CSF пациентов с болезнью Альцгеймера, болезнью Крейтцфельдта-Якоба (CJD), хроническими воспалительными заболеваниями и другими нейропсихиатрическими заболеваниями (Wiltfang et al., 2002, 2003).

Чтобы оценить значение этого открытия для дифференциального диагноза деменции, мы исследовали 88 пациентов с возрастом, страдающих болезнью Альцгеймера, DLB, PDD и различными нейропсихиатрическими заболеваниями для специфических для болезни штаммов Aβ-пептидов.

Мы смогли продемонстрировать специфические для болезни вариации пептидных структур Aβ в CSF для каждой из диагностических групп, которые допускают очень значительную дискриминацию и могут отражать патофизиологические пути подтипов деменции.

Образцы Aβ пептидов анализировали с помощью Aβ-SDS-PAGE / иммуноблотта (Wiltfang et al., 2002) в CSF пациентов с болезнью Альцгеймера, DLB, PDD и бездомным контролем заболеваний (NDC). В общей сложности 88 пациентов были разделены на четыре диагностические группы в соответствии с их клиническим диагнозом и были проверены на существенные различия в абсолютных и относительных значениях Aβ-пептида. Пациенты были отобраны в период с 1999 по 2004 год и из амбулаторной клиники деменции. Средний возраст не различался между диагностическими группами. Экзамен по мини-психическому статусу (MMSE) (Folstein et al., 1975) проводился на пациентах, страдающих когнитивными нарушениями во время поясничной пункции. Оценка MMSE существенно не отличалась между диагностическими группами деменций (болезнь Альцгеймера, DLB, PDD) и была значительно различной для группы NDC (P = 2,0 × 10-6).

Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации (Всемирная медицинская организация, 1996 г.) и одобрено комитетом по этике Университета Геттингена. Исследования проводились с информированного согласия всех пациентов или, для пациентов с тяжелой деменцией, их ближайших родственников.

Все 23 пациента (8 мужчин и 15 женщин) этой группы выполнили критерии диагностики и статистических руководств (DSM) IV для болезни Альцгеймера и Национального института неврологических и коммуникативных расстройств и ассоциации заболеваний и связанных с ними заболеваний (String-Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association) (NINCDS-ADRDA) критерии клинической диагностики вероятной болезни Альцгеймера (McKhann et al., 1984). Возраст этой группы составил 69,5 ± 11,5 лет (среднее ± стандартное отклонение). MMSE был доступен для 22 пациентов. Одному пациенту подвергся синдром-курз-тест (SKT) вместо MMSE. Показатель SKT составлял 20, что указывает на умеренную форму деменции. Средний показатель MMSE составлял 18,4 ± 5,1 (среднее ± стандартное отклонение) в этой группе.

Все 21 пациент (15 мужчин и 6 женщин) этой группы выполнили критерии DSM IV для слабоумия и критерии McKeith для клинической диагностики вероятного DLB (McKeith et al., 1996). Возраст этой группы составил 71,5 ± 6,6 года (среднее ± стандартное отклонение). MMSE был доступен для 20 пациентов. Один пациент отклонил когнитивное тестирование. Он проявлял умеренные когнитивные нарушения во время поясничной пункции, и невропатологический посмертный анализ подтвердил этому пациенту случай DLB. Средняя оценка MMSE составляла 18,1 ± 5,3 (среднее ± стандартное отклонение) в этой группе.

Все 21 пациент (16 мужчин и 5 женщин) этой группы выполнили критерии DSM IV для лечения деменции и клинические диагностические критерии болезни Болиского банка Великобритании Parkinson для идиопатической болезни Паркинсона (Gibb and Lees, 1988). Все пациенты в этой группе представили паркинсонизм по крайней мере за год до начала деменции в соответствии с критериями McKeith et al. (1996). Возраст этой группы составил 72,4 ± 6,8 лет (среднее ± стандартное отклонение). Показатель MMSE составлял 17,7 ± 7,3 (среднее ± стандартное отклонение) в этой группе.

Эта группа состояла из 23 пациентов без суицида (4 мужчин и 19 женщин), которые прошли поясничную пункцию по другим дифференциальным диагностическим причинам; ни один из этих пациентов не обнаружил клинических признаков нейродегенеративного заболевания. Возраст этой группы составил 68,5 ± 9,0 лет (среднее ± стандартное отклонение). MMSE оценивали подгруппу из 11 пациентов, страдающих депрессией с когнитивными жалобами. Оценка составила 27,7 ± 3,1 (среднее ± стандартное отклонение). Один пациент, страдающий от большой депрессии, отклонил когнитивное тестирование. Когнитивные нарушения у всех депрессивных пациентов улучшились после приема антидепрессантов. В группу входили также пациенты, страдающие височной эпилепсией (n = 1), гидроцефалией нормального давления (n = 2), церебральными транзиторными ишемическими атаками (n = 1), метастазами в мозг (n = 1), периферической инфекцией герпеса (n = 1), рак молочной железы (n = 1), паралич периферического лицевого нерва (n = 1), системный васкулит (n = 1), компрессия спинного мозга (n = 1) и грыжа межпозвонковых дисков (n = 1).

CSF отбирали у пациентов с помощью поясничной пункции, отбирали в пробирках из полипропилена и центрифугировали (1000 г, 10 мин, 4 ° С), а аликвоты 200 мкл хранили при -80 ° С в течение 24 ч для последующего одно- и двухмерного Анализ Aβ-SDS-PAGE / иммуноблоттинг.

Предварительно аналитическая концентрация CSF с помощью иммунопреципитации (IP) была проведена ранее (Wiltfang et al., 2002). Молекулярные антитела 6E10 (Senetec Drug Delivery Technologies Inc, США) и 1E8 использовали аминоконцевые селективные мышиные мышиные моноклональные антитела, по сравнению с карбокси-терминальными селективными 13E9 и 6D5, направленными против карбокси-конца Aβ1-40 и Aβ1-42, соответственно. Последние три антитела были предоставлены Schering AG, Берлин, Германия.

Для отделения пептидов Aβ и последующего обнаружения 10 мкл неконцентрированного CSF кипятили в буфере для образца для SDS-PAGE, и Aβ-SDS-PAGE / иммуноблот проводили, как опубликовано в другом месте (Wiltfang et al., 1997, 2002).

