Для диагностики бешенства используют

Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

источник

Бешенство (Б) – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением ЦНС. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных регионах земного шара. Не отмечено случаев распространения болезни в Австралии, Великобритании, Японии. Заболевание почти всегда заканчивается смертью. Имеются фактически документированные случаи выздоровления от бешенства человека и собак после экспериментальной инфекции.

Вирус бешенства (ВБ) относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В настоящее время установлено, что ВБ имеет 4 серотипа, что обусловлено, видимо, различием в составе мембранных белков. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности. ВБ обладает ГА и ГАД свойствами. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА, антиГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) АТ.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений (они имеют меньшее значение) и, главным образом, результатов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного АГ в ИФ, РДП, обнаружении телец Бабеша — Негри и биопробе на белых мышах.

В Российской Федерации в настоящее время организовано производство наборов для диагностики Б в ИФ и РДП в ВНИТИБП и КазНИВИ.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мелких животных, от крупных животных — голову или головной мозг. В некоторых случаях допускается консервирование головного мозга в 50%-ном глицерине. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в полиэтиленовый мешок, мозг — в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитой парафином. Материал упаковывается во влагонепроницаемую тару. Для вирусологических исследований пригоден только не консервированный мозг. Необходимо помнить, что вскрытие трупа, извлечение мозга и другие операции с патологическим материалом следует проводить в условиях стерильности и строгого соблюдения мер личной профилактики: прочно фиксируют голову животного, защищают руки 2-мя парами перчаток (хирургические и анатомические), для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот-6-слойную марлевую повязку.

Лабораторные исследования материала на бешенство проводят вне всякой очереди; результаты немедленно сообщают врачу хозяйства и главному врачу района (города).

Индикация и идентификация вируса. Порядок проведения исследований: из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого) готовят по 4 мазка-отпечатки для ИФ и обнаружения телец Бабеша — Негри; с мозговой тканью ставят РДП; при отрицательных результатах ставят биопробу.

Обнаружение специфических телец-включений. Мазки-отпечатки окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматривают в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша — Негри (при окраске по Селлерсу — четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплазме, при окраске по Муромцеву — светло-фиолетовые с темно-синими включениями тельца Бабеша — Негри, чаще они расположены вне нервных клеток.

Наиболее характерная особенность телец Бабеша — Негри — их внутренняя структура, позволяющая абсолютно точно дифференцировать их. Внутри видны маленькие зернышки — базофильные зернистости темно-голубого, даже черного цвета величиной 0,2-0,5 мкм.

Диагностическая ценность обнаружения телец-включений для доказательства заражения ВБ общепризнана. Однако и у здоровых животных, в особенности у кошек и белых мышей, имеются образования, присутствие которых может вызвать диагностические затруднения. В отдельных случаях в мозге кошки можно с уверенностью дифференцировать подобные включения от телец Бабеша — Негри, и здесь рекомендуется воспользоваться методами идентификации, в особенности ИФ. Равным образом и у собак, погибших в результате отравления змеиным ядом или поражения электрическим током, можно найти тельца-включения, напоминающие тельца Бабеша – Негри. Тельца Бабеша — Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом, и материал исследуется в других тестах (ИФ, РДП, биопроба).

ИФ. Один из основных тестов при диагностике Б. При высококвалифицированном выполнении получают в 99-100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюоресцирующего Ig. Фиксацию препаратов в охлажденном (8-10°С) ацетоне проводят не менее 4-х ч. В качестве отрицательного контроля используют мазки-отпечатки головного мозга здоровых белых мышей. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микроскопе на основе оценки интенсивности свечения комплекса АГ-АТ. АГ ВБ выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек, В контроле подобного свечения не должно быть.

Для доказательства специфичности свечения комплекса АГ-АТ используют метод подавления ИФ, который заключается в способности рабического АГ, связанного с нефлюоресцирующими AT, вторично не вступать в соединение с флюоресцирующими специфическими AT. Для этого на фиксированные препараты, приготовленные из исследуемого головного мозга, наносят 5%-ный антирабический нефлюоресцирующий Ig, выдерживают 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают физраствором, а затем окрашивают флюоресцирующим антирабическим Ig общепринятым прямым методом. В обработанных таким образом препаратах флюоресценции не должно быть.

Метод ИФ дает возможность обнаруживать ВБ в клетках роговицы глаз и предварительно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического её проявления. Метод может быть использован для исследования подозреваемых в заболевании Б животных, а также клинически здоровых собак и кошек, покусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все правила личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. Нужно следить, чтобы животное не моргало третьим веком, так как со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Для контроля аналогичным образом готовят отпечатки роговицы от здоровых животных. Их можно приготовить в хозяйстве. Отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в течение 4 ч при 4°С, упаковывают и отправляют в лабораторию. Окрашивают препараты, как при ИФ, по общепринятой методике.

В препаратах, полученных от больных животных или находящихся в конце инкубационного периода болезни, в цитоплазме многих эпителиальных клеток наблюдаются разной формы ярко светящиеся гранулы разного размера — от пылевидных точек до 2 мкм и более. С целью получения достоверных результатов в каждом препарате просматривают по 50-100 клеток, а всего от животного — не менее 200-400 клеток. Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более клеток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здоровых животных (контроль), вследствие аутофлюоресценции, могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками.

Важно отметить, что ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постановке диагноза путем биопробы, поскольку диагноз при Б может быть установлен только на 4-8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубационный период заболевания мышей может достигать и 20 дн. ИФ может выявлять ВБ в тканях подчелюстной слюнной железы. Из подчелюстных слюнных желез готовят препараты-мазки, беря материал не менее чем из 6 разных участков железы, так как распределение в ней вируса неравномерно. Часто, чтобы получить отпечаток, приходится делать сильный нажим, поскольку из-за обилия муцина на стекле остается мало материала.

Показана возможность идентификации ВБ в коже методом ИФ, С этой целью берут пробы кожи головы, а также фолликулы сенсорных и тактильных волос морды или латеральных сенсорных сосочков (на щеке собаки). Пробы хранят при -20 или -70°С. Из них делают криосрезы, которые обрабатывают флюоресцирующим глобулином. Результаты ИФ анализа, полученные при идентификации ВБ в коже, в высокой степени коррелируют с данными, полученными при исследовании мозга того же животного. Показана близкая корреляция между обнаружением АГ вируса в пробах мозга и тканях губы методом ИФ.

РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микрометодом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой методике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А — аммонов рог (правая сторона); В — кора головного мозга (правая сторона); С — мозжечок (правая сторона);
Д — продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) — положительный контроль; — (минус) — отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 — лунки с разведением специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно

Из каждого отдела головного мозга с помощью пинцета готовят гомогенную пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки. От мышей исследуют весь головной мозг. Из отделов головного мозга левой стороны готовят АГ аналогичным образом ( на каждую экспертизу в общей сложности требуется 4 предметных стекла с агаровьм гелем). Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии 1 или 2-3 линий преципитации между лунками, содержащими АГ и иммуноглобулин, реакцию считают положительной.

РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного АГ в исследуемом материале составляет 45-70. При исследовании головного мозга мышей, полученного при положительной биопробе, РДП выявляет до 100% случаев. Отсутствие в исследуемом материале телец Бабеша — Негри, специфической флюоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышах с последующей идентификацией вируса.

Биопроба. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша — Негри, ИФ и др. Однако и она в отдельных случаях оказывалась отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза Б путем обнаружения телец-включении и ИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался от 1,3 до 12.

Сведения о различной эффективности биопробы могут быть объяснены рядом факторов: выбора экспериментального животного, количества их в опыте, способа заражения, способа и срока хранения материала до поступления в лабораторию. Может играть роль и явление интерференции инфекционных частиц неактивными частицами, если для инокуляции используют недостаточно разведенный материал.

В мозге и слюнных железах лисиц и скунсов, павших от бешенства, обнаружено вещество, ингибирующее инфекционность вируса, что не позволяет провести диагностику болезни у этих животных методом внутримозгового заражения мышей. Наличие ингибирующего вещества в исследуемом материале не препятствует выявлению вирусного АГ методом ИФ; для скунсов и лисиц это самый чувствительный метод диагностики.

Из животных всех видов (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомячки), использованных для биопробы, многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам ВБ и менее опасны в работе. Сирийские хомячки по чувствительности не уступают мышам, но они менее доступны.

РСК. Выявление специфического АГ в РСК при диагностике бешенства применяется реже, чем другие методы. Из присланного для исследования мозга готовят АГ. Для этого мозговую ткань (особенно богаты АГ, связывающим комплемент, кусочки таламуса и стволового отдела мозга) растирают в вероналовом буфере в соотношении 1:10 и оставляют при комнатной температуре на 1 ч, после чего суспензию инактивируют при 56°С в течение 5 ч. Такая обработка убивает вирус и снимает антикомплементарность мозговой ткани, не повреждая специфический АГ. Суспензию центрифугируют 15 мин при 3500 мин- 1 из надосадочной жидкости, которая представляет собой материал для исследования на наличие АГ, готовят 2-кратно возрастающие разведения от 1:2 до 1:64 и используют для исследования в РСК.

ИФА. В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства животных выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С 8-18 ч. Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ ВБ в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ным р-ром формалина с рН 5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.

