Бешенство у лабораторных мышей

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БЕШЕНСТВА

(утверждены 27 февраля 1970 г., б/н)

1. Диагноз на бешенство ставят на основании комплекса эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и главным образом — на основании лабораторных исследований.

2. Для исследования направляют в лабораторию с нарочным: свежий труп или голову от собаки (кошки, лисицы, песца, овцы, теленка и др.), от крупных животных — голову или головной мозг (свежий или консервированный в 30 — 50 %-ном растворе глицерина). Для серологических исследований пригоден только неконсервированный мозг.

3. Лабораторная диагностика бешенства заключается в микроскопическом исследовании головного мозга (с целью обнаружения телец Бабеша-Негри), серологическом (обнаружение специфического рабического антигена), а также в постановке биологической пробы на белых мышах или кроликах.

4. Из головного мозга, поступившего для исследования, делают сначала засев на питательные среды. Часть мозга сразу же помещают в холодильник и сохраняют на случай необходимости повторного исследования. Из оставшейся части мозга берут материал для микроскопического исследования, серологических реакций и биологической пробы.

Примечание . Вскрытие трупа, изъятие мозга и другие работы проводят в стерильных условиях при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, защита рук двумя парами перчаток: хирургическими и анатомическими; для защиты глаз надевают очки, а нос и рот закрывают марлевой повязкой).

5. Для микроскопического исследования делают отпечатки и мазки из разных участков головного мозга.

6. Для приготовления отпечатка кусочки головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в 4 — 6 слоев. К поверхности среза несколько раз (3 — 4) подряд прикасаются чистым предметным стеклом, слегка надавливая, чтобы на стекле получился тонкий отпечаток.

7. Мазки делают из тех же участков головного мозга. Для этого кусочки мозга растирают в фарфоровой ступке пестиком или в пробирке стеклянной палочкой до образования гомогенной массы, из которой делают грубые мазки на обезжиренном предметном стекле.

Можно делать мазки и другим способом. Для этого небольшой кусочек мозга кладут на край предметного стекла, а другим стеклом раздавливают его и размазывают от одного края до другого, в результате чего на поверхности стекла получается тонкий равномерный мазок.

8. Полученные мазки или отпечатки окрашивают одним из следующих способов:

а) окраска по Муромцеву. Изготовленные, еще влажные мазки или отпечатки сразу же фиксируют в этиловом или метиловом спирте или в смеси спирта пополам с эфиром или ацетоном (химически чистым) в течение 1 — 2 ч и после этого промывают водой. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После промывания водой влажные мазки помещают на 5 — 10 мин в раствор краски Мансона, разведенной водой 1:40. Затем краску сливают и тут же мазки погружают в 10 %-ный водный раствор танина на 8 — 10 мин до появления голубоватой окраски. После этого мазки промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном (химически чистым) или спирта с ксилолом й снова высушивают фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон, при этом ядра нервных клеток окрашиваются в синий цвет, а тельца Бабеша-Негри — в бледно-фиолетовый с темными включениями;

б) окраска по Селлерсу. На приготовленный влажный отпечаток или мазок наносят на 4 — с смесь реактива «А» (метиленовый синий — 2 г, метиловый спирт без ацетона — 100 мл) и реактива «Б» (основной фуксин — 0,5 г, этиловый спирт без следов ацетона — 100 мл). Рабочий раствор красителя состоит из 15 мл реактива «А», 2 — 4 мл реактива «Б» и 25 мл метилового спирта. После окраски препарат промывают проточной водой и высушивают. В окрашенном мазке цитоплазма нейронов ярко-синяя, ядрышки темно-синие, эритроциты кирпично-красные, тельца Бабеша-Негри пурпурно-красные с отчетливо видной базофильной структурой телец;

в) окраска по Михину. Мазки или отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира (поровну) в течение 5 — 10 мин, после чего их просушивают фильтровальной бумагой и окрашивают в течение 30 — 40 мин краской Гимза (1 — 2 капли на 1 мл дистиллированной воды), быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96°-ного спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и подвергают исследованию. Если материал был в глицерине, то его предварительно хорошо прополаскивают в воде и просушивают фильтровальной бумагой.

В окрашенном препарате при микроскопическом исследовании основной фон должен быть красным с фиолетовым оттенком. При преобладании синего тона мазок снова обмывают подкисленным спиртом и промывают водой. Пирамидальные нервные клетки имеют синеватый цвет с интенсивно черным ядром, а тельца Бабеша-Негри — розово-красный с точечными включениями темно-синего цвета;

г) окраска по Борману-Гайнуллиной. Тонкие мазки или отпечатки в течение 5 мин фиксируют в смеси следующего состава: спирта и эфира (поровну) — 98 мл, ледяной уксусной кислоты — 2 мл; после фиксации их погружают на 5 мин в 10 % -ный раствор кристаллической соды, а затем промывают водой и просушивают на воздухе. Зафиксированные мазки в течение 2 мин окрашивают краской, приготовленной перед ее употреблением (насыщенного водного раствора метиленовой сини — 3 капли, насыщенного основного раствора фуксина — 2 капли, водопроводной воды — 20 мл). Раствор краски наливают на мазок, фиксируют над пламенем горелки, затем краску оставляют еще на одну минуту, после чего промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. В окрашенном мазке основной фон должен быть ярко-красным, протоплазма нервных клеток окрашивается в красновато-синий цвет, а их ядра — в темно-синий, тельца Бабеша-Негри окрашиваются в землянично-красный цвет с типично гранулярной структурой. Эритроциты имеют вид неокрашенных кружочков.

9. Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Реакция применяется для обнаружения специфического рабического антигена в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, а также у животных, на которых ставилась биопроба. Для реакции можно использовать несвежий (до 1 мес.) головной мозг.

Реакцию выполняют на предметных обезжиренных стеклах, на которые наносят 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 60 °С агарового геля, приготовленного по прописи: сухой агар-агар — 12 — 15 г; химически чистый хлористый натрий — 8,6 г; 1 %-ный раствор (фильтрованный) метилоранжа на 50°-ном спирте — 5 — 10 мл; мертиолят — 0,01 г; вода дистиллированная — 1 л.

Примечание . Для постановки реакции лучше употреблять агар-агар фирмы «Дифко», он полностью растворяется, фильтрование среды не требуется. Другие сорта агар-агара требуют тщательной фильтрации.

После застывания агара в нем делают лунки с помощью тонкостенной металлической или стеклянной трубочки с внутренним диаметром 4 — 5 мм, располагая их согласно трафарету (см. рис. 4 — 7).

Для реакции у крупных животных используют кусочки головного мозга — аммонов рог, кору полушарий, мозжечок, продолговатый мозг; у крыс, сусликов, морских свинок, хомяков и др. — три каких-либо отдела мозга; у мышей — весь головной мозг.