Образцы проводили как три раза, и каждый гель имел четырехступенчатую серию разбавления синтетических Aβ-пептидов Aβ1-37, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40 и Aβ1-42. Синтетические пептиды Aβ1-38, Aβ1-40 и Aβ1-42 были получены из Bachem (Bubendorf, Switzerland); Aβ1-37 и Aβ1-39 были синтезированы автоматически согласно Janek et al. (Janek et al., 2001). Стандартные препараты синтетической смеси Aβ-пептидов были созданы, как описано ранее (Bibl et al., 2004), и полосы были количественно определены из отдельных блотов каждого пациента по сравнению с этой серией разбавления с использованием камеры с зарядовой связью (CCD-камера) ONE (BIORAD).

Коэффициенты вариации и чувствительности обнаружения Aβ-SDS-PAGE / иммуноблота A / SDS были опубликованы в другом месте (Wiltfang et al., 2002; Bibl et al., 2004).

Для изоэлектрической фокусировки (IEF) на иммобилизованных градиентах рН (IPG), а затем Aβ-SDS-PAGE / иммуноблот (Aβ-IPG-2D-PAGE), 25 мкл иммунопреципитированного CSF уравновешивали в буфере для образцов IPG и Aβ-IPG-2D -PAGE выполняли, как было опубликовано ранее (Wiltfang et al., 2002).

Bicine / bistris / tris / сульфат SDS-PAGE (без мочевины) на 12% T (акриламид) / 5% C (N, N’метиленбисакриламид) гели (Wiltfang et al., 1991) использовали для первого измерения для достижения разделение, которое зависит исключительно от эффективных молекулярных радиусов пептидов. В этом сепарационном геле мономерные Аβ-пептиды мигрируют в одной полосе вблизи подвижной границы, тогда как олигомерные формы могут быть разделены в результате их более высоких молекулярных радиусов. Пять микролитров иммунопреципитированного CSF применяли на дорожку. После электрофореза при постоянном токе 12 мА / гель всю полосу вырезали и размещали горизонтально на разделительном геле толщиной 0,75 мм того же состава, но содержащем 8 М мочевины. Гель проводили при постоянном токе 18 мА / г для разделения различных видов пептидов Aβ на основе индуцированных мочевиной пептид-специфических сдвигов при связывании SDS.

Экстракционные картриджи HLB (Waters, № 186000115) активировали 50% -ным объемным метанолом и затем промывали 8 мл 5% метанола перед загрузкой образца. Десять микролитров Aβ-пептида (0,1 мг / мл) в буфере для образцов SDS-PAGE смешивали с 490 мкл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) и загружали в один картридж. Пептид Aβ элюировали 83% ацетонитрилом / 0,08% трифторуксусной кислотой (TFA). Четыре фракции по 1,5 мл каждый собирали в пробирках из полипропилена. Из каждой фракции 50 мкл высушивали в вакууме и повторно растворяли в связывающем буфере для дальнейшего IP-соединения в соответствии с протоколом изготовителя (Bruker Immunocapturing Kit № 233794) и последующим анализом масс-спектроскопии с использованием лазерной десорбции — время пролета modus (MALDI-TOF). Образцы для Aβ-SDS-PAGE растворяли в SDS-PAGE-буфере согласно Wiltfang et al. (1997, 2002).

Для локализации Aβ 1-40 и Aβ 1-40 * в неокрашенных гелях контактные пятна получали сразу после электрофореза, помещая предварительно смоченные PVDF-блоттинговые мембраны на каждый гель в течение 5 мин при комнатной температуре. После кратковременного полоскания в двойной дистиллированной воде (H2Odd) пептиды и белки визуализировались на мембране PVDF путем коллоидного окрашивания серебром [2% (масса / объем) динатрия тринатрия цитрата, гексагидрата сульфата аммония (II), 0,8%, нитрата 0,2% серебро] согласно van Oostveen et al. (1997). Окрашенные мембраны служили шаблонами для вырезания Aβ 1-40 и Aβ 1-40 * из геля.

Предварительно аналитическую концентрацию CSF по IP с помощью аминоконцевого селективного мышиного моноклонального антитела 1E8, нековалентно связанного с M280-Dynal-Beads, выполняли, как описано ранее (Wiltfang et al., 2002). Вкратце, вырезанные образцы геля инкубировали в течение ночи при 4 ° С в 40 мкл 5-кратного концентрированного RIPA-детергентного буфера (RIPA5 ×: 2,5% Nonidet P-40, 1,25% дезоксихолата натрия, 0,25% SDS, 750 мМ NaCl, 250 мМ HEPES, одна таблетка коктейля для ингибитора протеазы Complete Mini на 2 мл RIPA5 ×, pH до 7,4 с NaOH) и 160 мкл H2Odd в дополнение к 20 мкл 1E8-M280-Dynal-Beads. Магнитные гранулы затем захватывали на магнитной подставке и дважды промывали PBS / 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и один раз с 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4). Наконец, связанные белки элюировали в 10 мкл буфера для элюирования (Bruker Immunocapturing Kit № 233794) при постоянном перемешивании при 37 ° C в течение 1 часа и еще 2 минуты в ультразвуковой ванне.

Тонкий слой насыщенной α-циано-гидроксикоричной кислоты в ацетоне, содержащем 3% Н2О и 10 мМ NH4H2PO4, готовили на мишени из стальной стали. Аликвоту 0,5 мкл образца непосредственно определяли на матрице и сушили. Затем препарат промывали дважды, добавляя 5 мкл 10 мМ NH4H2PO4 / 0,1% TFA и удаляя его через 10 секунд, сушили и анализировали с использованием масс-спектрометра Autoflex II TOF / TOF (Bruker Daltonics, Германия) в режиме положительного рефлектора. Триста отдельных снимков были объединены для каждого спектра. Спектры были откалиброваны с использованием ClinProt Standard (Bruker Daltonics, Германия).

Уровни пептидов Aβ были отсканированы и рассчитаны как абсолютные значения (нг / мл), а также проценты от общей концентрации Aβ-пептида всех обнаруженных пептидов Aβ. Данные по уровням пептидов были получены из отдельных блотов каждого пациента. Для сравнения групп пациентов были рассчитаны средние концентрации и стандартное отклонение (SD).

U-тест Манна-Уитни применялся для оценки значимости различий между группами.

Двусторонний уровень значимости определялся как P 0,05).

Средний и 95% доверительный интервал (CI) абсолютных уровней Aβ1-37 и Aβ1-42 для каждой диагностической группы. На рисунке показаны только существенные различия.