В отличие от РН на мышах и в культуре клеток ИФА позволяет выявить AT у животных в течение нескольких часов, ИФА — наиболее перспективный лабораторный метод обнаружения AT и индикации самого вируса. Экспресс-методом диагностики бешенства является техника захвата и метод ИФ для выявления АГ ВВ. Доказано, что метод выявления АГ ВБ в парафинизированных срезах пероксидазо-антиперокисдазным методом значительно превосходит метод ИФА. В 1987 г. создан набор для быстрой энзимиммунодиагностики бешенства (RREID), приемлемый для эпидемиологических и лабораторных исследований.

РН. Используется редко. Рекомендуется модификация с разведением ВБ и постоянной дозы γ-глобулина. ИН 2 указывает на АГ специфичность выделенного вируса.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. С помощью монАТ к гликопротеинам ВБ селектированы АГ варианты, среди которых выделены фенотипически термолабильные (авирулентные) варианты. При использовании 2-х групп монАТ показано, что штаммы дикования отличаются от шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA и «утиных» штаммов по АГ детерминантам. Изучение с помощью монАТ 7-ми штаммов, выделенных от больных Б людей, позволило выявить определенные отличия их от вакцинного штамма в отношении АГ детерминант.

Общепризнано, что AT отличия между дикими штаммами удается обнаружить, используя монАТ против нуклеокапсидного AT N, которые реагируют с цитоплазматическими включениями зараженных вирусом клеток; против гликопротеина (G АГ), которые реагируют с мембранами инфицированных клеток, лизируют эти клетки в присутствии комплемента и нейтрализуют вирус. В связи с возможной АГ вариабельностью поверхностного гликопротеина ВБ из различных географических зон в качестве протективного АГ использовали рибонуклеопротеин, характеризующийся консервативностью АГ структуры. Таким образом, не только G белок, но и РНП ВБ обладают протективной активностью.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Эти методы для бешенства нетипичны, поскольку используются только с целью проверки поствакцинального иммунитета. Для обнаружения и титрования поствакцинальных AT используют РН, которую ставят общепринятым методом. В качестве АГ используют фиксированный ВБ. РН на клетках ВНК-21 была более чувствительной, чем непрямая ИФ при выявлении AT в сыворотках вакцинированных лис. Кроме того, предложены РТГА и ELISA.

РТГА. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за наличия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым ВБ высокочувствителен, а главное, ГА АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувствительностью. Для приготовления ГА АГ ВБ предложено использовать шт. Москва, выращенный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. ГА отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугированием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой ГА активностью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 мес при рН 5-9.

Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную 2-кратную трипсинизацию гусиных эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипси-низированных эритроцитов (лучше 10 7 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой р-р (рН 9) с добавлением 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом р-ре с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, окончательный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 мин, а с эритроцитами 2-дн цыплят или макаки-резус — через 1-1,5 ч.

Разработан радиоиммунологический анализ, основанный на способности AT связываться с меченым 125 1-АГ ВБ. Меченый IgG, выделенный из антирабической гипериммунной сыворотки, можно применять для обнаружения АГ ВБ твердофазным РИА. Лучшие результаты получены при использовании фосфатно-солевого р-ра (рН 6,0) с ионной силой 0,01 М и меченого IgG с активностью 200-250 тыс. имп./мин.

Твердофазный конкурентный РИА применим для выявления антирабических AT в сыворотке и гибридомных супернатантах.

Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить болезнь Ауески, при которой больные животные неагрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломиелите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов ВБ, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в ПЦР сегмента гена N.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БЕШЕНСТВА

(утверждены 27 февраля 1970 г., б/н)

1. Диагноз на бешенство ставят на основании комплекса эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и главным образом — на основании лабораторных исследований.

2. Для исследования направляют в лабораторию с нарочным: свежий труп или голову от собаки (кошки, лисицы, песца, овцы, теленка и др.), от крупных животных — голову или головной мозг (свежий или консервированный в 30 — 50 %-ном растворе глицерина). Для серологических исследований пригоден только неконсервированный мозг.

3. Лабораторная диагностика бешенства заключается в микроскопическом исследовании головного мозга (с целью обнаружения телец Бабеша-Негри), серологическом (обнаружение специфического рабического антигена), а также в постановке биологической пробы на белых мышах или кроликах.

4. Из головного мозга, поступившего для исследования, делают сначала засев на питательные среды. Часть мозга сразу же помещают в холодильник и сохраняют на случай необходимости повторного исследования. Из оставшейся части мозга берут материал для микроскопического исследования, серологических реакций и биологической пробы.

Примечание . Вскрытие трупа, изъятие мозга и другие работы проводят в стерильных условиях при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, защита рук двумя парами перчаток: хирургическими и анатомическими; для защиты глаз надевают очки, а нос и рот закрывают марлевой повязкой).

5. Для микроскопического исследования делают отпечатки и мазки из разных участков головного мозга.

6. Для приготовления отпечатка кусочки головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в 4 — 6 слоев. К поверхности среза несколько раз (3 — 4) подряд прикасаются чистым предметным стеклом, слегка надавливая, чтобы на стекле получился тонкий отпечаток.

7. Мазки делают из тех же участков головного мозга. Для этого кусочки мозга растирают в фарфоровой ступке пестиком или в пробирке стеклянной палочкой до образования гомогенной массы, из которой делают грубые мазки на обезжиренном предметном стекле.

Можно делать мазки и другим способом. Для этого небольшой кусочек мозга кладут на край предметного стекла, а другим стеклом раздавливают его и размазывают от одного края до другого, в результате чего на поверхности стекла получается тонкий равномерный мазок.

8. Полученные мазки или отпечатки окрашивают одним из следующих способов:

а) окраска по Муромцеву. Изготовленные, еще влажные мазки или отпечатки сразу же фиксируют в этиловом или метиловом спирте или в смеси спирта пополам с эфиром или ацетоном (химически чистым) в течение 1 — 2 ч и после этого промывают водой. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После промывания водой влажные мазки помещают на 5 — 10 мин в раствор краски Мансона, разведенной водой 1:40. Затем краску сливают и тут же мазки погружают в 10 %-ный водный раствор танина на 8 — 10 мин до появления голубоватой окраски. После этого мазки промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном (химически чистым) или спирта с ксилолом й снова высушивают фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон, при этом ядра нервных клеток окрашиваются в синий цвет, а тельца Бабеша-Негри — в бледно-фиолетовый с темными включениями;

б) окраска по Селлерсу. На приготовленный влажный отпечаток или мазок наносят на 4 — с смесь реактива «А» (метиленовый синий — 2 г, метиловый спирт без ацетона — 100 мл) и реактива «Б» (основной фуксин — 0,5 г, этиловый спирт без следов ацетона — 100 мл). Рабочий раствор красителя состоит из 15 мл реактива «А», 2 — 4 мл реактива «Б» и 25 мл метилового спирта. После окраски препарат промывают проточной водой и высушивают. В окрашенном мазке цитоплазма нейронов ярко-синяя, ядрышки темно-синие, эритроциты кирпично-красные, тельца Бабеша-Негри пурпурно-красные с отчетливо видной базофильной структурой телец;

в) окраска по Михину. Мазки или отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира (поровну) в течение 5 — 10 мин, после чего их просушивают фильтровальной бумагой и окрашивают в течение 30 — 40 мин краской Гимза (1 — 2 капли на 1 мл дистиллированной воды), быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96°-ного спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и подвергают исследованию. Если материал был в глицерине, то его предварительно хорошо прополаскивают в воде и просушивают фильтровальной бумагой.

В окрашенном препарате при микроскопическом исследовании основной фон должен быть красным с фиолетовым оттенком. При преобладании синего тона мазок снова обмывают подкисленным спиртом и промывают водой. Пирамидальные нервные клетки имеют синеватый цвет с интенсивно черным ядром, а тельца Бабеша-Негри — розово-красный с точечными включениями темно-синего цвета;

г) окраска по Борману-Гайнуллиной. Тонкие мазки или отпечатки в течение 5 мин фиксируют в смеси следующего состава: спирта и эфира (поровну) — 98 мл, ледяной уксусной кислоты — 2 мл; после фиксации их погружают на 5 мин в 10 % -ный раствор кристаллической соды, а затем промывают водой и просушивают на воздухе. Зафиксированные мазки в течение 2 мин окрашивают краской, приготовленной перед ее употреблением (насыщенного водного раствора метиленовой сини — 3 капли, насыщенного основного раствора фуксина — 2 капли, водопроводной воды — 20 мл). Раствор краски наливают на мазок, фиксируют над пламенем горелки, затем краску оставляют еще на одну минуту, после чего промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. В окрашенном мазке основной фон должен быть ярко-красным, протоплазма нервных клеток окрашивается в красновато-синий цвет, а их ядра — в темно-синий, тельца Бабеша-Негри окрашиваются в землянично-красный цвет с типично гранулярной структурой. Эритроциты имеют вид неокрашенных кружочков.

9. Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Реакция применяется для обнаружения специфического рабического антигена в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, а также у животных, на которых ставилась биопроба. Для реакции можно использовать несвежий (до 1 мес.) головной мозг.