Схема постановки микропреципитации:
А — кора (левое полушарие); В — кора (правое полушарие); С — аммонов рог (левый);
Д — аммонов рог (правый); Е — мозжечок; Ж — продолговатый мозг;
1, 2, 3, 4 — разведений глобулина, соответственно 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Положительная РП со всеми разведениями глобулина
(кора головного мозга овцы, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:4; 1:8, 1:16
(аммонов рог собаки, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:16,
отсутствуют линии преципитации с разведениями 1:2, 1:4,
(продолговатый мозг собаки, уличное бешенство)

Мозг растирают в фарфоровой ступке пестиком или в самой черепной коробке в «пасту», которой заполняют луночки для антигена. Остальные луночки заполняют преципитирующим антирабическим глобулином в разведении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Объем используемых ингредиентов составляет 0,02 мл.

Контроли с положительными и отрицательными антигенами ставят одновременно на отдельном стекле с использованием того же агара по тому же трафарету.

После того как ингредиенты реакции помещены в соответствующие луночки, предметные стекла переносят во влажную камеру (чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой или ватой) и ставят в термостат на 6 ч при температуре 37 — 38 °С. Затем чашки оставляют при комнатной температуре еще на 18 ч.

Учет реакции проводят через 3, 6 и 24 ч после ее постановки. Во избежание высыхания агара стекла с реакцией после каждого просмотра помещают в те же чашки Петри, содержащие увлажненную вату.

При положительной реакции преципитации в агаре между лунками с глобулином и антигеном могут образовываться одна, две и очень редко три параллельно расположенные линии преципитации. Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом приблизительно 45°.

При отрицательных показаниях реакции преципитации ставят биопробу.

10. Реакция иммунофлуоресценции. Основана на выявлении специальными микроскопами (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 и др.) вирусного антигена, вступившего в реакцию со специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующим красителем.

Для реакции делают тонкие и равнослойные отпечатки на тщательно обезжиренных стеклах из свежего или свежемороженого головного мозга. Отпечатки готовят из кусочков головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) так же, как и для микроскопического исследования. От каждого кусочка мозга готовят не менее 4 препаратов. Для контроля аналогично делают препараты из мозга здорового животного.

После высушивания на воздухе препараты фиксируют в ацетоне в течение 4 ч при температуре не выше 4 °С. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После фиксации ацетоном наносят на препараты несколько капель конъюгата (флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин) в рабочем разведении. Затем их помещают во влажную камеру (чашку Петри или закрытый эмалированный кювет с увлажненным дном) на 20 — 30 мин при температуре 25 °С.

После этого препараты промывают водой или фосфатным буферным раствором (pH 7,2 — 7,4) в течение 1 ч, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и подвергают исследованию. Препараты просматривают под иммерсионной системой. Для иммерсии используют нелюминесцирующее масло.

В окрашенном препарате при люминесцентной микроскопии мозговая ткань флуоресцирует (светится) тусклым серовато-желтым цветом. Антиген вируса бешенства выявляется в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины — от едва заметных до имеющих 15 — 20 мкм в диаметре.

В контрольном препарате желто-зеленых интенсивно светящихся гранул не отмечается.

При исследовании с помощью метода флуоресцирующих антител диагноз бешенства считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленоватым свечением различной величины. В контроле подобных образований не должно быть.

При отсутствии положительной флуоресценции ставят биологическую пробу.

11. Биологическую пробу на бешенство ставят, если получен отрицательный результат при микроскопическом исследовании (тельца Бабеша-Негри не обнаружены), при серологических реакциях (специфический рабический антиген не выявлен), а также при выявлении атипичных включений. Биологическую пробу проводят на белых мышах или кроликах.

12. Опытных мышей или кроликов заражают 10 %-ной суспензией из исследуемого мозга на физиологическом растворе или мясопептонном бульоне с pH 7,2 — 7,4. Для приготовления суспензии используются те же участки головного мозга, из которых брали материал для микроскопического и серологического исследований.

Вырезанные участки головного мозга собирают в стерильную пробирку и взвешивают, а затем тщательно растирают в ступке пестиком, после чего добавляют физиологический раствор или мясопептонный бульон из расчета получения 10 %-ной суспензии. Полученную суспензию отстаивают в течение 10 мин и для заражения используют надосадочную жидкость.

Если патологический материал был загрязнен, то надосадочную жидкость сливают в другой сосуд (пробирку) и к ней добавляют по 500 — 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл жидкости, после чего отстаивают еще 30 мин при комнатной температуре и затем используют для заражения. Суспензию необходимо готовить в стерильных условиях и при строгом выполнении правил личной профилактики.

Биологическая проба на белых мышах. Для заражения используют белых мышей массой 8 — 10 г. Для каждого исследования берут 6 мышей, из которых 3 заражают в головной мозг, а 3 — подкожно. При заражении в мозг иглу вводят в точке за линией, соединяющей задние углы и немного в стороне от линии, проходящей посередине головы. Место заражения протирают спиртом. Суспензию вводят в дозе 0,03 мл. Для предупреждения глубокого проникновения иглы в мозг на ее кончик надевают ограничитель — небольшой кусочек резиновой трубки, который укрепляют на расстоянии 2 — 3 мм от конца иглы. При подкожном заражении суспензию вводят в область кончика носа (в верхнюю губу) в дозе 0,05 мл. На месте введения суспензии образуется небольшая припухлость. Зараженных мышей помещают в стеклянные банки и наблюдают за ними в течение 30 сут. При положительном результате биологической пробы у мышей обычно на 7 — 15-й день после заражения развивается клиника паралитического бешенства.

Вначале отмечаются вялость, взъерошенность шерсти и своеобразная горбатость, а также нарушение координации движений. Затем наступает паралич задних конечностей, а позднее — передних, переходящих в общий паралич, заканчивающийся смертью. Продолжительность болезни 2 — 3 сут.

С развитием общего паралича мышей умерщвляют при помощи эфирного или хлороформенного наркоза. У павших и убитых мышей вскрывают черепную полость, делают засев из мозга на питательные среды, после чего извлекают головной мозг, из которого готовят препараты для микроскопического и иммунобиологических исследований.

При отсутствии клинических проявлений бешенства у зараженных мышей в течение 30 сут их уничтожают. Банки, в которых они содержались, тщательно дезинфицируют.

Биологическая проба на кроликах. Для постановки биологической пробы берут 4 кроликов массой не менее 1,5 кг каждый. 2 кроликов заражают в мозг и 2 внутримышечно в области бедра. Суспензию вводят интрацеребрально в дозе 0,2 мл, а внутримышечно — в дозе 2 мл.

При положительном результате биологической пробы кролики заболевают в течение 16 — 21 дня. Заболевание бешенством протекает у кроликов в тихой паралитической форме со смертельным исходом. У павших кроликов извлекают головной мозг и дальнейшее исследование проводят так же, как и при заражении мышей. Наблюдение за кроликами ведут в течение 45 — 50 сут. По истечении указанного срока кроликов уничтожают. Клетки, в которых содержались подопытные животные, дезинфицируют.

1 Гистологическое исследование используют в качестве дополнительного метода

Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога, коры полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и фиксируют в одной или двух порциях ацетона так, чтобы продолжительность фиксации была в пределах 6 — 18 ч.