Путем введения отношения Aβ1-42 к Aβ1-37, группа NDC могла быть дифференцирована на очень значительном уровне от болезни Альцгеймера (P = 5,2 × 10-7), DLB (P = 2,0 × 10-4) и PDD ( P = 1,2 × 10-3). Болезнь Альцгеймера значительно отличалась от группы DLB (P = 3,2 × 10-3) и группы PDD (P = 1,1 × 10-4) соответственно (фиг.4). Используя значение отсечки 0,848, болезнь Альцгеймера можно отличить от НДЦ с чувствительностью и специфичностью 87%.

Средний и 95% доверительный интервал (CI) отношения Aβ1-42: Aβ1-37 для каждой диагностической группы. На рисунке показаны только существенные различия.

Группа DLB может быть дифференцирована от группы PDD на процентное увеличение Aβ1-40 * по отношению к сумме всех Aβ-пептидов (Aβ1-40 *%) в группе DLB на очень значительном уровне (P = 6,0 × 10- 4) (фиг.5). Aβ1-40 * также был повышен в группе болезни Альцгеймера, но не достиг уровня значимости.

Средний и 95% доверительный интервал (CI) относительной численности Aβ1-40 * (Aβ 1-40 *%) для PDD и DLB. Разница между PDD и DLB была очень значительной (P = 6,0 × 10-4).

Абсолютное и относительное содержание Aβ-пептидов каждой диагностической группы суммированы в таблице 1. Отсекающие точки, чувствительность и специфичность наилучшего распознающего Aβ-пептидного отношения (то есть Aβ1-42 / 37 или Aβ1-40 *%, соответственно) для каждого дифференциального диагностического тестирования приведены в таблице 2.

Абсолютное и относительное содержание пептидных структур Aβ в CSF диагностических групп (среднее ± стандартное отклонение).

Общая концентрация Aβ-пептида; ‡ процентное содержание пептидов Aβ относительно общей концентрации Aβ-пептида; Степень абсолютных уровней Aβ 1-42 до Aβ 1-37. AD = болезнь Альцгеймера

Отсечные точки, чувствительность и специфичность наилучшего распознающего Aβ-пептидного отношения (то есть Aβ1-42 / 37 или Aβ1-40 *% соответственно) для каждого дифференциального диагностического тестирования

Ранее неописанный пептид с Aβ-подобной иммунореактивностью (Aβ1-40 *) в сторону высококонсервативной картины пептидов Aβ 1-37, 1-38, 1-39, 1-40 и 1-42 постоянно наблюдался во всех 88 CSF образцы исследованы. Таким образом, Aβ1-40 * проявляет электрофоретические и иммунологические особенности Aβ1-40, но мигрирует в другом положении в Aβ-SDS-PAGE / immunoblot. Аналогичная полоса происходит от синтетического Aβ1-40 во время SPE в гидрофобных условиях (синтетическая Aβ1-40 *) и проявляет массу, соответствующую ожидаемой массе Aβ1-40ox.

Процентное содержание Aβ1-40 * по сравнению с суммой всех исследованных пептидов Aβ (Aβ1-40 *%) заметно увеличивалось в DLB и в меньшей степени также при болезни Альцгеймера по сравнению с PDD и NDC соответственно.

Значительно уменьшенные уровни CSF Aβ1-42 по сравнению с NDC были наиболее заметными при болезни Альцгеймера, и их также можно было продемонстрировать для DLB, но не для PDD. Напротив, Aβ1-37, Aβ1-38 и Aβ1-40 были слегка повышены при болезни Альцгеймера по сравнению с другими группами деменции. Введение соотношений Aβ1-42 в Aβ1-37, 1-38, 1-39 и 1-40, соответственно, улучшило точность диагностического теста для каждого дифференциального диагностического вопроса по сравнению только с уровнями Aβ1-42. Во-первых, это может быть связано с болезненными взаимодействиями каждого непрерывного процесса нейродегенеративной деменции с метаболизмом APP, который не может быть адекватно представлен единственным измерением абсолютных уровней Aβ1-42 (Wiltfang et al., 2001). Во-вторых, процентное содержание каждого вида Aβ-пептида демонстрировало более низкую межличночную дисперсию значений, чем ее абсолютные уровни (Wiltfang et al., 2003). Это соответствует наблюдению, что обилие одиночных видов Aβ-пептидов тесно коррелирует друг с другом и регулируется в узких пределах, тогда как общее количество пептидов Aβ варьируется в зависимости друг от друга (Wiltfang et al., 2002, 2003). Отношение дифференциально измененных Aβ1-42 к уровням Aβ1-37 позволило обеспечить наилучшую точность теста и значительно значительную дифференциацию всех диагностических групп друг от друга, за исключением DLB и PDD. DLB и PDD затем могут быть подвергнуты дискриминации на очень значительном уровне с помощью специально увеличенного Aβ1-40 *% в DLB.

Сообщалось о снижении уровня CSF Aβ1-42 у пациентов с болезнью Альцгеймера (Motter et al., 1995; Andreasen et al., 2001, 2003; Wiltfang et al., 2002, 2003; Mollenhauer et al., 2005) и DLB (Andreasen et al., 2001; Mollenhauer et al., 2005). Снижение уровня Aβ1-42 при болезни Альцгеймера объясняется увеличением клиренса пептида из CSF в старческие амилоидные бляшки в течение длительного времени (Motter et al., 1995). Другие исследования указывают на существование альтернативных механизмов, включая образование SDS-стабильных олигомеров (Podlisny et al., 1995) и шапероновых комплексов пептидов Aβ с конкретными белками-носителями (Wiltfang et al., 2002, 2003; Bibl et al., 2004). Однако расщепление и последующее осаждение белков считается основным патологическим событием как при нейродегенеративных заболеваниях, так и в отношении амилоидной патологии также было сообщено о DLB (Merdes et al., 2003).