Реакцию выполняют на предметных обезжиренных стеклах, на которые наносят 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 60 °С агарового геля, приготовленного по прописи: сухой агар-агар — 12 — 15 г; химически чистый хлористый натрий — 8,6 г; 1 %-ный раствор (фильтрованный) метилоранжа на 50°-ном спирте — 5 — 10 мл; мертиолят — 0,01 г; вода дистиллированная — 1 л.

Примечание . Для постановки реакции лучше употреблять агар-агар фирмы «Дифко», он полностью растворяется, фильтрование среды не требуется. Другие сорта агар-агара требуют тщательной фильтрации.

После застывания агара в нем делают лунки с помощью тонкостенной металлической или стеклянной трубочки с внутренним диаметром 4 — 5 мм, располагая их согласно трафарету (см. рис. 4 — 7).

Для реакции у крупных животных используют кусочки головного мозга — аммонов рог, кору полушарий, мозжечок, продолговатый мозг; у крыс, сусликов, морских свинок, хомяков и др. — три каких-либо отдела мозга; у мышей — весь головной мозг.

Схема постановки микропреципитации:
А — кора (левое полушарие); В — кора (правое полушарие); С — аммонов рог (левый);
Д — аммонов рог (правый); Е — мозжечок; Ж — продолговатый мозг;
1, 2, 3, 4 — разведений глобулина, соответственно 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Положительная РП со всеми разведениями глобулина
(кора головного мозга овцы, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:4; 1:8, 1:16
(аммонов рог собаки, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:16,
отсутствуют линии преципитации с разведениями 1:2, 1:4,
(продолговатый мозг собаки, уличное бешенство)

Мозг растирают в фарфоровой ступке пестиком или в самой черепной коробке в «пасту», которой заполняют луночки для антигена. Остальные луночки заполняют преципитирующим антирабическим глобулином в разведении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Объем используемых ингредиентов составляет 0,02 мл.

Контроли с положительными и отрицательными антигенами ставят одновременно на отдельном стекле с использованием того же агара по тому же трафарету.

После того как ингредиенты реакции помещены в соответствующие луночки, предметные стекла переносят во влажную камеру (чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой или ватой) и ставят в термостат на 6 ч при температуре 37 — 38 °С. Затем чашки оставляют при комнатной температуре еще на 18 ч.

Учет реакции проводят через 3, 6 и 24 ч после ее постановки. Во избежание высыхания агара стекла с реакцией после каждого просмотра помещают в те же чашки Петри, содержащие увлажненную вату.

При положительной реакции преципитации в агаре между лунками с глобулином и антигеном могут образовываться одна, две и очень редко три параллельно расположенные линии преципитации. Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом приблизительно 45°.

При отрицательных показаниях реакции преципитации ставят биопробу.

10. Реакция иммунофлуоресценции. Основана на выявлении специальными микроскопами (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 и др.) вирусного антигена, вступившего в реакцию со специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующим красителем.

Для реакции делают тонкие и равнослойные отпечатки на тщательно обезжиренных стеклах из свежего или свежемороженого головного мозга. Отпечатки готовят из кусочков головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) так же, как и для микроскопического исследования. От каждого кусочка мозга готовят не менее 4 препаратов. Для контроля аналогично делают препараты из мозга здорового животного.

После высушивания на воздухе препараты фиксируют в ацетоне в течение 4 ч при температуре не выше 4 °С. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После фиксации ацетоном наносят на препараты несколько капель конъюгата (флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин) в рабочем разведении. Затем их помещают во влажную камеру (чашку Петри или закрытый эмалированный кювет с увлажненным дном) на 20 — 30 мин при температуре 25 °С.

После этого препараты промывают водой или фосфатным буферным раствором (pH 7,2 — 7,4) в течение 1 ч, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и подвергают исследованию. Препараты просматривают под иммерсионной системой. Для иммерсии используют нелюминесцирующее масло.

В окрашенном препарате при люминесцентной микроскопии мозговая ткань флуоресцирует (светится) тусклым серовато-желтым цветом. Антиген вируса бешенства выявляется в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины — от едва заметных до имеющих 15 — 20 мкм в диаметре.

В контрольном препарате желто-зеленых интенсивно светящихся гранул не отмечается.

При исследовании с помощью метода флуоресцирующих антител диагноз бешенства считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленоватым свечением различной величины. В контроле подобных образований не должно быть.

При отсутствии положительной флуоресценции ставят биологическую пробу.

11. Биологическую пробу на бешенство ставят, если получен отрицательный результат при микроскопическом исследовании (тельца Бабеша-Негри не обнаружены), при серологических реакциях (специфический рабический антиген не выявлен), а также при выявлении атипичных включений. Биологическую пробу проводят на белых мышах или кроликах.

12. Опытных мышей или кроликов заражают 10 %-ной суспензией из исследуемого мозга на физиологическом растворе или мясопептонном бульоне с pH 7,2 — 7,4. Для приготовления суспензии используются те же участки головного мозга, из которых брали материал для микроскопического и серологического исследований.

Вырезанные участки головного мозга собирают в стерильную пробирку и взвешивают, а затем тщательно растирают в ступке пестиком, после чего добавляют физиологический раствор или мясопептонный бульон из расчета получения 10 %-ной суспензии. Полученную суспензию отстаивают в течение 10 мин и для заражения используют надосадочную жидкость.

Если патологический материал был загрязнен, то надосадочную жидкость сливают в другой сосуд (пробирку) и к ней добавляют по 500 — 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл жидкости, после чего отстаивают еще 30 мин при комнатной температуре и затем используют для заражения. Суспензию необходимо готовить в стерильных условиях и при строгом выполнении правил личной профилактики.

Биологическая проба на белых мышах. Для заражения используют белых мышей массой 8 — 10 г. Для каждого исследования берут 6 мышей, из которых 3 заражают в головной мозг, а 3 — подкожно. При заражении в мозг иглу вводят в точке за линией, соединяющей задние углы и немного в стороне от линии, проходящей посередине головы. Место заражения протирают спиртом. Суспензию вводят в дозе 0,03 мл. Для предупреждения глубокого проникновения иглы в мозг на ее кончик надевают ограничитель — небольшой кусочек резиновой трубки, который укрепляют на расстоянии 2 — 3 мм от конца иглы. При подкожном заражении суспензию вводят в область кончика носа (в верхнюю губу) в дозе 0,05 мл. На месте введения суспензии образуется небольшая припухлость. Зараженных мышей помещают в стеклянные банки и наблюдают за ними в течение 30 сут. При положительном результате биологической пробы у мышей обычно на 7 — 15-й день после заражения развивается клиника паралитического бешенства.

Вначале отмечаются вялость, взъерошенность шерсти и своеобразная горбатость, а также нарушение координации движений. Затем наступает паралич задних конечностей, а позднее — передних, переходящих в общий паралич, заканчивающийся смертью. Продолжительность болезни 2 — 3 сут.

С развитием общего паралича мышей умерщвляют при помощи эфирного или хлороформенного наркоза. У павших и убитых мышей вскрывают черепную полость, делают засев из мозга на питательные среды, после чего извлекают головной мозг, из которого готовят препараты для микроскопического и иммунобиологических исследований.

При отсутствии клинических проявлений бешенства у зараженных мышей в течение 30 сут их уничтожают. Банки, в которых они содержались, тщательно дезинфицируют.

Биологическая проба на кроликах. Для постановки биологической пробы берут 4 кроликов массой не менее 1,5 кг каждый. 2 кроликов заражают в мозг и 2 внутримышечно в области бедра. Суспензию вводят интрацеребрально в дозе 0,2 мл, а внутримышечно — в дозе 2 мл.

При положительном результате биологической пробы кролики заболевают в течение 16 — 21 дня. Заболевание бешенством протекает у кроликов в тихой паралитической форме со смертельным исходом. У павших кроликов извлекают головной мозг и дальнейшее исследование проводят так же, как и при заражении мышей. Наблюдение за кроликами ведут в течение 45 — 50 сут. По истечении указанного срока кроликов уничтожают. Клетки, в которых содержались подопытные животные, дезинфицируют.

1 Гистологическое исследование используют в качестве дополнительного метода

Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога, коры полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и фиксируют в одной или двух порциях ацетона так, чтобы продолжительность фиксации была в пределах 6 — 18 ч.