Лучше фиксацию в ацетоне оставлять на ночь. Затем патматериал проводят через две порции ксилола, выдерживая по 30 мин в каждой, и через две порции парафина — по 1 ч в каждой. Готовые срезы депарафинируют обычным методом и окрашивают по Ленцу или Туревичу:

— окраска по Ленцу. Срезы окрашивают раствором эозина 1 — 3 мин (0,5 г эозина растворяют в 100 мл 60°-ного этилового спирта). Эозин быстро смывают водой и в течение 1 мин окрашивают метиленовой синькой Лефлера, промывают водой, осторожно подсушивают фильтровальной бумагой и дифференцируют раствором ед. кого натра в абсолютном спирте (5 капель едкого натра на 30 мл спирта) до бледно-розового цвета. На препарат наливают раствор уксусной кислоты (1 капля ледяной уксусной кислоты на 60 мл абсолютного спирта) и держат до появления слабо-синей окраски, быстро смывают спиртом и просветляют ксилолом в течение 4 — 5 мин. Тельца Бабеша-Негри окрашиваются в ярко-красный цвет с синими включениями, цитоплазма ганглиозных клеток — в бледно-голубой;

— окраска по Туревичу. Депарафинированные срезы сразу после проводки через спирты и дистиллированную воду окрашивают гематоксилином Вейгерта или Эрлиха, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1 %-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дистиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После промывки обрабатывают смесью (в равных частях) насыщенного водного раствора пикриновой кислоты (на 1 л горячей дистиллированной воды 25 — 30 г пикриновой кислоты) и 96°-ного спирта. При обработке наблюдают отхождение облачков красной краски, и срезы через 10 — 20 с приобретают желтый оттенок. Срезы быстро прополаскивают в воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой. Затем так же быстро проводят через абсолютный или 96°-ный спирт, карбол-ксилол, чистый ксилол и заключают в бальзам. Тельца Бабеша-Негри — вишнево-красного цвета, ядра клеток — черные или синие в зависимости от того, каким гематоксилином они окрашены. По форме и величине тельца Бабеша-Негри весьма разнообразны, находятся в цитоплазме и отростках нервных клеток в виде многочисленных или одиночных экземпляров. Чаще тельца Бабеша-Негри обнаруживают в крупных ганглиозных клетках, причем клетки, содержащие их, не имеют выраженных признаков дегенерации.

Нередко обнаруживают другие включения, которые из-за ряда сходных признаков иногда принимают за тельца Негри. Следует иметь в виду, что в мозге здоровых кошек и белых мышей иногда содержатся неспецифические ацидофильные тельца-включения. Эти тельца можно отдифференцировать от телец Негри по отсутствию внутренних гранул и гомогенности основной субстанции.

Для бешенства также характерны признаки острого энцефаломиелита: преимущественно вокруг мелких вен обнаруживают периваскулярные инфильтраты, состоящие в основном из лимфоидных клеток, имеющих вид клеточных муфт.

В ганглиозных клетках головного мозга могут быть хроматолиз, вакуолизация и острое набухание клеток, а также гибель отдельных клеток. В области поврежденных нервных клеток довольно постоянна пролиферативная реакция глии, принимающая форму истинной нейронофагии с последующим замещением нервных клеток элементами размножившейся глии. Такое скопление клеток пролиферата на месте распавшейся нервной клетки носит название «узелка бешенства» — на срезе иногда можно проследить процесс развития узелка (1).

источник

Бешенство (Б) – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением ЦНС. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных регионах земного шара. Не отмечено случаев распространения болезни в Австралии, Великобритании, Японии. Заболевание почти всегда заканчивается смертью. Имеются фактически документированные случаи выздоровления от бешенства человека и собак после экспериментальной инфекции.

Вирус бешенства (ВБ) относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В настоящее время установлено, что ВБ имеет 4 серотипа, что обусловлено, видимо, различием в составе мембранных белков. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности. ВБ обладает ГА и ГАД свойствами. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА, антиГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) АТ.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений (они имеют меньшее значение) и, главным образом, результа­тов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного АГ в ИФ, РДП, обнаружении те­лец Бабеша — Негри и биопробе на белых мышах.

В Российской Федерации в настоящее время организовано производство наборов для диагностики Б в ИФ и РДП в ВНИТИБП и КазНИВИ.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мел­ких животных, от крупных животных — голову или головной мозг. В некоторых случаях до­пускается консервирование головного мозга в 50%-ном глицерине. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в полиэтиленовый мешок, мозг — в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитой парафином. Материал упаковывается во влагонепроницае­мую тару. Для вирусологических исследований пригоден только не консервированный мозг. Необходимо помнить, что вскрытие трупа, извлечение мозга и другие операции с патологи­ческим материалом следует проводить в условиях стерильности и строгого соблюдения мер личной профилактики: прочно фиксируют голову животного, защищают руки 2-мя парами перчаток (хирургические и анатомические), для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот-6-слойную марлевую повязку.

Лабораторные исследования материала на бешенство проводят вне всякой очереди; результаты немедленно сообщают врачу хозяйства и главному врачу района (города).

Индикация и идентификация вируса. Порядок проведения исследований: из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого) готовят по 4 мазка-отпечатки для ИФ и обнаружения телец Бабеша — Негри; с мозговой тканью ставят РДП; при отрицательных результатах ставят биопробу.

Обнаружение специфических телец-включений. Мазки-отпечатки окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматрива­ют в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша — Негри (при окраске по Селлерсу — четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплаз­ме, при окраске по Муромцеву — светло-фиолетовые с темно-синими включениями тельца Бабеша — Негри, чаще они расположены вне нервных клеток.

Наиболее характерная особенность телец Бабеша — Негри — их внутренняя структура, по­зволяющая абсолютно точно дифференцировать их. Внутри видны маленькие зернышки — базофильные зернистости темно-голубого, даже черного цвета величиной 0,2-0,5 мкм.

Диагностическая ценность обнаружения телец-включений для доказательства заражения ВБ общепризнана. Однако и у здоровых животных, в особенности у кошек и белых мышей, имеются образования, присутствие которых может вызвать диагностические затруднения. В отдельных случаях в мозге кошки можно с уверенностью дифференцировать подобные включения от телец Бабеша — Негри, и здесь рекомендуется воспользоваться методами иден­тификации, в особенности ИФ. Равным образом и у собак, погибших в результате отравле­ния змеиным ядом или поражения электрическим током, можно найти тельца-включения, напоминающие тельца Бабеша – Негри. Тельца Бабеша — Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом, и материал исследу­ется в других тестах (ИФ, РДП, биопроба).

ИФ. Один из основных тестов при диагностике Б. При высококвалифицированном вы­полнении получают в 99-100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюоресцирующего Ig. Фиксацию препаратов в охлажденном (8-10°С) ацетоне проводят не менее 4-х ч. В качестве отрицательного контроля используют мазки-отпечатки головного мозга здоровых белых мышей. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микро­скопе на основе оценки интенсивности свечения комплекса АГ-АТ. АГ ВБ выявляется в ви­де ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаружи­вают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек, В контроле подобного свечения не должно быть.

Для доказательства специфичности свечения комплекса АГ-АТ используют метод по­давления ИФ, который заключается в способности рабического АГ, связанного с нефлюоресцирующими AT, вторично не вступать в соединение с флюоресцирующими специфиче­скими AT. Для этого на фиксированные препараты, приготовленные из исследуемого голов­ного мозга, наносят 5%-ный антирабический нефлюоресцирующий Ig, выдерживают 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают физраствором, а затем окрашивают флюоресци­рующим антирабическим Ig общепринятым прямым методом. В обработанных таким обра­зом препаратах флюоресценции не должно быть.