Сообщается, что альфа-синуклеин, являющийся основным компонентом тел Леви, облегчает агрегацию пептидов Aβ, и взаимодействия между двумя пептидами по существу включают их соответствующие гидрофобные домены (Yoshimoto et al., 1995). Более того, в последнее время обнаружено, что осаждение амилоидных бляшек в DLB связано с количеством кортикальных тел Льюи (Pletnikova et al., 2005). Взаимодействия гидрофобных шаблонов или доменов с Aβ могут индуцировать конформационный сдвиг пептида в α-спираль in vitro (Giacomelli and Norde, 2005). Подобные взаимодействия Aβ, например, с α-синуклеином (Yoshimoto et al., 1995) в случае DLB, могут приводить к α-спиральным Aβ-пептидным видам in vivo. Сообщается, что переходное образование α-спирали играет важную роль в сборке токсичных олигомеров (Klimov and Thirumalai, 2003) и формировании β-листа, что указывает на то, что он является на пути к агрегации Aβ (Kirkitadze et al., 2001).

Кроме того, α-спиральная структура изменяет электронную среду вокруг серы метионинового остатка 35 (met-35), что делает ее склонной к окислению (Butterfield, 2003) с помощью широкого спектра окислителей, которые в изобилии биологических систем. Патогенная роль окислительного стресса (например, повреждение мембраны и нарушение клеточного гомеостаза кальция) хорошо документирована для болезни Альцгеймера (Butterfield et al., 2003) и DLB (Giasson et al., 2000). С одной стороны, окисление метил-35 до метионинсульфоксида (двухэлектронное окисление) снижает клеточную токсичность и прооксидантный потенциал Aβ (Varadarajan et al., 2001; Butterfield, 2003), а также предотвращает агрегацию фибрилл (Watson et al., 1998; Hou et al., 2002; Palmblad et al., 2002). Напротив, ионы металлов, такие как медь, могут реагировать с мет-35 с образованием свободного серурамила на атоме серы (одноэлектронное окисление), что вызывает усиление окислительного стресса посредством окисления ДНК / РНК и белка, перекисного окисления липидов и образование активных форм кислорода, соответственно (Butterfield, 2003). Более того, на металлозависимую агрегацию Aβ не влияет образование сульфоксида метионина (Barnham et al., 2003), а met-35-окисленный Aβ содержит основной компонент общего мозга Aβ в старческих амилоидных бляшках (Atwood et al. , 2002; Dong et al., 2003). В то время как met-35-окисленный Aβ является более гидрофильным, его усиленное высвобождение из нейронной мембраны в синаптическую щель может опосредовать частый контакт с ионами металлов, такими как цинк и медь, высвобожденными при нейронной передаче (Barnham et al., 2003). Это может способствовать агрегации, зависящей от металлов, и вызывать осаждение Aβ как своего рода семя в довольно чувствительном месте нейрона.

Первоначальная избыточная экспрессия α-спирального Aβ может, таким образом, способствовать как образованию фибрилл, так и зависящей от металла агрегации пептида. В совокупности повышенное количество Aβ1-40 * указывает на специфический для болезни механизм амилоидного осаждения в DLB, вызванный конформационным переходом Aβ при гидрофобных взаимодействиях, вероятно, опосредованным α-синуклеином и повышенным посттрансляционным пептидным окислением.

Хотя сообщалось о невропатологических сходствах между DLB и PDD (Iseki, 2004), остается одно существенное различие: тела Лью в PDD преимущественно локализованы в стволе мозга (Jendroska et al., 1996). Менее частое появление кортикальных тел Леви может способствовать более низкой степени отложения кортикального амилоида в PDD по сравнению с DLB (Mastaglia et al., 2003; Pletnikova et al., 2005), что может быть отражено отдельным нейрохимическим фенотипом среди как нейродегенеративные заболевания в СМЖ. Эти данные соответствуют наблюдению, что большинство пациентов с DLB демонстрируют сходные клинические особенности PDD на более ранней стадии заболевания с выраженным синдромом деменции.

Несмотря на некоторое совпадение, особенно в отношении болезни Альцгеймера и DLB, сообщаемые специфические для болезни нейрохимические фенотипы в CSF указывают на существование различных патофизиологических механизмов метаболизма Aβ-пептидов при болезни Альцгеймера, DLB и PDD. Мы предлагаем исследование пептидных структур Aβ в CSF и гомогенатах головного мозга невропатологически определенных групп пациентов для дальнейшего разъяснения этого аспекта.

Аминокислотная последовательность нового пептида и его вторичной структуры в настоящее время оценивается, но остается неясной. Тем не менее четыре различные линии указания указывают на окисленную и α-спиральную форму мономерного Aβ1-40 в качестве вероятного кандидата для Aβ1-40 *:

Во-первых, двумерная комбинация SDS-PAGE без мочевины, за которой следовал Aβ-SDS-PAGE / immunoblot на основе мочевины (немочевина / мочевина-SDS-PAGE), продемонстрировала Aβ1-40 * для миграции в одной полосе с другими мономерными видами Aβ-пептидов при молекулярной массе приблизительно 4 кДа в отсутствие мочевины и последующем электрофоретическом разделении катодно Aβ1-37 в Aβ-SDS-PAGE / immunoblot. То же самое верно для синтетического Aβ1-40 *, полученного из синтетического Aβ1-40 через SPE. Как и другие мономерные Aβ-пептидные виды, пептид, очевидно, может быть отделен только в результате индуцированных мочевиной пептид-специфических сдвигов при связывании SDS во время Aβ-SDS-PAGE (Kawooya et al., 2003). Олигомеризованные Aβ-пептиды могут быть отделены от мономерной полосы в результате их значительно более высокой массы и соответственно более эффективных эффективных молекулярных радиусов в течение не-мочевины SDS-PAGE. В соответствии с текущей литературой синтетический полноразмерный α-синуклеин оказался мигрирующим с молекулярной массой приблизительно 16 кДа в течение не-мочевины SDS-PAGE. Сообщалось, что в гомогенатах головного мозга у пациентов с DLB два дополнительных пептида мигрируют в диапазоне 12 и 6 кДа, соответственно, в 10% трис / трициновых гелях (Culvenor et al., 1999). Эти пептиды могут быть окрашены только антителом, направленным против области NAC (т.е. не-Aβ-компонента амилоида болезни Альцгеймера) α-синуклеина (Culvenor et al., 1999), предполагая, что пептид NAC проявляет молекулярную массу приблизительно 6 кДа как минимум. Эти данные указывают на мономерную форму пептида Aβ, который должен быть визуализирован катодом Aβ1-37 и сделать SDS-стабильные олигомеры Aβ-пептидов или α-синуклеина и NAC, соответственно, вряд ли спровоцировать эту полосу.