Лучше фиксацию в ацетоне оставлять на ночь. Затем патматериал проводят через две порции ксилола, выдерживая по 30 мин в каждой, и через две порции парафина — по 1 ч в каждой. Готовые срезы депарафинируют обычным методом и окрашивают по Ленцу или Туревичу:

— окраска по Ленцу. Срезы окрашивают раствором эозина 1 — 3 мин (0,5 г эозина растворяют в 100 мл 60°-ного этилового спирта). Эозин быстро смывают водой и в течение 1 мин окрашивают метиленовой синькой Лефлера, промывают водой, осторожно подсушивают фильтровальной бумагой и дифференцируют раствором ед. кого натра в абсолютном спирте (5 капель едкого натра на 30 мл спирта) до бледно-розового цвета. На препарат наливают раствор уксусной кислоты (1 капля ледяной уксусной кислоты на 60 мл абсолютного спирта) и держат до появления слабо-синей окраски, быстро смывают спиртом и просветляют ксилолом в течение 4 — 5 мин. Тельца Бабеша-Негри окрашиваются в ярко-красный цвет с синими включениями, цитоплазма ганглиозных клеток — в бледно-голубой;

— окраска по Туревичу. Депарафинированные срезы сразу после проводки через спирты и дистиллированную воду окрашивают гематоксилином Вейгерта или Эрлиха, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1 %-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дистиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После промывки обрабатывают смесью (в равных частях) насыщенного водного раствора пикриновой кислоты (на 1 л горячей дистиллированной воды 25 — 30 г пикриновой кислоты) и 96°-ного спирта. При обработке наблюдают отхождение облачков красной краски, и срезы через 10 — 20 с приобретают желтый оттенок. Срезы быстро прополаскивают в воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой. Затем так же быстро проводят через абсолютный или 96°-ный спирт, карбол-ксилол, чистый ксилол и заключают в бальзам. Тельца Бабеша-Негри — вишнево-красного цвета, ядра клеток — черные или синие в зависимости от того, каким гематоксилином они окрашены. По форме и величине тельца Бабеша-Негри весьма разнообразны, находятся в цитоплазме и отростках нервных клеток в виде многочисленных или одиночных экземпляров. Чаще тельца Бабеша-Негри обнаруживают в крупных ганглиозных клетках, причем клетки, содержащие их, не имеют выраженных признаков дегенерации.

Нередко обнаруживают другие включения, которые из-за ряда сходных признаков иногда принимают за тельца Негри. Следует иметь в виду, что в мозге здоровых кошек и белых мышей иногда содержатся неспецифические ацидофильные тельца-включения. Эти тельца можно отдифференцировать от телец Негри по отсутствию внутренних гранул и гомогенности основной субстанции.

Для бешенства также характерны признаки острого энцефаломиелита: преимущественно вокруг мелких вен обнаруживают периваскулярные инфильтраты, состоящие в основном из лимфоидных клеток, имеющих вид клеточных муфт.

В ганглиозных клетках головного мозга могут быть хроматолиз, вакуолизация и острое набухание клеток, а также гибель отдельных клеток. В области поврежденных нервных клеток довольно постоянна пролиферативная реакция глии, принимающая форму истинной нейронофагии с последующим замещением нервных клеток элементами размножившейся глии. Такое скопление клеток пролиферата на месте распавшейся нервной клетки носит название «узелка бешенства» — на срезе иногда можно проследить процесс развития узелка (1).

источник

Бешенство — острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие животные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфекции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от места и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1—3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у собак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (паралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бешенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения может не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Проникая с периферии (место укуса) по нервным стволам в центральную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae,родуLyssavirus. Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион вируса — РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5—10 мин, солнечный свет — за 5—7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5—10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наружный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих антител, а нуклеокапсидный — комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в центральной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культивируется на мышах, кроликах, морских свинках и других животных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предварительной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуцирует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они передают вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, имеющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным материалом необходимо строго соблюдать меры личной безопасности: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, резиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защитные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством животных в полевых условиях запрещено.

Получение пат.материала. Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных — голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектицидами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые мешки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика. Она включает: обнаружение вирусного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ. На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воздухе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влажную камеру при 37 °С на 25—30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуоресцирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

источник

РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микрометодом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой методике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А — аммонов рог (правая сторона); В — кора головного мозга (правая сторона); С — мозжечок (правая сторона); Д — продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) — положительный контроль; — (минус) — отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 — лунки с разведением специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно

Лабораторная диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

Инфекционный ринотрахеит (ИРТ, пузырьковая сыпь, инфекционный вульвовагинит, инфекционный некротический ринотрахеит, инфекционный ринит, «красный нос», контагиозная бронхопневмония, инфекционный катар верхних дыхательных путей) – остропротекающая контагиозная болезнь КРС, характеризующаяся преимущественно катарально-некротическими поражениями дыхательного тракта, лихорадкой, общим угнетением и конъюнктивитом, а также развитием пустулезного вульвовагинита при попадании вируса в половые органы животного и абортами. Болезнь распространена повсеместно.

Вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ) КРС относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellavirus.

В антигенном отношении вирус ИРТ КРС не однороден, существуют варианты. Между вирусами ИРТ КРС и БА существует АГ родство. В организме животных вирус вызывает образование ВНА, КСА. Вирус обладает ГА свойствами в отношении мышиных эритроцитов.

Лабораторная диагностика влючает: 1) выделение вируса из патологического материала в культуре клеток и его идентификации в РН или РИФ; 2) обнаружение антигена вируса ИРТ в патологическом материале РИФ; 3) выявление антител в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РН или РНГА. Для лабораторной диагностики ИРТ используют набор диагностикумов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и набор эритроцитарного диагностикума для серодиагностики ИРТ крупного рогатого скота в РНГА.

Диагностику инфекционного ринотрахеита проводят параллельно с исследованием материала на парагриппозную (ПГ-3), аденовирусную (1 и 11), респираторно-синцитиальную инфекции и вирусную диарею. Схема проведения лабораторной диагностики ИРТ аналогична применяемой при диагностике аденовирусной инфекции.

Предварительный диагноз на инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота ставят на основании положительных результатов обнаружения антигена в патологическом материале РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологических изменений.

Окончательный диагноз ставят на основании совпадения результатов РИФ с выделением и идентификацией вируса; совпадения результатов РИФ с обнаружением антител в 30% и более вторых проб сывороток в титрах не ниже 1:2 в РН и 1:16 в РНГА и обнаружением 4-кратного и более увеличения титра антител в парных пробах сывороток. Предварительный диагноз ставят в ветеринарных лабораториях в течение 2-3 дней, окончательный — в течение 15-30 дней.

Выделение вируса. Взятие и подготовка материала. В лабораторию направляют патологический материал, взятый в течение первых 2- 3 дней болезни при выраженной клинической картине болезни или с диагностической целью непосредственно при убое от животных с острой стадией заболевания.

От больных животных берут 15-20 проб: смывы со слизистой оболочки носовой полости, глаз, влагалища, препуция, пробы спермы. Для смывов используют стерильные ватно-марлевые тампоны; смывы с препуциальной полости и сперму берут в соответствии с Методическими указаниями по отбору проб, транспортированию и подготовке к вирусологическому исследованию спермы и смыва с препуциальной полости быков; пробы крови, не менее 5 мл, получают в первые 3 дня болезни и через 3 нед от тех же животных в стерильные пробирки. Тампоны с материалом помещают в стерильные пеницил линовые флаконы или пробирки с 2-3 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса, содержащего от 500 до 1000 ЕД/мл антибиотиков (канамицин, мономицин, неомицин, пенициллин, стрептомицин и др.).

После свертывания крови стерильно сливают 2-3 мл сыворотки и доставляют последнюю в лабораторию.

Консервирование патологического материала, доставка в лабораторию и его подготовка к исследованию такие же, как при диагностике аденовирусной инфекции.

Пробы спермы до исследования допускается хранить при минус 20 °С не более 5 сут. Сперму исследуют в течение 24 ч после размораживания. Ее разводят 1:10 питательной средой для культуры клеток с добавлением соответствующих антибиотиков (по 500 ЕД на 1 мл), замораживают 2-3 раза при минус 30 °С, оттаивают при 37 °С, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют для заражения культуры клеток. Заражение культур клеток. Методика его аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции. Изолят считается выделенным в случае, если он вызывает стабильное однотипное цитопатогенное действие не менее чем в трех последовательных пассажах. В этом случае возможна его последующая идентификация в РН. Цитопатогенное действие вируса ИРТ в культуре клеток характеризуется образованием окон в монослое, округлением клеток, скоплением их в виде «гроздьев» с последующим отслоением их от поверхности стекла.

Заражение животных. Делают очень редко с целью идентификации вируса инфекционного ринотрахеита. Телятам 6-8-месячного возраста патологический материал вводят интраназально в вагину, под кожу и наносят на конъюнктиву. Если в исследуемом материале есть вирус, у зараженных животных развивается ринотрахеит с конъюнктивитом. От больных телят вирус выделяют главным образом из пораженной трахеи и гортани. У инфицированных животных развиваются симптомы, сходные с наблюдаемыми при естественном течении болезни. Первые клинические признаки болезни появляются через 20 ч после инфицирования и регистрируются 7-10 дней. Зараженные телята, как правило, выздоравливают и остаются вирусоносителями.

Выделить вирус из носовой полости, влагалища и с конъюнктивы удается с 5-го по 10-й день, а нейтрализующие антитела — с 5-8-го дня после заражения. Более высокий титр антител наблюдается после 35 дней, затем начинается медленное снижение.

Установлено, что максимальное количество вируса выделяется во время подъема температуры тела на 4-7-й день болезни и продолжается до 10- 14 дней.

Индикация и идентификация вируса. Обнаружение специфических телец-включений. В ядрах клеток эпителия пораженных слизистых оболочек носовой полости, вульвы, вагины и конъюнктивы находят специфические тельца-включения. Через 18-20 ч после заражения их можно обнаружить и в клетках зараженной культуры ткани, окрашенной гематоксилин-эозином. Биопроба.