Метод ИФ дает возможность обнаруживать ВБ в клетках роговицы глаз и предвари­тельно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического её проявления. Метод может быть использован для исследования по­дозреваемых в заболевании Б животных, а также клинически здоровых собак и кошек, по­кусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все прави­ла личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. Нужно следить, чтобы животное не моргало третьим ве­ком, так как со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Для кон­троля аналогичным образом готовят отпечатки роговицы от здоровых животных. Их можно приготовить в хозяйстве. Отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в тече­ние 4 ч при 4°С, упаковывают и отправляют в лабораторию. Окрашивают препараты, как при ИФ, по общепринятой методике.

В препаратах, полученных от больных животных или находящихся в конце инкубаци­онного периода болезни, в цитоплазме многих эпителиальных клеток наблюдаются разной формы ярко светящиеся гранулы разного размера — от пылевидных точек до 2 мкм и более. С целью получения достоверных результатов в каждом препарате просматривают по 50-100 клеток, а всего от животного — не менее 200-400 клеток. Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более кле­ток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здо­ровых животных (контроль), вследствие аутофлюоресценции, могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками.

Важно отметить, что ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постанов­ке диагноза путем биопробы, поскольку диагноз при Б может быть установлен только на 4-8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубационный период забо­левания мышей может достигать и 20 дн. ИФ может выявлять ВБ в тканях подчелюстной слюнной железы. Из подчелюстных слюнных желез готовят препараты-мазки, беря матери­ал не менее чем из 6 разных участков железы, так как распределение в ней вируса нерав­номерно. Часто, чтобы получить отпечаток, приходится делать сильный нажим, поскольку из-за обилия муцина на стекле остается мало материала.

Показана возможность идентификации ВБ в коже методом ИФ, С этой целью берут пробы кожи головы, а также фолликулы сенсорных и тактильных волос морды или лате­ральных сенсорных сосочков (на щеке собаки). Пробы хранят при -20 или -70°С. Из них де­лают криосрезы, которые обрабатывают флюоресцирующим глобулином. Результаты ИФ анализа, полученные при идентификации ВБ в коже, в высокой степени коррелируют с дан­ными, полученными при исследовании мозга того же животного. Показана близкая корре­ляция между обнаружением АГ вируса в пробах мозга и тканях губы методом ИФ.

РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге жи­вотных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микро­методом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой ме­тодике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А — аммонов рог (правая сторона); В — кора головного мозга (правая сторона); С — мозжечок (правая сторона);
Д — продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) — положительный контроль; — (минус) — отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 — лунки с разведе­нием специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно

Из каждого отдела головного мозга с помощью пинцета готовят гомогенную пастооб­разную массу, которую и помещают в соответствующие лунки. От мышей исследуют весь головной мозг. Из отделов головного мозга левой стороны готовят АГ аналогичным образом ( на каждую экспертизу в общей сложности требуется 4 предметных стекла с агаровьм ге­лем). Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии 1 или 2-3 линий преципитации между лунками, содержащими АГ и иммуноглобулин, реакцию считают положительной.

РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного АГ в ис­следуемом материале составляет 45-70. При исследовании головного мозга мышей, полу­ченного при положительной биопробе, РДП выявляет до 100% случаев. Отсутствие в иссле­дуемом материале телец Бабеша — Негри, специфической флюоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышах с последующей идентификацией вируса.

Биопроба. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша — Негри, ИФ и др. Однако и она в отдельных случаях оказыва­лась отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза Б путем обнаружения телец-включении и ИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался от 1,3 до 12.

Сведения о различной эффективности биопробы могут быть объяснены рядом факторов: выбора экспериментального животного, количества их в опыте, способа заражения, способа и срока хранения материала до поступления в лабораторию. Может играть роль и явление интерференции инфекционных частиц неактивными частицами, если для инокуляции ис­пользуют недостаточно разведенный материал.

В мозге и слюнных железах лисиц и скунсов, павших от бешенства, обнаружено вещество, ингибирующее инфекционность вируса, что не позволяет провести диагностику болезни у этих животных методом внутримозгового заражения мышей. Наличие ингибирующего вещества в исследуемом материале не препятствует выявлению вирусного АГ методом ИФ; для скун­сов и лисиц это самый чувствительный метод диагностики.

Из животных всех видов (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомячки), использованных для биопробы, многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам ВБ и менее опасны в работе. Сирийские хо­мячки по чувствительности не уступают мышам, но они менее доступны.

РСК. Выявление специфического АГ в РСК при диагностике бешенства применяется реже, чем другие методы. Из присланного для исследования мозга готовят АГ. Для этого мозговую ткань (особенно богаты АГ, связывающим комплемент, кусочки таламуса и стволового от­дела мозга) растирают в вероналовом буфере в соотношении 1:10 и оставляют при комнат­ной температуре на 1 ч, после чего суспензию инактивируют при 56°С в течение 5 ч. Такая обработка убивает вирус и снимает антикомплементарность мозговой ткани, не повреждая специфический АГ. Суспензию центрифугируют 15 мин при 3500 мин- 1 из надосадочной жидкости, которая представляет собой материал для исследования на наличие АГ, готовят 2-кратно возрастающие разведения от 1:2 до 1:64 и используют для исследования в РСК.

ИФА. В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства животных выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С 8-18 ч. Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ ВБ в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ным р-ром формалина с рН 5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.

В отличие от РН на мышах и в культуре клеток ИФА позволяет выявить AT у животных в течение нескольких часов, ИФА — наиболее перспективный лабораторный метод обнару­жения AT и индикации самого вируса. Экспресс-методом диагностики бешенства является тех­ника захвата и метод ИФ для выявления АГ ВВ. Доказано, что метод выявления АГ ВБ в парафинизированных срезах пероксидазо-антиперокисдазным методом значительно пре­восходит метод ИФА. В 1987 г. создан набор для быстрой энзимиммунодиагностики бешенства (RREID), приемлемый для эпидемиологических и лабораторных исследований.

РН. Используется редко. Рекомендуется модификация с разведением ВБ и постоянной дозы γ-глобулина. ИН 2 указывает на АГ специфичность выделенного вируса.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. С помощью монАТ к гликопротеинам ВБ селектированы АГ варианты, среди которых выделены фенотипически термола­бильные (авирулентные) варианты. При использовании 2-х групп монАТ показано, что штаммы дикования отличаются от шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA и «утиных» штаммов по АГ детерминантам. Изучение с помощью монАТ 7-ми штаммов, выделенных от больных Б людей, позволило выявить определенные отличия их от вакцинного штамма в отношении АГ детерминант.