Во-вторых, пептид проявляет свойства не модифицированного амино-Aβ-пептидом. Aβ-IPG-2D-PAGE выявила идентичную изоэлектрическую точку для Aβ1-40 * и других пяти Aβ-пептидов. Во время IEF усеченные на конце аминокислоты Aβ-пептиды (Aβ2-X, Aβ3-X) демонстрируют сдвиг в их изоэлектрической точке одной единицы рН (5,37-6,37) (Wiltfang et al., 2002), тогда как удлинение с аминоконцом Aβ-пептиды (Aβ-12-X), которые образуются после расщепления APP δ-секретазой, перешли бы в более кислую изоэлектрическую точку из-за дополнительной отрицательно заряженной аминокислоты. Напротив, Ct-усечение вплоть до Aβ1-28 или Ct-удлинение до Aβ1-49 не будет влиять на изоэлектрическую точку. Кроме того, была проведена совместная миграция Aβ1-40 * с различными модифицированными карбокси-концевыми синтетическими Aβ-пептидами, которые, как сообщается, происходят in vivo, были исключены в Aβ-SDS-PAGE / иммуноблоттинг на основе мочевины.

В-третьих, амино- и карбокси-конец Aβ1-40 * иммунологически реагируют как Aβ1-40. Aβ1-40 * иммунопреципитирует аминоконтинуальными антителами против Aβ-пептидов (1E8 и 6E10) и с карбокси-терминально-специфическим антителом против Aβ1-40 (13E9), но не с одним против Aβ1-42 (6D5). В противном случае мы исключили кросс-реакции детектирующего антитела 1E8 с синтетическим α-синуклеином во время процедур иммуноблота. Поскольку NAC-пептид считается продуктом расщепления α-синуклеина, кросс-реакция с NAC также маловероятна. В литературе также нет никаких доказательств того, что mAb 1E8 перекрестно реагирует либо с α-синуклеином, либо с пептидом NAC (Culvenor et al., 1999).

В-четвертых, после SPE синтетического Aβ1-40 (синтетический Aβ1-40 *) в гидрофобных условиях была обнаружена полоса с электрофоретическими и иммунологическими особенностями, подобная Aβ1-40 *, которая встречается in vivo. Анализ MALDI-TOF соответствующих фракций выявил два массовых пика, соответствующих ожидаемой молекулярной массе Aβ1-40 и окисленным Aβ1-40 (Aβ1-40ox), соответственно. Анализ MALDI-TOF каждой соответствующей полосы, выбранный из Aβ-SDS-PAGE и обогащенный IP, показал, что синтетическая полоса Aβ1-40 * содержит исключительно массовый пик, соответствующий ожидаемой массе Aβ1-40ox. Синтетическая полоса Aβ1-40 проявляет преимущественно массовый пик, соответствующий ожидаемой массе неокисленного Aβ1-40, хотя незначительные количества Aβ1-40ox могут быть непоследовательно также обнаружены здесь. Соответственно, окисление Aβ1-40, вероятно, способствует его измененному миграционному поведению в Aβ-SDS-PAGE. Кроме того, вышеприведенные данные сильно свидетельствуют о том, что гидрофобные взаимодействия и, вероятно, последующее образование устойчивой α-спирали Aβ1-40 (Giacomelli et al., 2003, 2005), полностью участвуют в генерации Aβ1-40 *. Две α-спирали, охватывающие позиции 16-24 и 28-36 соответственно, были обнаружены в пределах Aβ1-40 (Coles M et al., 1998), первая из которых, как сообщается, является диссонирующей и, без достаточной стабилизации, особенно подвержена к образованию β-многожильных структур (Kallberg et al., 2001; Päiviö et al., 2003). Вторая α-спираль вокруг положения 28-36 дестабилизируется и полностью отменяется в случае окисления met-35, тогда как первая α-спираль остается незатронутой (Watson et al., 1998). Окисление и вторичный структурный переход Aβ1-40 могут изменять пептидспецифическое связывание SDS и, таким образом, объяснять его измененное миграционное поведение во время электрофореза на основе мочевины (Kawooya et al., 2003).

В настоящее время мы применяем круговую дихроизмную спектроскопию для подтверждения нашей гипотезы.

Данные наглядно демонстрируют, что образцы пептида CSF Aβ варьируются в зависимости от заболевания между болезнью Альцгеймера, DLB, PDD и нейропсихиатрическими заболеваниями. Тем не менее, недостаточно доказательств того, что Aβ-пептидные структуры являются единственным биомаркером для дифференциального диагноза среди трех исследованных деменций. В соответствии с критериями рекомендаций международной консенсусной группы (Wiltfang et al., 2005), образцы Aβ-пептида наиболее близки, но не соответствуют требованиям (например, чувствительность и специфичность выше 85%). Тем не менее, используя значение отсечки 0,848 для отношения Aβ1-42 / Aβ1-37, можно было бы получить разумную точность при распознавании болезни Альцгеймера от НДЦ (то есть 87% чувствительности и специфичности). Ранее сообщаемая чувствительность к обнаружению болезни Альцгеймера и специфичности для исключения DLB, соответственно, не превышала 75% в комбинированном анализе иммуноферментного анализа tau и Aβ 1-42 (ELISA) (Andreasen et al., 2001). Таким образом, фактическое дифференциальное диагностическое значение Aβ-пептидных структур можно считать столь же важным, как и установленные ELISA для tau и Aβ1-42. Более того, поскольку многопараметрические подходы приобретают все большее значение в ранней и дифференциальной диагностике деменций (Lewczuk et al., 2004; Wiltfang et al., 2005), оценка пептидных структур Aβ может помочь диагностировать нейрохимический диагноз деменции в сочетании с другими биомаркерами ( например, тау и фосфотау) (Wiltfang et al., 2005).

Хотя Aβ-SDS-PAGE / immunoblot является высокочувствительным методом (Wiltfang et al., 2002), очень низкая концентрация CSF Aβ1-40 * в некоторых случаях близка к уровню обнаружения. Это можно считать основным недостатком теста, что, скорее всего, способствует увеличению дисперсии значений и, следовательно, к потере точности. В отношении этой проблемы предварительная концентрация пептидов Aβ из CSF с использованием высокодействующего и воспроизводимого N-терминально-специфичного IP (Wiltfang et al., 2002) до Aβ-SDS-PAGE / иммуноблотта обещает улучшенную точность теста. Кроме того, необходимо учитывать, что у исследованных пациентов с ПДД все были представлены две или три основные функции, необходимые для диагностики вероятного DLB (McKeith et al., 1996). Дифференциация между вероятными DLB и PDD, которая не обладает дополнительными основными особенностями DLB (например, флуктуациями или галлюцинациями), могла бы выявить более высокую точность теста.