РИФ. Техника постановки ее такая же, как и при диагностике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. Обращают внимание на свечение антигена в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповрежденных клеток. Ярко-зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. В мазках из влагалища и конъюнктивы специфическую флюоресценцию отмечали через 24 ч, из препуция — через 48, из носа и трахеи-через 72 ч после заражения. Присутствие специфического антигена удается подтвердить заражением культуры клеток почки телят, в которой обнаруживается специфическая перинуклеарная и диффузная цптоплазматическая флюоресценция, свойственная ринотрахеитной инфекции. Использование культуры клеток почки кролика позволяет освободиться от неспецифического свечения.

Совпадаемость результатов РИФ и патогистологических изменений составляет 87%, а иммунофлюоресценции и вирусологических исследований — 44%. При параллельном исследовании сывороток в РН и РИГА результаты совпадали в 94% случаев.

В полевых условиях РИФ оказалась положительной в 18,5%, а метод вирусовыделения — в 15,9% случаев.

Таким образом, РИФ можно использовать для экспресс-диагноз диагностики ИРТ с последующим подтверждением диагноза вирусологическими методами.

РН. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной нммунофлюоресценции проводят окончательное типирование вируса в РН. Перед ее постановкой специфическую и отрицательную сыворотки разводят в соотношении 1:10 раствором Хенкса или питательной средой для кулыуры клеток, содержащих ангионотики, и прогревают в водяной бане 30 мин при 56 °С. РН ставят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК.

Результаты РН учитывают по ЦПД вируса, для чего определяют титр типируемого изолята в присутствии специфической и отрицательной (контрольной) сывороток. Титр рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД ₅₀/мл.

Затем вычисляют индекс нейтрализации (И) по формуле И = Т₁ : Т_2,

где Т₁ — титр изолята в присутствии контрольной сыворотки; Т₂ — титр изолята в присутствии специфической сыворотки.

Видовую принадлежность изолята устанавливают при разности в титрах вируса не менее 2 lg. При индексе нейтрализации от 1 lg до 2 lg реакцию считают сомнительной, в этом случае ее повторяют. Индекс нейтрализации менее 1 lg считают отрицательным. При положительных результатах РН изолят считают полностью идентифицированным.

Приготовление гипериммунной сыворотки для РН. Гипериммунную вируснейтрализующую сыворотку готовят по следующей схеме: подкожно вводят кроликам 1 мл культурального вируса с адъювантом Фрейнда, далее следует трехкратное внутривенное введение вируса в объеме 1 мл с интервалом через 7 дней. Через 10 дней после последней инокуляции вируса кроликов обескровливают, сыворотку замораживают и хранят при минус 30 °С.

РТГА. Ставят ее микрометодом при 4 °С с 0,5 — 1%-ной взвесью эритроцитов белых мышей, разбавитель — трис-буферный раствор с 0,2% бычьего сывороточного альбумина. В качестве антигена используют культуральную вируссодержащую жидкость, которую концентрируют ПЭГ-6000 или ультрацентрифугированием.

После обнаружения гемагглютинирующего агента, определения его гемагглютинирующего титра готовят 4 ГАЕ и проводят его идентификацию в РТГА с эталонной положительной сывороткой.

Иммуноферментная идентификация вируса. Иммунопероксидазный метод можно использовать для исследования прижизненно взятых нозофарингиальных мазков-отпечатков в клетках, полученных из легочных

Кроме того, рекомендован непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод (НАИП) для лабораторной идентификации вируса ИРТ. Методика заключается в следующем: на покровных стеклах, в пробирках готовят чувствительную культуру клеток к вирусу ИРТ (ПЭК, ТБ и др.) по общепринятой методике. Монослой заражают исследуемым вирусом. Через 48 ч стекла с инфицированными клетками извлекают, отмывают в фосфатно-буферном растворе с рН 7,2-7,4 и фиксируют в охлажденном ацетоне 5-10 мин.

На фиксированный монослой клеток наносят 1-2 капли смеси из специфической иммунной сыворотки и комплемента морской свинки в разведении 1:10. Перед работой противовирусные сыворотки сорбируют гетерологичными исследуемыми вирусами, т. с. получают моносыворотки. При обработке контрольных препаратов на монослой наносят смесь комплемента и нормальной сыворотки.

Препараты инкубируют во влажной камере при 37 °С в течение 40-60 мин, затем промывают проточной водой 5-10 мин, слегка подсушивают и обрабатывают меченной пероксидазой антикомплементарной сывороткой (1-2 капли), предварительно разведенной 1:20 фосфатным буфером, и снова помещают препарат на 40-60 мин во влажную камеру при 37 °С. Затем их промывают, подсушивают и для выявления образовавшегося комплекса (антигенан-титело-пероксидаза) на препарат наносят на 40-60 мин бензидиновый реагент (50 мг бензидина в 100 мл трис-НС1-буфера с рН 6,8 с добавлением после фильтрации 6-7 капель 3%-ной перекиси водорода на каждые 5 мл рабочего раствора). Препарат выдерживают во влажной камере, промывают в дистиллированной воде, высушивают, монтируют на предметном стекле и изучают в световом микроскопе под объективом с иммерсией.

При световой микроскопии непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод обеспечивает четкое выявление вирусного антигена в цитоплазме инфицированных клеток в виде окрашенных в коричневый цвет образований, которые видны при увеличении в 140 раз.

Специфичность показателей, полученных этим методом, подтверждается постановкой специальных иммунологических контролей. При постановке перекрестной иммунопероксидазной реакции с гетерологичными антителами эта реакция имеет выраженный видоспецифический характер: антиген реагирует только с гомологичной сывороткой. Эндогенная пероксидаза в культуре клеток ПЭК и LF не выявляется.

Непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод является перспективным при диагностике острых респираторных вирусных инфекций крупного рогатого скота.

При использовании иммунопероксидазного метода для индикации вируса ИРТ в культуре клеток ПЭК антиген выявляется через 18, 22 ч после заражения. Три прямых серологических метода быстрого обнаружения вирусных антигенов (РИФ, иммунопероксидазный и ELISA) одинаково применимы для обнаружения вируса во время лихорадки, но не на поздних стадиях болезни.

Вирусный антиген обнаруживают в носовых смывах методом ELISA с 3-го по 10-й день после заражения. В конъюнктивальных смывах его выявляют на 5-е сутки.

Идентификация вируса ИРТ посредством рестрикционного анализа вирусной ДНК. Описаны метод клонирования фрагментов генома вируса ИРТ, выделение и характеристика рекомбинантного ДНК-зонда, который позволяет определять вирус в клинических пробах. С помощью метода дот-блот-гибридизации выявлена ДНК вируса ИРТ в пробах спермы, полученной от серопозитивных животных, когда выделение вируса в культуре клеток давало отрицательный результат. Хороший результат также получен при использовании инфицированных культур клеток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Антитела к вирусу ИРТ можно обнаружить в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, РНГА и др. Для постановки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 3 нед. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра антител в парных пробах сыворотки, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал. Перед исследованием сыворотки прогревают в водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин.

РН. Ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса в культуре клеток ‘ПЭК или ТБ. Вирус предварительно титруют в культуре клеток. Для этого сухой вирус ИРТ из набора диагностикумоя стерильно разводят в объеме, указанном на этикетке, и готовят из него десятикратные разведения от 10 -1 до 10 -6 на питательной среде (конечный титр су.хого вируса указан на этикетке).

Разведение готовят в общем объеме 5 мл, затем заражают по 4 пробирки с культурой клеток, предварительно отмытой от ростовой среды, каждым разведением вируса в объеме I мл. Зараженные и контрольные культуры клеток (4-6) инкубируют при 37 °С, ежедневно учитывают ЦПД вируса заключительно — на 5-7-е сутки.

Титром вируса считают обратную величину его наибольшего разведения, вызывающего ЦПД в 50% культур клеток, который высчитывают по методу Рида и Менча пли Кербера и выражают в ТЦД₅₀/мл. Титры 1:32, 1:64 обнаруживаются редко. В неблагополучных по данной болезни стадах ВНА выявляются у 12% клинически здорового скота. Ретроспективный диагноз на ИРГ ставят при 4-кратном и более приросте AT в пробах сывороток реконвалесцентов. В настоящее время широко используют микрометод РН.

РНГА. Биологическая промышленность нашей страны выпускает эритроцитарный диагностикум. РНГА ставят согласно методическим указаниям в микропанелях с U -образными лунками наборов микротитрования Такачи или Титертек по общепринятой методике. Результаты РНГА с используемыми сыворотками оценивают по титрам; положительные – 1:16 и выше, сомнительные — 1:8, отрицательные — 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титров АТ в парных сыворотках в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции. Применяя РНГА, можно обнаружить AT в более ранний период инфекции, чем с помощью РН. Установлено соответствие результатов РНГА и РН в 95% случаев. С помощью данной реакции легче и быстрее, чем РН проводить типирование АТ к вирусу ИРТ. Титры AT были в 7-10 раз выше выявляемых в РН.

РДП. Не нашла широкого применения в диагностической практике, исследователи рекомендуют её использовать для серодиагностики ИРТ. По наличию ПА можно уловить недавно прошедшую инфекцию, в то время как ВНА длительно циркулируют в организме, и заболевание можно уловить по парным сывороткам. При выявлении ПА кровь лучше брать на 8-й и последуюшие дни болезни.