Общепризнано, что AT отличия между дикими штаммами удается обнаружить, исполь­зуя монАТ против нуклеокапсидного AT N, которые реагируют с цитоплазматическими включениями зараженных вирусом клеток; против гликопротеина (G АГ), которые реаги­руют с мембранами инфицированных клеток, лизируют эти клетки в присутствии компле­мента и нейтрализуют вирус. В связи с возможной АГ вариабельностью поверхностного гликопротеина ВБ из различных географических зон в качестве протективного АГ исполь­зовали рибонуклеопротеин, характеризующийся консервативностью АГ структуры. Таким образом, не только G белок, но и РНП ВБ обладают протективной активностью.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Эти методы для бешенства нетипичны, поскольку используются только с целью проверки поствакцинального иммунитета. Для обнаружения и титрования поствакцинальных AT ис­пользуют РН, которую ставят общепринятым методом. В качестве АГ используют фиксиро­ванный ВБ. РН на клетках ВНК-21 была более чувствительной, чем непрямая ИФ при выяв­лении AT в сыворотках вакцинированных лис. Кроме того, предложены РТГА и ELISA.

РТГА. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за на­личия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым ВБ высокочувствите­лен, а главное, ГА АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувстви­тельностью. Для приготовления ГА АГ ВБ предложено использовать шт. Москва, выращен­ный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. ГА отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугирова­нием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой ГА активно­стью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 мес при рН 5-9.

Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную 2-кратную трипсинизацию гу­синых эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипси-низированных эритроцитов (лучше 10 7 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой р-р (рН 9) с добавле­нием 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом р-ре с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, оконча­тельный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 мин, а с эритроцитами 2-дн цыплят или макаки-резус — через 1-1,5 ч.

Разработан радиоиммунологический анализ, основанный на способности AT связы­ваться с меченым 125 1-АГ ВБ. Меченый IgG, выделенный из антирабической гипериммун­ной сыворотки, можно применять для обнаружения АГ ВБ твердофазным РИА. Лучшие ре­зультаты получены при использовании фосфатно-солевого р-ра (рН 6,0) с ионной силой 0,01 М и меченого IgG с активностью 200-250 тыс. имп./мин.

Твердофазный конкурентный РИА применим для выявления антирабических AT в сы­воротке и гибридомных супернатантах.

Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить болезнь Ауески, при кото­рой больные животные неагрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломие­лите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов ВБ, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в ПЦР сегмента гена N.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

По данным Роспотребнадзора, за январь-декабрь 2015 г. в Российской Федерации зарегистрировано 6 случаев инфицирования человека вирусом бешенства, что превышает показатели 2014 г. в два раза. Так же в стране зарегистрировано 3739 случаев заболеваемости животных, сообщает Центральная научно-методологическая ветеринарная лаборатория. Из них на долю диких животных, приходится 48,8%, собак и кошек – 37,9%, сельскохозяйственных животных – 12,4% эпизодов.

Полученные данные свидетельствуют о резком усугублении эпизоотической ситуации по бешенству, что заставляет обратить специалистов ветеринарной медицины усиленное внимание на данную проблему.

Наиболее действенным методом контроля бешенства среди животных является своевременная иммунопрофилактика и диагностика.

Возбудителем заболевания является вирус бешенства Rabies lyssavirus.

Family/ Семейство – Rhabdoviridae;

Species/ Вид — Rabies lyssavirus.

Методы лабораторной диагностики бешенства стандартизированы. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30-09-2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 г.

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства: метод флуоресцирующих антител (МФА); метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1); биопроба на белых мышах; метод иммуноферментного анализа (ИФА); реакция диффузионной преципитации (РДП).

Для диагностики используются:

1. Метод флуоресцирующих антител. Выявление антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.

Для выявления вирусного антигена в мазках-отпечатках мозга используют прямую и непрямую реакцию иммунофлюоресценции. Мазки фиксируют в холодном ацетоне в течение 8-10 ч при температуре 4° С и обрабатывают во влажной камере 30 мин. антирабический иммуноглобулин, меченым ФИТЦ, промывают фосфатным буфером, высушивают и исследуют в люминесцентном микроскопе. Антигены вируса наблюдается в виде зеленых гранул разной формы и величины. В случае отрицательного результата, требуется провести другие методы диагностики.

2. Метод выделения вируса в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131. Основан на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

Суспензированый пат. материал вносят в культуру клеток, оставляя лунки для контроля. Положительный контроль — суспензия мозга мыши со штаммом вируса бешенства CVS, отрицательный — суспензия мозга клинически здоровой мыши. Далее инкубируют во влажном CO₂ инкубаторе с содержанием 5 CO₂% при 37±1°С в течении 42-28ч. Высушивают, фиксируют в холодном ацетоне в течении 30 мин, вновь высушивают. Далее с добавлением ФАГ в рабочем разведении, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при 37±1°С в течении 30 мин. По окончании трехкратно промывают, погружая на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе. Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы с четкими краями.

3. Метод биопробы. Выделение вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.

Наиболее пригодными для заражения являются мыши-сосунки. Для постановки биопробы используют 15-20 животных. Заражение проводят под наркозом путем интрацеребрального введения 0,03 мл суспензии исследуемого материала. При наличии в исследуемом материале вируса бешенства у мышей возникает тремор мышц, параличи. В большинстве случаев животные погибают в течение пяти дней. Наличие вируса бешенства в зараженных и погибших мышах необходимо подтвердить с помощью прямой реакции иммунофлуоресценции или обнаружения телец Бабеша-Негри. Идентификацию обнаруженного вируса бешенства проводят также с помощью реакции нейтрализации на белых мышах.

4. Метод иммуноферментного анализа. (ELISA) Основан на специфическом взаимодействии вирусного антигена с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго, меченного ферментом, антитела, путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

ИФА проводят в «сэндвич» варианте. На твердой фазе иммобилизуют гамма-глобулин. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положи­тельный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различ­ных разведениях. Инкубируют и отмывают. В лунки вносят антирабический пероксидазный коъюгат. После инкубации проводят отмывку. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении опти­мального окрашивания в лунках с положительным контролем. Отрицательный результат нуждается в подтверждении другими методами диагностики.

5. Реакция диффузионной преципитации. Метод, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый в виде линии преципитации.

Готовые разведения антирабической сыворотки вносят в приготовленные лунки в агаровом геле. Чашки Петри помещают в термостат при 37±1°С на 48 часов. Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-гло­булин. Отрицательный результат подтверждается другими методами.

Принимая во внимание высокую опасность болезни, обусловленную полной летальностью, специалисту ветеринарной медицины нужно знать, что окончательный диагноз может быть поставлен только методами лабораторной диагностики. Поэтому трудно переоценить значимость вышеперечисленных методов для практической ветеринарной медицины.

Библиографический список

Гайсаров, М.С. Эпизоотологическая характеристика бешенства животных в Республике Башкортостан, профилактика и меры борьбы с ним [Текст] : автореферат дис. канд. биол. наук : 16.00.03 / Гайсаров М. С.; Башкирский ГАУ. — Уфа : [б. и.], 2009. с. 18-19

Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза [Текст] / А.М. Гулюкин // М.:Вопросы вирусологии № 3, 2014 г. — с. 5-10.

Масимов, Н.А. Инфекционные болезни собак и кошек. [Электронный ресурс] / Н.А. Масимов, С.И. Лебедько. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2009. — 128 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/book/256

Методы лабораторной диагностики бешенства. [Текст] : ГОСТ 26075-2013 — Введ. 2015-01-01. — М.: Госстандарт России, 2013. — 19с.