Следовательно, тест следует переоценить с использованием иммунопреципитированных образцов CSF невропатологически определенных заболеваний Альцгеймера, пациентов с DLB и PDD, чтобы определить, действительно ли Aβ1-40 * будет использоваться в качестве нового нейрохимического маркера деменции.

Дополнительные данные доступны в Brain онлайн.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

M.B., P.L., H.E., J.K., M.O. и J.W. поддерживаются грантом гранта BMBF (Федеральное министерство образования и науки Германии), «Компенсационная чистая слабоумия» (01GI0102); J.W. и P.L. поддерживаются фондами ELAN-программ Университета Эрланген-Нюрнберг; М.Б. поддерживается Исследовательской программой медицинского факультета, Георг-Август-Университет Геттинген; и M.O. и J.W. поддерживаются исследовательским центром CMPB / DFG. P.L. и J.W. поддерживаются финансируемым BMBF грантом NGFN2 (проект № PPO-S10T10).

Авторы выражают благодарность Сабине Пол, Биргит Отте, Хайке Заху и Николаусу Кунцу за отличную техническую помощь.

источник

Партнерская программа НПЦРиЗ позволяет приобретать пептидную продукцию со значительными скидками, используя возвратные бонусы.

Чтобы получить партнёрский номер нажмите на ссылку

Лечение женского и мужского бесплодия, а также заболеваний репродуктивной системы ПЕПТИДНЫМИ препаратами

Лечение, профилактика болезней, продление молодости ПЕПТИДАМИ НПЦРиЗ

КАРТАЛАКС® применяется при лечении остеохондроза позвоночника, остеоартроза, остеопороза, после травм и переломов, а также в профилактике склеротических и дегенеративных процессов в позвоночнике и суставах у людей пожилого и старческого возраста.

СИГУМИР® восстанавливает функции опорно-двигательного аппарата при патологических состояниях, приводящих к нарушениям в хрящевой или костной ткани, а также после различных перенесенных заболеваний.

Что такое ПЕПТИДЫ ?
Где купить пептиды ?
Как принимать пептидные препараты ?
Зачем нужны пептидные биорегуляторы ?
Где разрабатывают новые пептидные комплексы ?
Почему «пептиды Хавинсона» ?

ХАВИНСОН В. Х. — директор Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии

Болезнь Альцгеймера — наиболее распространённая форма деменции, нейродегенеративное заболевание, впервые описанное в 1907 году немецким психиатром Алоисом Альцгеймером. Как правило, она обнаруживается у людей старше 65 лет, но существует и ранняя болезнь Альцгеймера — редкая форма заболевания. Общемировая заболеваемость на 2006 год оценивалась в 26,6 млн человек, а к 2050 году число больных может вырасти вчетверо.

Как правило, болезнь начинается с малозаметных симптомов, но с течением времени прогрессирует. Наиболее часто на ранних стадиях распознаётся расстройство кратковременной памяти, например, неспособность вспомнить недавно заученную информацию. С развитием болезни происходит потеря долговременной памяти, возникают нарушения речи и когнитивных функций, пациент теряет способность ориентироваться в обстановке и ухаживать за собой. Постепенная потеря функций организма ведёт к смерти. При обращении к врачу и подозрении на болезнь Альцгеймера для уточнения диагноза обычно анализируют поведение, проводят серию когнитивных испытаний, если возможно, проводится магнитно-резонансная томография. Индивидуальный прогноз затруднён из-за вариаций в длительности течения болезни, которая может развиваться скрыто на протяжении длительного времени, прежде, чем станут заметны симптомы и будет поставлен диагноз. Средняя продолжительность жизни после установления диагноза составляет около семи лет, менее трёх процентов больных живут более четырнадцати лет. В настоящее время не достигнуто полного понимания причин и хода болезни Альцгеймера. Ключевыми особенностями болезни являются накопление амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков в тканях мозга. Современные методы терапии лишь несколько смягчают симптомы, но пока не позволяют ни остановить, ни замедлить развитие заболевания.

Чтобы выбрать необходимые препараты надо ознакомиться с рекомендованным курсом лечения болезни Альцгеймера

Лечение 1-й месяц:

Лечение 2-й — 3-й месяц:

Лечение 4-й месяц:

ПК-2	4-6 капель наружно 1 раз в день

Ниже можно видеть препараты, предназначенные для лечения и профилактики заболеваний нервной системы.

источник

Владельцы патента RU 2558242:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептидным терапевтическим средствам, и может быть использовано в медицине. Получен биологически активный пептид, обладающий лечебным действием против болезни Альцгеймера и состоящий из последовательности аминокислот Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala. Изобретение позволяет использовать полученный пептид для создания препарата, эффективного в терапии болезни Альцгеймера. 1 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к новому биологически активному соединению — пептиду, обладающему лечебным действием против болезни Альцгеймера, и может быть использовано для создания препарата для терапии болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгейметра (БА) представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к потере памяти, психическим расстройствам и неизбежной смерти. В настоящее время в медицинской практике применяют препараты для симптоматического лечения БА методами компенсаторной терапии. Использование этих препаратов позволяет в некоторой мере задержать процесс прогрессирования болезни, но не излечить ее.

Наиболее широко применяемым классом препаратов являются ингибиторы холинэстераз (ИХЭ). ИХЭ увеличивают время действия нейромедиатора ацетилхолина на постсинаптические рецепторы, что ведет к увеличению холинергической иннервации. Эффективность применения ИХЭ существенно снижается на поздних стадиях БА. ИХЭ характеризуются достаточно высокой токсичностью и рядом других побочных эффектов [Watkins, P. B. et all. J. Am. Med. Assoc. 1994. V. 271. P. 992-998]. Известен препарат другого класса для симптоматического лечения БА — модулятор глутаматэргической системы, мемантин [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008. V. 148 (5). P. 379-397]. Наилучшие результаты дает его применение у больных с мягкой и умеренной деменцией альцгеймеровского типа, вместе с тем, препарат не обеспечивает полного излечивания БА. Важным недостатком компенсаторной терапии является то, что разрабатываемые внутри данного направления методы не воздействуют на механизм развития БА. Поэтому интенсивные исследования ведутся по поиску лекарств для радикальной терапии БА, способные не только компенсировать симптоматические нарушения, но и излечивать заболевание.