РТГА. Может использоваться для выявления и количественной оценки AT к вирусу ИРТ. Титр анти-ГА коррелирует с титром ВНА. Положительный результат РТГА уже в 1-ом разведении сыворотки (1:4) указывает на наличие AT к вирусу ИРГ в данной пробе сыворотки. 4-кратный и более прирост титров анти-ГА в парных пробах сыворотки является показателем активной инфекции.

ELISA. Широко применяют в Нидерландах, США, Великобритании, Швеции, странах бывшего СССР. Он оказался пригодным для обнаружения AT к вирусу ИРГ в молоке. Для этого достаточно получения проб смешанного молока от 5-10 коров. AT определяют после предварительного концентрирования в них Ig. Совпадаемость данных серологических реакций в пробах сыворотки крови и молока составляла 92,8%. С помощью данного метода можно оперативно определять иммунологический статус поголовья лактирующих коров целого региона, а также проводить обследование экспортируемых и импортируемых животных. В ФРГ разработан и применяется метод ТРАХИТЕСТ для ИФА проб сборного молока поров с целью диагностики скрытого вирусоносительства.

Предложен непрямой метод IgM-ELISA для определения недавней инфекции ИРТ. Ранние AT IgM выделены на 6-й дн после заражения, к 9-му дн происходил рост титра AT Ig, a к 13-му дн — ВНА. У телят, привитых инактивированной вакциной, раннего иммунного ответа не происходило — AT IgM не выявлялись, a IgM и ВНА появлялись позже, чем после заражения. Однако при этом следует иметь в виду, что наличие в сыворотке КРС ревматоидного фактора может привести к ложноположительным результатам диагностики в IgM-ELISA. В этом случае предварительная обработка проб сыворотки антибычьими IgM позволяет избежать ложноположительных результатов. Тест IgM-ELISA имеет большую ценность в диагностике ИРТ, особенно у молодых животных. В группе позитивных сывороточных проб корреляция между ELISA и РНГА составляла 98,3%, a EL1SA с ИФ — 95,7%.

ELISA с использованием монАТ. Основан на конкуренции между AT сыворотки крови КРС и нейтрализующими мышиными монАТ. Для его проведения лунки микротитрационных панелей обрабатывают очищенным вирусом ИРТ, и после высушивания их можно использовать немедленно или хранить при — 20°С. В обработанные вирусом лунки панелей последовательно вносят неразведенную испытуемую сыворотку, специфические к вирусу ИРТ монАТ, конъюгированные пероксидазой, субстрат пероксидазы. Результаты реакции учитывают в спектрофотометре при А405. В случае положительной реакции связывание монАТ ингибируется AT сыворотки крови. Метод оказался намного чувствительнее и специфичнее РН.

Лабораторная диагностика ротавирусной инфекции крупного рогатого скота

Ротавирусная инфекция (РВИ) КРС (диарея неонатальных телят) — остропротекающая контагиозная болезнь новорожденных телят, характеризующаяся поражением ЖКТ. Болезнь широко распространена во всех географических регионах земного шара. Практически ее регистрировали везде, где проводили исследования. Доказана широкая диссиминация ротавирусов (РВ) телят среди животных разных видов и наличие АТ у грызунов (морских свинок, крыс, хомяков, мышей).

На основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных ставят предварительный диагноз, окончательный устанавливают лишь лабораторньм методами. Последние базируются на обнаружении вируса или вирусного АГ в фекали больных телят, содержимом кишечника, клетках слизистой оболочки тонкого кишечника павших и вынужденно убитых животных, а также на выявлении АТ к РВ в сыворотках крови больных и переболевших телят и в сыворотках крови и молозиве коров-матерей.

Экспресс-методы диагностики. Разработана тест-система ИФА на основе РВ свиней при выявлении специфического АГ РВ КРС, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Её целесообразно применять в лабораторных условиях для экспресс-диагностики. Поскольку полипептид VР5 содержит перекрестный групповой АГ, локализованный в консервативном домене, который является общим для всех РВ группы А. Показана возможность индикации рота- и коронавирусов методом флюоресцентных зондов и АТ к ним. Он основан на регистрации ранних этапов взаимодействия вирусов с рецепторами клеток.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют не менее 10 проб жидких фекалий, тонкий кишечник с содержимым (не позднее 2-3 ч с момента гибели или вынужденного убоя телят), 10-15 проб парных сывороток больных и переболевших животных, 6-10 проб сыворотки крови коров и 6-10 проб молозива. С наибольшим постоянством вирус удается обнаружить в пробах фекалий, взятых в первые дни болезни, поэтому для исследования пригодны фекалии, взятые от 2-14-дн телят с клиническими признаками диареи на 1-3-й день болезни. Сразу же после доставки в лабораторию пробы обрабатывают или хранят при 4°С не более суток, при -20-50°С до 1 мес. Сыворотки крови хранят при 4-10°С не более 1 нед, при -20°С до 1 мес; молозиво — при 4°С не более 2 сут, при -20°С — до 1 мес. Для вирусологических или электронно-микроскопических исследований готовят 10%-ную суспензию фекалий на р-ре Хенкса. Суспензию гомогенизируют и центрифугируют 1 ч при 3 тыс. об/мин, надосадочную жидкость переносят в стерильный флакон, добавляют пенициллин и стрептомицин (по 1000 ЕД/мл), выдерживают 10-12 ч (ночь) при 4°С и исследуют.

Выделение РВ в культуре клеток. Показана корреляция между заболеванием новорожденных телят диареей с присутствием РВ АГ в фекалиях. Следует иметь в виду, что обычными методами вирус не культивируется, а применение дополнительных воздействий — химических (трипсин) и физических (центрифугирование вируса на слое клеток) — дает положительные результаты при высоких концентрациях вируса в фекалиях, что проверяется электронной микроскопией. Для этого содержимое одной пробирки после замораживания и оттаивания и обработки полиэтиленгликолем ресуспендируют в 0,1 мл дистиллированной воды и исследуют в электронном микроскопе. В положительном случае обнаруживают типичные частицы РВ и их скопления. Специфический характер частиц подтверждают методом иммуноэлектронной микроскопии.

Индикация и идентификация вируса. ЭМ и ИЭМ. Метод электронной микроскопии (ЭМ) суспензии вируса из жидкой части фекалий наиболее широко применяется для диагностики инфекции при концентрации вируса в фекалиях не ниже 10 4 -10 5 частиц/мл жидкости. Препараты готовят из осветленной низким центрифугированием жидкой части фекалий, Однако лучшие препараты получают при разведении фекалий дистиллированной водой 1:1-1:10 и последующем осветлении суспензии центрифугированием при 4-10 тыс. об/мин в течение 15 мин. Простой метод приготовления препаратов из фекалий, не уступающий по чувствительности ультрацентрифутированию, состоит в следующем. К 4 мл осветленной низким центрифугированием жидкой части фекалий добавляют 60% насыщенного р-ра (NН₄)₂SО₄ смешивают, оставляют на 1 ч при 4°С, а затем центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 4-х каплях дистиллированной воды и готовят препараты. Существуют различные способы и модификации приготовления препаратов из. Наиболее широко используется капельный способ. Более целесообразно применять ИЭМ. Для этого можно использовать сыворотку лабораторных животных (кроликов, морских свинок), иммунизированных РВ обезьян или сыворотку реконвалесцентов. Содержание и специфичность АТ в сыворотках реконвалесцентов могут быть проверены в серологических реакциях с использованием вируса SА 11. При обработке фекальной суспензии иммунной сывороткой одновременно с обнаружением типичных частиц РВ устанавливается их специфичность, на что указывает выявление агрегатов, в которых РВ частицы связаны специфическими иммунными глобулинами. Чаще используют три модификации иммуноэлектронной микроскопии.

При положительном результате РВ частицы выявляются в препаратах в виде специфических скоплений (иммунных комплексов). Оценку специфичности реакции проводят путем подсчета числа и размеров подобных скоплений, а также по степени покрытия отдельных вирионов АТ сыворотки. Выраженность этого эффекта при определенном навыке можно оценивать по шкале условных единиц от 0 до 4-х плюсов.

ИФ. Для обнаружения вирусного АГ в замороженных срезах тонкого кишечника, мазках фекалий и культуре клеток успешно применяют прямой и непрямой методы. При исследовании криосрезов кишечника и мазков из фекалий телят лучшие результаты получают в течение 4-6 ч после обнаружения признаков диареи. Эпителиальные клетки быстро десква-мируются с поверхности ворсинок кишечника и удаляются с фекальными массами. Чаще всего суспензией фекалий заражают культуру клеток и идентифицируют вирусный АГ в реакции ИФ. Разработан прямой метод ИФ в клетках МДВК, инфицированных культуральным или фекальным вирусным материалом. В методических рекомендациях по индикации РВ КРС непрямым методом ИФ предусматривается использование диагностического набора, включающего антиген специфический — культуральную вируссодержащую суспензию клеток ПЭК или МА-104; АГ нормальный — неинфицированную суспензию клеток ПЭК или МА-104; специфическую сыворотку, полученную путем гипериммунизации телят, лабораторных животных; нормальную сыворотку от здорового КРС, не содержащую АТ к РВ; антивидовую сыворотку против глобулинов КРС, конъюгированную ФИТЦ (выпускает Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). НИФ можно использовать для обнаружения и идентификации РВ АГ в инфицированных культурах клеток, фекалиях и кишечнике больных и павших телят для выявления и количественной оценки АТ к РВ.