источник

Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

источник

Практически все инфекционные заболевания домашних животных в той или иной степени опасны для жизни и здоровья наших питомцев. Но некоторые из них «на слуху» не только любителей животных: о них знает любой человек, так как болезни эти смертельно опасны. К ним относится и бешенство у собак.

Бешенство — острый, прогрессирующий вирусный энцефаломиелит (воспалительно-дегенеративное поражение головного и спинного мозга). Болеют, преимущественно, всеядные и плотоядные животные, в том числе человек, но и случаи заболевания травоядных (и КРС в том числе) далеко не редки. Считается, что после появления клинических признаков патология однозначно смертельна (но есть исключения, о которых будет написано ниже). Сегодня болезнь распространена по всему миру, но несколько стран (в том числе Великобритания, Япония, Новая Зеландия и Австралия) официально признаны «чистыми». До недавних пор, кстати, именно собаки считались основным резервуарным хозяином, но примерно с 2006 года столь сомнительный «статус» получили кошки. Во многом это связано с тем, что заводчики собак их все же вакцинируют, а вот «кошатники» делают это далеко не всегда.

Лишь хорошая работа ветеринарных служб, массовая вакцинация домашних животных и пропаганда ответственного отношения к здоровью своих питомцев, могут дать гарантию постепенной, но полной ликвидации данного заболевания. К сожалению, в беднейших странах Африки, Азии и Латинской Америки внимания этим вопросам практически не уделяется, вследствие чего бешенство там встречается повсеместно.

Бешенство вызывается вирусом разновидности lyssaviruses, происходящем из семейства Rhabdovirus. Lyssaviruses – не слишком однородный тип вируса. Ученые до сих пор не знают, сколько именно штаммов возбудителя бешенства существует в природе. Идентификация различных вирусных вариантов лабораторными процедурами, такими как моноклональный анализ и ПЦР все же позволила создать относительно подробную карту распространенности различных вариантов бешенства в мире. Сегодня описано уже более 15 штаммов, но это – далеко не предел. В частности, еще не слишком понятна ситуация с разновидностями вируса, обнаруженными в популяциях летучих мышей в Европе и европейской части нашей страны. Одни исследователи считают их классической разновидностью вируса бешенства, в то время как другие ученые настаивают на уникальности некоторых штаммов.

С эпидемиологической точки зрения болезнь эта – крайне опасна тем, что в качестве резервуарных хозяев ее возбудитель может использовать огромное количество видов млекопитающих. Например, бешенство у домашней собаки, передающееся среди именно этих животных, называют собачьим бешенством, тогда как то же самое заболевание, полученное псом в результате укуса, к примеру, лисы, считается «лисьим» бешенством. В нашей стране, а также в Европе, основными «резервуарами» считаются лисы и, отчасти, волки с енотовидными собаками, а также бродячие собаки и кошки. На территории Северной Америки основные проблемы доставляют скунсы, еноты и все те же лисы.

Хуже и непонятнее всего обстоят дела с изучением эпидемиологии бешенства у летучих мышей. Предполагается, что у них есть собственные разновидности вируса, передаваемые, как правило, внутри конкретной популяции. Случаи заражения других животных от летучих мышей фиксируются редко, но все же такой вариант не исключен. Что куда хуже, «небесные мыши» очень часто заражают людей. Строители, дети, садоводы и прочие категории лиц, часто бывающие на приусадебных участках и занимающиеся ремонтом зданий, нередко получают укусы, пытаясь помочь животному выбраться из ловушек. Так делать не следует!

Само по себе бешенство является очаговым, эндемичным заболеванием, редко выходящим за пределы неблагополучных регионов. Ситуация изменилась примерно с 60-х годов прошлого века, когда ученые, пытаясь разнообразить экологические ниши, начали расселять некоторые виды животных. К примеру, енотовидных собак. С учетом их высокой восприимчивости к бешенству и склонности к частым миграциям, не приходится удивляться расширению «бешеного» ареала. Была даже предложена вакцина для пероральной обработки диких животных (через приманки), но ни один из препаратов такого типа сколь-нибудь значимой эффективности не показал. Впрочем, разработки в этом направлении ведутся. Если они закончатся успешно, можно будет надеяться на полную и «бескровную» ликвидацию природных очагов заболевания.

К счастью, медики и ветеринары не дремлют. В результате их многолетней и плодотворной работы, уже к середине прошлого века во многих странах частота встречаемости бешенства упало на несколько порядков. К сожалению, в менее развитых странах дела с этим обстоят так себе: Африка, к примеру, вот уже который год является неиссякаемым источником не только бешенства, но и других опасных заболеваний. Определить, откуда именно идет зараза невозможно из-за крайне противоречивой социально-экономической ситуации на континенте.

Эпидемиологи во всем мире считают, что практически все предрасположенные млекопитающие являются векторами распространения этого заболевания, но далеко не все виды можно расценивать в качестве обособленных природных резервуаров инфекции. Например, кошки могут эффективно передавать вирус, но никакой уникальной кошачьей его разновидности до сих пор выявлено не было. Но именно коты, как мы уже упоминали, становятся одной из главных проблем современности: хозяева редко их вакцинируют, вследствие чего с каждым годом все чаще регистрируются случаи нападения бешеных кошек на других животных и людей. Сообщается, что с 1990 года частота таких эпизодов выросла почти в 15 раз. Напротив, случаи бешенства у собак стали намного реже. Все благодаря своевременной вакцинации.

Lyssaviruses – вирус, специфичный для нервной ткани. Для успешного развития возбудитель должен попасть в любой нерв. Почти в 100% случаев передача заболевания происходит посредством укуса зараженного носителя (его слюна должна попасть в рану). Но на практике есть случаи заболевания после того, как слюна больного животного попадала на исцарапанную кожу или поврежденные слизистые оболочки. Очень неприятной особенностью бешенства является появление вируса в слюне животного еще до того, как у последнего появятся клинические признаки инфекции. В частности, американские ветеринары сообщают, что у скунсов возбудитель может появляться в слюне за восемь дней до возникновения первых симптомов!

После укуса собаки вирус сперва многократно воспроизводится в тканях поперечнополосатой скелетной мускулатуры, после чего внедряется в близлежащие нервные стволы и отправляется вверх, к головному мозгу. Примерно в то же время возбудитель достигает слюнных желез и начинает в них интенсивно размножаться. В некоторых случаях вирус сперва поражает спинной мозг, уже по нему поднимаясь до вышерасположенных отделов центральной нервной системы.

Период инкубации весьма вариативен. Известно немало случаев, когда вирус оставался в тканях на месте укуса в течение не только нескольких месяцев, но даже нескольких лет! Именно по этой причине введение гипериммунных сывороток укушенным людям эффективно в течение нескольких дней с момента укуса. Пока вирус не дошел до ЦНС, его вполне можно уничтожить. «Классикой» у собак считается инкубационный период продолжительностью от 21 до 80 дней. Описывались случаи, когда псы заболевали, даже если с момента укуса проходило несколько месяцев. Но даже это не идет в сравнение с одним человеческим «рекордом»: один «счастливчик» заболел бешенством после укуса енота… спустя восемь лет. Животное повредило уже травмированную руку фермера. Будучи испещрена старыми шрамами и спайками, она в течение восьми лет надежно удерживала вирус… К сожалению, спасти того человека не удалось.