Одна из современных гипотез предполагает, что пептиды β-амилоидного ряда, в частности βА-(1-42) в результате нарушения обменных процессов способны образовывать скопления в центральной нервной системе в виде амилоидных бляшек, что приводит к разрушению мозговой ткани [Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 2002. V. 297 (5580). P. 353-356].

В последние годы активно разрабатывались иммунотерапевтические методы предотвращения развития БА, направленные на коррекцию содержания в организме βА. Инъекции препаратами на основе βА вызывают образование специфических антител, которые способствуют удалению βА из мозга [Shenk D., Barbour R., Dunn W. Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. // Nature. 1999. V. 400( 6740). P. 173-177]. Ведущими западными фирмами разработано несколько препаратов [www.affiris.com/press_releases/press_release_mimoVAX_dec_11_06.pdf; www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00411580], однако, ни один из них не прошел успешно клинические испытания. Исследования были приостановлены в связи с тем, что у 6% пациентов, которые получали инъекцию бета-амилоида, обнаружился асептический менингоэнцефалит [Shenk D. Amyloid-β immunotherapy for Alzheimer′s disease: the end of the beginning. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V. 3 (10). P. 824-828; Senior K. Dosing in Phasell trial of Alzheimer′s vaccine suspended. Lancet. Neurol. 2002. V. 1 (1). P. 3; Orgogozo J.M., Gilman S., Dartigues J.F., Laurent В., Puel M., Kirby L.C., Jouanny P., Dubois В., Eisner L., Flitman S., Michel B.F., Boada M., Frank A., Hock C. Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Aβ_1-42 immunization. Neurology. 2003. V. 61 (1). P. 46-54]. Данные результаты ставят под сомнение безопасность использования препаратов на основе βА в качестве иммунотерапевтических средств.

Принципиально новым подходом является использование фрагментов белка рецептора конечных продуктов гликозилирования (RAGE) для лечения БА. Рецептор RAGE характеризуется многофункциональностью, способен специфически связываться со многими лигандами, участвует в процессах роста клеток нервной системы, а при гиперэкспрессии в пожилом возрасте способствует развитию ряда патологий, таких как сахарный диабет, рост опухолей, болезнь Альцгеймера. Предполагают, что связывание рецептора RAGE с β-амилоидом способствует проникновению последнего через гематоэнцефалический барьер центральной нервной системы и накоплению в виде амилоидных бляшек — основной причины болезни Альцгеймера [Leclerc Е., Sturchler Е., Vetter S. The S100B/RAGE Axis in Alzheimer′s Disease. Cardiovasc. Psychiatry Neurol. 2010. V. 2010. P. 1-11]. Помимо RAGE, закрепленного в мембране и связывающегося с бета-амилоидом на поверхности нейронов мозга, в крови имеется также растворимая форма RAGE, состоящая из внеклеточной части белка. Растворимый RAGE, связывая бета-амилоид и препятствуя его проникновению в мозг, проявляет протективное действие и восстанавливает состояние пространственной памяти у экспериментальных животных. [Deane R., Du Yan S, Submamaryan RK, LaRue B, Jovanovic S, Hogg E, Welch D, Manness L, Lin C, Yu J, Zhu H, Ghiso J, Frangione B, Stern A, Schmidt AM, Armstrong DL, Arnold B, Liliensiek B, Nawroth P, Hofman F, Kindy M, Stern D, Zlokovic B. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nature medicine. 2003. V. 9. P. 907-913]. Эти данные служат теоретическим обоснованием нашей гипотезы о том, что введенный в организм фрагмент RAGE будет способен восстанавливать пространственную память животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента препаратов, обладающих лечебным действием против болезни Альцгеймера.

Поставленная задача решается за счет пептида, обладающего лечебным действием против болезни Альцгеймера, формулы

Сущностью изобретения является новый пептидный фрагмент белка RAGE формулы Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (I), получаемый с помощью стандартных методик пептидного синтеза. Предлагаемый препарат относится к терапевтическим средствам лечения БА. При интраназальном введении заявляемый синтетический пептид связывается с β-амилоидом и препятствует формированию комплекса, способного проникать через гематоэнцефалический барьер. Техническим результатом изобретения является отсутствие побочных эффектов при использовании пептида, высокая терапевтическая эффективность.

Интраназальное введение заявляемого препарата (I) препятствует ухудшению пространственной памяти у числа животных с экспериментально индуцированной формой БА. Вместе с тем введение данного пептида не приводит к ухудшению пространственной памяти у контрольных животных.

В качестве модели БА используют мышей, перенесших операцию удаления обонятельных луковиц головного мозга (ольфакторной бульбэктомии), после которой у животных развиваются морфологические и поведенческие признаки БА.

Синтез целевого продукта осуществляют твердофазным методом с использованием алкоксибензильного полимера. Конденсации осуществляют при помощи гексафторфосфата бензтриазол-1-ил-N-окси-бис(диметиламино)урония. Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования используют трифторуксусную кислоту с добавкой тиоанизола, фенола, этандитиола, триизопропилсилана и воды.

Структуру и гомогенность целевого продукта подтверждают данными аминокислотного анализа, масс-спектра и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример 1. Синтез пептида Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.

0,3 г алкоксибензильного полимера с содержанием ОН-групп 0,5 ммоль/г полимера помещают в проточный реактор, промывают диметилформамидом (2×10 мл), снова добавляют 10 мл диметилформамида и оставляют набухать в течение 5-10 мин, затем диметилформамид удаляют. Синтез пептида ведут в проточном реакторе при комнатной температуре.

Операция 2. Получение Fmoc-Ala — полимера (I).

В 4 мл диметилформамида растворяют 0,467 г (1,5 ммоль) Fmoc-Ala-OH, добавляют 116 мкл (0,75 ммоль) N,N′-диизопропилкарбодиимида и 1,8 мг (0,015 ммоль) 4-диметиламинопиридина. Раствор перемешивают при температуре 0°C. Через 10 мин раствор добавляют к алкоксибензильному полимеру, находящемуся в проточном реакторе. Полученную смесь выдерживают при периодическом перемешивании 12 часов. Полученный Fmoc-Ala-полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл) и снова диметилформамидом (2×10 мл). Непрореагировавшие аминогруппы ацилируют смесью 2 мл уксусного ангидрида, 2 мл пиридина и 6 мл диметилформамида в течение 2 ч. Промывки повторяют. Содержание Fmoc-Ala в продукте составляет 1,05 ммоль на 0,3 г полимера.