РДП. Это — простой и доступный метод выявления РВ АГ в фекалиях больных телят, содержимом кишечника и суспензии слизистой оболочки кишечника павших или вынужденно убитых телят. Для этого 20%-ную суспензию фекалий в фосфатно-буферном солевом р-ре прогревают в водяной бане при 37°С 30 мин, периодически перемешивая. Затем центрифугируют 15 мин при 8000 g. Надосадочную жидкость фильтруют через фильтр «Миллипор» и фильтрат концентрируют в 25 раз при помощи диализного концентратора. В результате всех этапов обработки 0,2 мл концентрата соответствует 1 г исходного материала фекалий. Источником специфических АТ служат сыворотки реконвалесцентов после ротавирус-ного гастроэнтерита, предварительно проверенные в других серологических реакциях.

РДП проводят в геле агарозы на стеклянных пластинках 0,9% агарозы в буферном р-ре, содержащем 0,1 М NaС1, 0,01 М трис(гидроксиметил)-аминометана и 0,001 М этилендиа-минтетраацетата. Компоненты реакции помещают в вырезанные в слое агарозы лунки диаметром 3 мм, отстоящие друг от друга на 3 мм. Пластинки с гелем выдерживают в течение ночи при комнатной температуре, после чего учитывают результаты. Между лунками с АГ и АТ в положительных случаях формируется одна четкая линия преципитации. В РДП испытывается АГ — жидкая часть фекалий или надосадочная жидкость после центрифугирования суспензии фекалий или кишечника, испытуемая сыворотка от переболевших телят, молозиво и молоко в натуральном виде (в виде сыворотки) после обработки сычужным ферментом.

Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов флюоресцирующими АТ может применяться для обнаружения в фекалиях РВ человека и РВ диареи телят. Разработана ее ускоренная модификация. Диагностикум, включающий специфический и нормальный АГ, специфическую сыворотку, готовят по методике ВИЭВ, а в качестве нормальной сыворотки используют фетальную сыворотку или сыворотку безмолозивных телят. Реакцию оценивают по образованию характерных линий преципитата.

РСК. Для выявления АГ применяется реже других методов. Она менее чувствительна, чем электронная микроскопия и РИФ, чаще дает ложноположительные результаты из-за антикомплементарности многих проб фекалий. Однако при обработке фекалий комплементом, фетальной сывороткой, фреоном, очисткой ПЭГ 6000 или ультрацентрифугированием РСК не уступает по чувствительности электронной микроскопии. Реакцию ставят микрометодом со специфической сывороткой или сывороткой недавно переболевших телят, свободной от АТ к другим вирусам.

ВИЭФ. При этой реакции образуется линия преципитации между АГ, движущимся к аноду, и АТ, движущимся к катоду. Качество и чистота агарозы являются основным фактором получения воспроизводимых результатов. Большинство исследователей считают, что этот тест не уступает электронной микроскопии или даже превосходит ее.

ВИЭФ предложен для обнаружения РВ в фекалиях и патологическом материале и для выявления АТ в сыворотках крови. Для исследования берут жидкую часть фекалий. Если для исследования жидкой части недостаточно, то пробы фекалий центрифугируют 10-15 мин при 4 тыс. об/мин при 4-10°С. Исследуют надосадочную жидкость. Кишечник мелко измельчают, добавляют равный объем физиологического р-ра, затем гомогенизируют в ступке со стеклом, центрифугируют 10-15 мин при 2 тыс. об/мин при 4-10°С. Надосадочную жидкость используют в реакции. ВИЭФ ставят в 0,85%-ом р-ре агарозы, приготовленной на 0,5 М веронал-мединаловом буфере (рН 8,6).

ЕLISА. По чувствительности выше, чем ЭИ, ИФ, РСК, ВИЭФ. Может быть использован в прямом и непрямом вариантах, а также в постановке на латексе. С помощью ЕLISА можно обнаружить РВ в фекалиях телят при разведении исследуемой пробы до 1:5000. Описан твердофазный ЕLISА для типирования и деления на подгруппы РВ человека и животных. Для этого используют IgG в концентрации 5 мкг/мл; разведение кроличьей антисыворотки к IgG КРС до 1:400. Продолжительность инкубации IgG -4 ч, реакции АГ РВ с IgG -3 ч, реакции антисыворотки к РВ с комплексом IgG — РВ АГ -16 ч, для соединения с конъюгатом — 4 ч, для изменения цвета субстрата (фосфата Р-нитрофенила) — 10 мин. Перед исследованием фекалии телят разводят в 4 раза фосфатно-буферным р-ром, осветляют центрифугированием и обрабатывают смесью Твина-20 с азидом натрия. Показания ЕLISА в 100% случаев совпадают с результатами электронной микроскопии.

Разработана тест-система ИФА на основе РВ свиней для выявления специфического АГ РВ КРС, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В Российской Федерации разработан иммуноферментный диагностикум, выпускаемый ВИЭВ. Набор включает: специфический лиофилизированный РВ АГ — вируссодержащая суспензия, полученная на культуре клеток МА-104, концентрированная ПЭГ 6000 и центрифугированная при 6000g, контрольный АГ, лиофилизированная специфическая антиротавирусная сыворотка, полученная путем гипериммунизации телят или кроликов вирусом, очищенным в градиенте плотности хлористого рубидия; сухие иммуноглобулины, выделенные из гипериммунной антиротавирусной сыворотки методом высаливания насыщенным р-ром (NН₄)₂SО₄ с последующей ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Существует ряд других методов для выявления РВ АГ в фекалиях больных диареей телят: реакция обратной пассивной гемагглютинации, метод иммуноагрегатной ГА, реакция агглютинации латекса и др. Так, предложен простой стафилококковый метод для обнаружения РВ в фекалиях новорожденных телят с использованием кроличьей сыворотки к РВ телят. Метод основан на обнаружении РВ агглютинирующего стафилококка в 10%-ой суспензии образцов фекалий на предметных стеклах с золотистым стафилококком, нагруженным РВ АТ. Контролем служат стафилококки, обработанные неиммунной кроличьей сывороткой. Агглютинация видна под микроскопом через 2-3 мин после кругового покачивания стекла. Во избежание неспецифических реакций проводят предварительную обработку образцов фекалий нагреванием, фильтрацией и Ы-ацетилцистеином. Такая обработка не снижает специфичности метода. В сравнении с ЕLISА данный метод оказался чувствительнее; преимущества его — скорость, простота и низкая стоимость, что очень важно для скрининга большого числа образцов фекалий.

Метод агглютинации латекса с использованием коммерческого набора Rotalех для выявления РВ в фекалиях больных столь же специфичен, чувствителен, как и методы электронной микроскопии, ИФ и ЕLISА. Для дифференциации подгрупп и серотипов изолятов РВ описан метод гибридизации нуклеиновых кислот, электрофорез в ПААГ вирионной РНК вирусов. Метод точечной гибридизации высоко специфичен, позволяет выявлять 8 нг вирусной РНК и в 10-100 раз более чувствителен, чем ЕLISА.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. Получены монАТ к шт. RIT4237 (серотип I) РВ КРС. Нейтрализация АГ выявила вариабельную специфичность к групповым и подгрупповым детерминантам. Использованием монАТ против субгрупповых АГ в ЕLISА было установлено доминирование серотипа II РВ человека в пробах кала больных детей. Наличие таких АТ увеличивает чувствительность и специфичность тест-систем.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Серологическое исследование сывороток крови телят имеет весьма ограниченную ценность. В течение первых недель жизни не удается обнаружить прироста АТ, несмотря на прошедшую болезнь. Уровень гуморальных АТ у взрослых животных не позволяет прогнозировать возникновение эпизоотии в стаде.

РСК. Для диагностики РВИ показана возможность постановки РСК с парными сыворотками переболевших животных. В первые дни болезни КСА у большинства животных отсутствуют. К 7-10 дню уровень их возрастает, достигая максимума к 21 дню, затем происходит снижение, и к 30-35 дню титр КСА доходит до нуля. РСК ставят общепринятым методом в микро- и макрообъемах.

РТГА. Ставят по стандартной методике, используемой диагностическими вирусологи-) ческими лабораториями. Применяют стеклянные пробирки и обычные объемы реагентов или одноразовые пластиковые панели с лунками и микрообъемы реагентов. Для постановки реакции используют эритроциты человека группы О или эритроциты морской свинки. Исследуемые сыворотки обрабатывают каолином и эритроцитарной массой (последнее — при использовании эритроцитов человека). Все разведения готовят на физиологическом солевом р-ре с добавлением 0,04 % альбумина сыворотки КРС.

Непрямая ИФ, РН, радиоиммунологический метод ставятся по общепринятым методикам.

Дифференциальная диагностика. РВИ у новорожденных телят следует дифференцировать от коронавирусной инфекции, колибактериоза. Необходимо исключать диспепсию новорожденных телят алиментарного происхождения. Для титрования вирусов группы А разработаны методы дот- и блот-гибридизации РНК с зондами к ДНК геномного сегмента 4, полученными с помощью амплификации в ПЦР гипердивергентных областей гена белка VР4 (нуклеотиды 211-686) к ДНК шт. ИК, IND, NCDV и Сr с использованием олигонуклеотидных праймеров. Зонды 3 типоспецифичны (VР4) и не реагируют перекрестно с 2-нитевыми РНК гетерологичных Р-типов РВ.