Несмотря на множество лабораторных опытов, передачу вируса через кровь и прочие биологические жидкости доказать не удалось. Но воздушно-капельный путь заражения, как утверждают ученые, все же возможен в некоторых специфических условиях. В частности, удалось добиться заражения подопытных животных в камере с насыщенным аэрозолем, содержащим вирус. Конечно, в природе такого не встречается… почти. Некоторые ученые считают, что именно так бешенство передается от животного к животному в случае с летучими мышами, проживающим в очень скученных условиях. Из-за этого настоятельно советуется воздерживаться от спелеологических экскурсий по таким местам. Предполагается, что в таких случаях вирус вторгается в обонятельные нервы, чувствительные окончания которых выходят на поверхность слизистых оболочек в носовой полости.

Спустя три-пять дней с момента яркого проявления симптомов возбудитель может быть найден во всех тканях и органах собаки. Экспериментально доказано, что переливание крови от такого животного неизбежно ведет к заражению.

Первые признаки заболевания редко бывают достаточно специфичными для опознания патологии. Оттого выявить бешенство загодя получается крайне редко. Наиболее специфичными и надежными «опознавательными» признаками являются резкие изменения в поведении, в частности нервозность и агрессивность, а впоследствии – параличи. Изменения в поведении могут включать: внезапную анорексию (причем отказ от пищи полный и бесповоротный), животное становится очень нервозным, раздражительным и сильно возбудимым. Описаны также случаи, когда у заболевших кобелей в первые часы после начала клинических признаков наблюдалась постоянная эрекция полового члена. В не совсем типичных ситуациях ваш питомец наоборот может становиться очень нелюдимым, собака стремиться отыскать тихий угол. Очень типична сильная атаксия – из-за «неполадок» нервной системы собака не может нормально сгибать лапы, так что ходит она, словно бы на ходулях.

Наконец, развивается выраженная агрессия, причем на первых порах пес на какое-то время еще может приходить в себя, но даже в такое время приближаться к нему строго запрещено. Отступая от темы: опознать бешеное дикое животное намного проще. Так, лисы, волки, еноты и прочие млекопитающие, в естественных условиях небезосновательно опасающиеся человека, в случае заболевания «отважно» идут на контакт. Причем бешеными они зачастую не выглядят: лисята, к примеру, нередко становятся очень ласковыми, и нередко это приводит к трагедиям. Так, в 2014 году в Подмосковье были покусаны отец с сыном. Мальчика, к счастью, спасти удалось, а вот мужчину, которого лисенок укусил в верхнюю часть плеча, уже нет.

Все заболевание можно поделить на три основных стадии: продромальную, психогенную («яростную») и паралитическую. Но на практике обращать особое внимание на эту классификацию не стоит, так как стадии достаточно расплывчатые и непостоянные. Во время продромального периода симптомы очень расплывчаты и с бешенством вообще не соотносятся (в частности, у пса может начаться понос или рвота). Вообще, даже «разъяренная» фаза развивается далеко не всегда: вирус настолько «увлекается», что животное попросту погибает от тяжелых дегенеративных повреждений ЦНС, предварительно впав в коматозное состояние. И это – максимально удачный для всех исход.

Но все же при слове «бешенство» сразу возникает ассоциация с оскаленным псом, с клыков которого капает пенистая слюна. И это – классическая форма заболевания. Иногда у питомца развивается атипичная форма, при которой он становится излишне спокойным. Как уже указывалось выше, агрессии при этом вообще не бывает, так как животное намного раньше умирает от паралича дыхательного центра.

Собственно, при этой форме проявляется бешенство у собак именно так, как об этом принято думать: они становятся крайне агрессивными, нападая как на других животных, так и на людей. Параличи на этой стадии встречаются, но довольно редко. Впрочем, в это время оказывается парализованной нижняя челюсть: именно по этой причине бешеные псы нападают молча, орошая свой путь пенистой, хлопьевидной слюной. Спровоцировать нападение может любой шум, неосторожное движение или жест. Страх у бешеных собак отсутствует полностью, они (даже будучи служебными) без раздумий нападают даже на многократно превосходящих их по размерам животных или на вооруженных людей. Другим характерным признаком является поедание несъедобных предметов, включая даже битое стекло (нередко питомец умирает от перфорации желудка).

Описаны случаи, когда бешеные псы, будучи заперты в металлические клетку, «в труху» ломали собственные челюсти, пытаясь перегрызть железо. Боли, судя по всему, они в таком состоянии тоже не ощущают. Даже с костями, торчащими из открытой раны, животное все равно пытается атаковать человека, подошедшего к клетке. Даже очень далекому от ветеринарии владельцу станет ясно, что такое поведение – как минимум, ненормально. Учтите, что заболевшие щенята нередко становятся очень ласковыми, отчего их частенько начинают тискать дети… Одно неосторожное движение провоцирует резкую вспышку ярости, ребенок оказывается укушен.

При таком протекании заболевания агрессия у заболевшего питомца полностью отсутствует. Пса «выдает» только парализованная нижняя челюсть, из которой потоком стекают слюни. Эта форма, кстати, распространена именно у собак. Сердобольные владельцы часто считают, что ненормальный вид питомца связан с попаданием к нему в пасть инородного тела, лезут туда же голыми руками… вследствие чего часто заражаются. Собаки с паралитической формой кусают редко, но на руках человека часто бывают ссадины и порезы, через которые вирусу легко проникнуть в организм. Смерть при паралитическом типе бешенства развивается в течение нескольких часов.

В феноменально редких случаях возможна скрытая форма бешенства у собак. Длится она может до года! Пес в это время заразен, так как в его слюне есть возбудитель, но «классические» симптомы развиваются лишь в последние дни. Впрочем, у собак такая форма инфекции встречается крайне редко, так как она более характерна для лис.

Постановка диагноза может быть достаточно сложной, особенно если дело происходит в местности, где бешенство встречается редко. На ранних стадиях оно может легко быть перепутано с другими болезнями или с «нормальными» поведенческими патологиями. Осложняется все тем, что проверить собаку на бешенство «на живую» не выйдет: с 2016 года это строго запрещено. При любом подозрении на это заболевание животное усыпляют, а диагноз ставят на основании исследования патологического материала, полученного при вскрытии трупа. Да, это печально и несправедливо, но опасность для человека слишком велика, рисковать своей жизнью специалисты не станут.

Все образцы (как правило, это одна голова) в охлажденном состоянии упаковываются под опись, «упаковщик» расписывается, после чего материал немедленно отправляют в ближайшую ветеринарную лабораторию. Классическим способом диагностирования бешенства у собак является обнаружение телец Бабеша-Негри в срезах мозговой ткани. Исследованию обязательно должен быть подвергнут продолговатый мозг, а также мозжечок. Кроме того, возможно проведение реакции ИФА, преимуществом которой является высокая скорость постановки диагноза. Наконец, в некоторых клиниках предпочитают выращивание возбудителя на культурах клеточных тканей кролика (что предпочтительнее) или лабораторных мышей. Последний анализ на бешенство у собак наиболее точен и надежен, но проводить его могут не везде ввиду отсутствия необходимой материальной базы.