Операция 3. Получение Fmoc-Val-Ala-полимера (II).

а) Полученный Fmoc-Ala — полимер (I) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,153 г (0,45 ммоль) Fmoc-Val-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 4. Получение Fmoc-Ser(Bu t )-Val-Ala-полимера (III).

а) Fmoc-Val-Ala-полимер (II) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,173 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(Bu t )-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 5. Получение Gmoc-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (IV).

а) Ser(Bu t )-Val-Ala-полимер (III) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,185 г (0,45 ммоль) Fmoc-Asp(Bu t )-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 6. Получение Fmoc-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (V).

а) Fmoc-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (IV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полученный полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 7. Получение Fmoc-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (VI).

а) Fmoc-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (V) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,152 г (0,45 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 8. Получение Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (VII).

а) Fmoc-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (VI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,134 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 9. Получение Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (VIII).

а) Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (VII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 10. Получение Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (IX).

а) Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (VIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) JV-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 11. Получение Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (X).

a)Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (IX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,166 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gln-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 12. Получение Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (XI).

а) Fmoc-Gln-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (X) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 13. Получение Fmoc-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )Val-Ala — полимера (XII).

а) Fmoc-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (XI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,172 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(Bu t )-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 14. Получение Fmoc-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (XIII).

а) Fmoc-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (XII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 15. Получение Fmoc-Val-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (XIV).

а) From-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (XIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 16. Получение Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-SerBu t )-Val-Ala — полимера (XV).

a) Fmoc-Val-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (XIV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,211 г (0,45 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 17. Получение Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (XVI).

a) Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (XV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 18. Получение H-Ala-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Тrp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимера (XVII).

a) Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu t )-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu t )-Ser(Bu t )-Val-Ala — полимер (XVI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,140 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ala-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 19. Получение целевого пептида Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (XVII). 0,3 г пептидил-полимера (XVI) обрабатывают 4 мл смеси трифторуксусная кислота-тиоанизол-фенол-вода-этандитиол-триизопропилсилан в объемном соотношении 81,5:5:5:5:2,5:1 в течение 2 ч. Полимер отфильровывают, раствор упаривают, сухой остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (2×50 мл). Растворяют в 10-% уксусной кислоте и очищают на препаративной ВЭЖХ при следующих условиях: колонка Phenomenex (США) Jupiter 10µ С18 300А (250×10 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б — 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента — 3 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм. Собранную после ВЭЖХ фракцию, содержащую целевой продукт лиофилизуют.

Данные аминокислотного анализа Asp 1,0 (1), Ser 1,8 (2), Glu 1,1 (1), Pro 1,7 (2), Gly 3,3 (3), Ala 1,8 (2), Val 2,0 (2), Leu 1,0 (1), Lys 1,0(1).

По данным масс-спектрометрии MH+1755. По данным аналитической ВЭЖХ время удерживания составляет 23,65 мин, условия: колонка Phenomenex (США) Jupiter 5µ С18 300А (250×4,6 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б — 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента — 1 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм.

Пример 2. Проведение биологических испытаний. Эксперименты проводят на мышах NMRI весом 20-30 г.

а) Операцию ольфакторной бульбэктомии проводят в стерильных условиях под гексеналовым наркозом (40 мг/кг внутрибрюшинно) с применением 0,5% раствора новокаина для местного обезболивания при скальпировании. Двустороннее удаление обонятельных луковиц проводят путем аспирации через трепанационное отверстие. Контрольных животных подвергают аналогичной манипуляции, но без удаления обонятельных луковиц.

б) Из пептида, полученного по изобретению, готовят раствор в концентрации 5 мг/мл в физрастворе и через две недели после операции ольфакторной бульбэктомии начинают вводить мышам интраназально в объеме 4 мкл на одно животное ежедневно.

в) Через 4 недели после операции ольфакторной бульбэктомии проводят обучение животных в водном лабиринте Морриса. Экспериментальная камера представляет собой пластиковый круглый бассейн с диаметром 80 см, заполненный на 30 см водой с температурой 23°С. Площадь бассейна условно делится на четыре равных сектора, в одном из которых находится спасательная платформа диаметром 5 см. Вода забеляется молоком для того, чтобы животные не могли визуально обнаружить спасательную платформу.

Для опытов отбирают мышей, умеющих хорошо плавать и быстро находить спасательную платформу. В течение 5 дней проводят по четыре сеанса обучения ежедневно. В результате всех животных обучают находить спасательную платформу менее, чем за 10 сек. Затем в течение одной минуты у животных тестируют уровень пространственной памяти при отсутствии спасательной платформы. Состояние пространственной памяти каждого животного оценивают по его способности помнить отсек обучения и выделять его из 3-х других отсеков. В течение 1 минуты учитывают время пребывания животных в каждом отсеке. Обучившимися считают животных, время нахождения которых в отсеке обучения достоверно превышает время нахождения в каждом из других отсеков.

Результаты биологических испытаний заявляемого препарата приведены на рис. 1.

В ходе биологических испытаний показано, что бульбэктомированные мыши, интраназально получавшие дозу исследуемого пептида (I) выделяли (находили) сектор со спасательной платформой (сектор 3) достоверно чаще по сравнению с бульбэктомированными мышами, не получавшими дозу пептида (I). Аналогичные результаты получены при измерении времени нахождения животных в секторе 3. Также показано, что интраназальное введение пептида (I) не ухудшает пространственную память ложнооперированным мышам.

г) Токсичность полученного пептида исследуют на экспериментальных животных в системе in vivo. Исследование проводят на линейных мышах линии Balb/c весом 20 г с использованием максимальной дозы пептида 1 мг, вводимой подкожно. Животных держат под наблюдением в течение суток. По результатам наблюдения острой токсичности исследуемого препарата не выявлено.

Таким образом, получен новый пептид формулы Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala, который обладает лечебным действием против болезни Альцгеймера.

Пептид, обладающий лечебным действием против болезни Альцгеймера, формулы:
Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.

источник

Пептиды от болезни альцгеймера

Партнерская программа НПЦРиЗ позволяет приобретать пептидную продукцию со значительными скидками, используя возвратные бонусы.

Добавить комментарий Отменить ответ