Еще в 2005 году на Международной конференции, посвященной проблемам бешенства, были выдвинуты несколько постулатов. К сожалению, в нашей стране их начали претворять в жизнь постепенно (и не все):

• Незамедлительно уведомлять о случаях бешенства, отслеживать возможных жертв больного животного (как среди людей, так и в числе домашних питомцев).
• Обязать всех владельцев собак содержать своих питомцев или дома, или же в условиях огороженного выгула, ограниченного пределами отдельно взятого участка (частной собственности заводчика).
• Массовая вакцинация домашних животных и строгое (вплоть до уголовного преследования) наказание за отказ владельцев предоставить своего питомца.
• Обязательная эвтаназия всех бродячих животных.
• Обязательная регистрация собак и кошек с вживлением электронных чипов.

К сожалению, в России действует исключительно первый пункт. Кроме того, наиболее сознательные граждане прививают своих собак. Остальные пункты не выполняются. Но не будем о грустном. Так как основным способом предотвращения заболевания является прививка собаке от бешенства, необходимо подробнее рассказать об этом мероприятии.

Сегодня существует множество антирабических вакцин. Все препараты такого типа, продаваемые на территории Российской Федерации, полностью лицензированы и не раз доказывали свою высокую эффективность. В отличие от той же Америки, в РФ не продается живых вакцин. Все препараты, используемые нашими ветеринарами, являются инактивированными (в них используется уже убитый ослабленный штамм вируса). Это хорошо тем, что карантин после прививки не нужен. Заболевание в результате вакцинации не может развиться даже теоретически, так что владельцам привитых животных беспокоиться не о чем.

Рекомендуемая периодичность вакцинации – раз в год первые два года, а затем частота снижается до одного раза в три года.

Желательно, впрочем, проверять титр антител, но в наших условиях это делают редко.

Популярен Нобивак. Он обеспечивает концентрацию антител, равную 0.5 IU/ml, во всем мире признанную эталонной (то есть заболевания, даже при укусе зараженного пса, не разовьется). Если же необходимо обработать беременную суку, необходимо использовать Рабикан. Также надежная и недорогая прививка. Оба препарата способствуют развитию достаточно напряженного иммунитета, срок действия которого – не менее года. Использовать следует только свежие препараты. Ампулу или пузырек необходимо тщательно просмотреть на свет: легкая опалесценция допускается, но никакого осадка и помутнений в толще раствора быть категорически не должно!

Они крайне редки, но у собак есть одна видовая особенность. Дело в том, что после введения того же «Рабикана» у некоторых питомцев развивается васкулит (воспаление сосудов) на кончиках ушных раковин. Из-за этого последние могут подсыхать и немного кровоточить. Но такие побочные эффекты развиваются крайне редко и далеко не у всех животных. Как правило, «нештатные ситуации» обусловлены неправильным хранением вакцин, использованием просроченных препаратов и т.д.

В местности, неблагополучной по бешенству, любое животное, проявляющее признаки агрессии или нетипично себя ведущее, должно превентивно считаться больным. Если выясняется, что оно не подвергалось вакцинации (в случае с дикими зверями и бродячими собаками – подавно), необходима эвтаназия. В тех случаях, когда у питомца нет никаких клинических признаков, он представляет большую селекционную ценность или же имеет высокую стоимость (что, в общем-то, одно и то же), его подвергают строгой изоляции сроком на полгода, а затем вакцинируют. Если в течение последующего месяца не разовьется болезнь, пса признают здоровым. Но все это – под личную ответственность самого владельца и ветеринара!

Еще несколько лет назад не привитую собаку, укушенную больным животным, советовали прививать и выдерживать в карантине на протяжении 45 дней, но сейчас (с 2016 года) это строго запрещено. Таких животных следует усыплять.

Мы настоятельно не рекомендуем самостоятельно пытаться отловить подозрительного пса: риск высочайший. Если человек контактировал с больным или предположительно больным псом, он должен незамедлительно обращаться в приемный покой ближайшей больницы, невзирая на время суток. Врач и только врач может определить, нуждается ли он во введении поливалентной сыворотки. Впрочем, на практике ее вводят всем «контактерам», вне зависимости от иных факторов. Конечно, «осложнения» после прививки в виде сильнейшей болевой реакции (ее вводят непосредственно через брюшную стенку), припухлости и плохого самочувствия, неприятны, но все же перспектива умереть далеко не самой легкой смертью – куда хуже.

Хотелось бы еще раз подчеркнуть один банальный факт: дикие животные – дикие не просто так. Лишь в условиях мегаполисов они сравнительно привычны к человеку. Но вас в любом случае должно насторожить неестественное их поведение. Никогда не приближайтесь к лисам, бродячим собакам и кошкам, не гладьте их, не пытайтесь руками поймать летучую мышь, обнаруженную на чердаке. Не пытайтесь воображать себя «юным натуралистом», пытаясь содержать в домашних условиях ежей, лис, волков и прочих диких млекопитающих. Есть десятки свидетельств инфекционистов о том, что часто это заканчивается очень и очень плохо. В период с 2008 по 2013 год в России от бешенства погиб 61 человек. Многих из них покусали «безобидные» котята, щенки или лисята, есть случаи укусов бешеных ежей. Кстати, о последних: в пасти ежиков столько «грязи», что даже без бешенства их укусы крайне опасны и способны вызвать гангрену. Чем меньше возраст покусанного человека, тем выше опасность.

Любое животное, укусившее человека, но не проявляющее никаких признаков бешенства, обязательно должно быть отловлено и помещено на десятидневный карантин. Но это – крайне опасное «развлечение». Бывали случаи, когда у укушенных людей клинические признаки бешенства развивались еще до их появления у нападавшего животного. Так что сегодня никто держать в карантине «агрессора» не станет: его сразу подвергнут эвтаназии, а мозг потенциально больного животного отправят на исследование. Вообще, с момента появления ИФА «гуманная» методика вообще не имеет никакого смысла: жизнь человека намного более ценна.

Если же вы принадлежите к категориям лиц, постоянно контактирующих с животными, настоятельно рекомендуем пройти курс вакцинации от бешенства.

Сюда относятся: все ветеринары, сотрудники надзорных организация по отлову диких и бродячих животных, сотрудники исследовательских лабораторий, а также геологи, нефтяники и прочие представители профессий, члены которых подолгу и круглогодично бывают в лесу, имея высокий риск встречи с бешеными животными.

К сожалению, добровольно подвергаться вакцинации желают не все. Связано это с довольно тяжелыми постпрививочными осложнениями и множеством ограничений, налагаемых в первые полгода на привитых людей. В частности, все шесть месяцев запрещено принимать алкоголь в любых формах и объемах (это очень спорная рекомендация, кстати), а сами прививки идут очень плотным и разрозненным графиком (к примеру, через 3-7-14-30-90 дней), про них легко можно забыть. Если пропустить хотя бы один сеанс, все можно начинать сначала, так как в противном случае эффективность вакцинации может быть низкой.

Отметим, что заявления о недопустимости посещения сауны, бани, спортзала, о запрете физической работы после антирабической прививки – глупость и научная безграмотность. Вакцинированным людям не запрещается ничего из вышеперечисленного.

источник