Лабораторная диагностика вирусной диареи

Вирусная диарея — болезнь слизитых оболочек (ВД-БС) — инфекционная контагиозная болезнь КРС, преимущественно молодых животных, характеризующаяся эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, ринитом, увеличением лимфоузлов, высокой лихорадкой, общим угнетением, лейкопенией, постоянной или перемежающейся диареей, эрозивным и язвенным стоматитом с обильным слюноотделением, появлением слизисто-гнойных истечений из носовой полости. У коров возможны аборты. Впервые как самостоятельное заболевание ВД-БС была определена в штате Нью-Йорк (США) в 1946 г. при вспышке острой, часто со смертельным исходом болезни КРС, характеризовавшейся диареей и эрозийными поражениями ЖКТ. В настоящее время ВД-БС широко распространена на территориях многих стран и вместе с 2-мя другими пестивирусами (ВКЧС и вирус ПБО) инфицирует 173 вида домашних и диких жвачных животных и 11 видов свиней. Имеются публикации об обнаружении АТ и АГ пестивируса у человека, но возможность его инфицирования только предполагается.

На основании различий в клинических проявлениях вирусную диарею и болезнь слизистых оболочек КРС первоначально рассматривали как разные болезни. Позднее на основании анализа патологических изменений, особенностей эпизоотологии и клинических проявлений эти 2 болезни стали обозначать под названием вирусная диарея — болезнь слизистых оболочек КРС. Поскольку установлена идентичность возбудителей этих болезней, то их считают одной инфекцией с различными клиническими проявлениями, преимущественным развитием респираторного или диарейного синдрома, в связи с чем болезнь чаще стали называть вирусная диарея КРС.

Болезнь зарегистрирована во всех странах мира. В некоторых штатах США обнаруживается до 70-90% серопозитивных животных.

Диагноз ставят на основании клинических, эпизоотологических данных и лабораторных методов исследования. Однако эпизоотологические данные, симптомы болезни и характер патологических изменений дают основание лишь заподозрить болезнь. Поскольку ВД-БС напоминает многие другие болезни (чуму, инфекционный язвенный стоматит, грибковый стоматит, ПГ-3, катаральную лихорадку КРС, паратуберкулез и алиментарные отравления), лабораторные исследования в диагностике имеют решающее значение. При постановке диагноза на ВД-БС следует учитывать следующее: заболевают отдельные животные в возрасте 3-36 мес, типичные клинические изменения проявляются поражением слизистых оболочек или кровянистым поносом с эрозией или без эрозии слизистых мембран, все заболевшие животные погибают в течение нескольких дней, у больных животных нет специфический АТ в крови, хотя остальное поголовье имеет их в высоких титрах.

Лабораторная диагностика ВД-БС включает: 1) обнаружение в патологическом материале (мазках, отпечатках, срезах), полученном от больных животных АГ в РИФ; 2) выдм ление возбудителя из патологического материала в культуре клеток ТБ, ПЭК или Л ЭК него идентификация в РН или РИФ; 3) выявление АТ в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РСК и РН.

Лабораторную диагностику ВД-БС проводят с использованием набора диагностикумов, выпускаемых биологической промышленностью. Ее ведут параллельно с исследованием материала на ПГ-3, аденовирусную (адено 1 и 2), РС и ИРТ.

Предварительный диагноз на ВД-БС КРС ставят на основании положительных результатов обнаружения АГ в патологическом материале в ИФ и ПЦР с учетом эпизоотологичм ских и клинических данных, а также патологоанатомических изменений. Окончательный диагноз ставят на основании: совпадения результатов ИФ с ПЦР, выделением и идентификацией вируса; совпадения результатов ИФ с обнаружением АТ в 30% и более вторых проб парных сывороток в титрах не ниже 1:4 в РСК и 1:16 в РН; обнаружения 4-кратного и более прироста АТ в парных пробах сывороток. Предварительный диагноз ставят в ветеринарный лабораториях в течение 2-3 дн, окончательный — до 30 дн.

Выделение вируса. В лабораторию направляют патологический материал от больных животных, взятый в первые 2-3 дня при выраженных симптомах болезни или от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии заболевания. От боли ных животных берут 15-20 проб следующего материала: смывы со слизистой оболочки носовой полости, получаемые путем введения стерильного ватно-марлевого или поролоновом тампона в носовые ходы; пробы крови в первые 3 дн болезни и через 3 нед от тех же животных с соблюдением правил асептики в стерильные пробирки по 8-10 мл; соскобы с изъязи ленных или эрозированных участков слизистых оболочек ротовой полости и носового зер кала, взятые жесткими ватно-марлевыми тампонами или скальпелем. Тампоны с материя лом помещают в стерильные пеницилли новые флаконы или пробирки с 2-3 мл стерильной физиологического р-ра или р-ра Хенкса, содержащего 500-1000 ЕД/мл антибиотике (канамицина, мономицина, неомицина, пенициллина, стрептомицина и др.). Из крови после свертывания стерильно сливают 3-4 мл сыворотки и доставляют в лабораторию.

От животных, убитых с диагностической целью, берут с соблюдением правил асептики кусочки легких с бронхом (на границе пораженного и здорового участков), селезенки, средостенные, бронхиальные и брыжеечные лимфоузлы, миндалины, пораженные участки слизистых оболочек носовой и ротовой полостей, трахеи, ЖКТ, а также пробу крови. Кусочи материала массой до 20 г помещают в стерильную, плотно закрывающуюся посуду. Легче вирус выделить в начале болезни и в период обострения из крови, легких, различных учая ков тонкого кишечника (в особенности из клеток слизистой оболочки 12-перстной кишки лимфоузлов и селезенки. При хроническом течении болезни его удается регулярно выделяй из разных отделов кишечника, но не из крови. Исследование носовых смывов и фекалий в этих случаях также дает отрицательные результаты, хотя в отдельных случаях вирус выделяли из фекалий даже через 5 мес после болезни. В начале болезни в период поди ема температуры от больных животных берут пробы крови в р-р цитрата натрия или геля рина и помещают их в термос со льдом. Из крови экспериментально зараженных животных выделяли вирус с 1-14-го дн после заражения. Выделяли его также из тканей абортированных или мертворожденных плодов, плаценты и околоплодной жидкости.

Заражение культур клеток. Вирус выделяют в первичных субкультурах клеток эмбриона КРС (ПЭК, ЛЭК, СЭК) или ТБ. Изолят считается выделенным в случае, если он вызывает стабильное однотипное ЦПД не менее чем в 2-х последовательных пассажах. В этом случае возможна его идентификация в РН. В первичных культурах клеток почки эмбриона коров первые ЦПИ обнаруживают через 2-5 дн после инокуляции. Они выражаются в появлении мелкозернистой инфильтрации в клетках фибробластоидного типа. По мере развития инфекции клетки постепенно отторгаются от поверхности стекла, но некоторые долго сохраняются, образуя островки клеток эпителиоидного типа. В конце концов на стекле остается только сеть зернистого материала.

При использовании вторичных культур клеток цитопатические изменения появляются почти одновременно во всех клетках монослоя, причем они становятся удлиненными, угловатыми и кажутся переплетенными. В окрашенных препаратах клеточного монослоя при наличии цитопатических изменений обнаруживают вакуолизацию протоплазмы и изменение ядер, выражающиеся в сокращении мембраны, пикнозе и кариорексисе. В некоторых случаях вакуолизация бывает так выражена, что ее наблюдают при микроскопии неокрашенных препаратов. Развитие ЦПИ не соответствует возрастанию титра вируса. К 72-96 ч после инокуляции, когда титры вируса достигают максимума (10 5,5 -10 6,5 ТЦД₅₀), отмечают лишь начало ЦПД. При отсутствии ЦПД в 3-х последовательных пассажах клеток 4-й пассаж проводят с попыткой выявления вируса в монослойной культуре на покровных стеклышках в ИФ. При отрицательной реакции дальнейшее исследование прекращают. Однако отрицательный результат в этом случае не дает права на постановку диагноза. Для идентификации таких штаммов японские исследователи предлагают использовать феномен экзальтации вируса БН в присутствии возбудителя ВД-БС. Сущность метода сводится к появлению ЦПИ при совместном выращивании этих агентов в культурах клеток тестикулярной ткани КРС. Методика исследования заключается в следующем. Диспергированные трипсином клетки тестикулярной ткани КРС суспендируют до концентрации 210 6 клеток в 1 мл в 0,5%-ном р-ре ГЛАХ с сывороткой КРС, проверенной на отсутствие ВНА к возбудителю ВД-БС. Суспензию распределяют по 0,5 мл в пробирки. В каждую из них инокулируют по 0,5 мл вирусного материала (разведенного ВД) и инкубируют при 37°С в наклонном стационарном положении. В качестве контроля в каждый опыт включают не инокулированные культуры. После 4 дн инкубцрования жидкость удаляют, а культуры заражают вирусом БН (10 6 БОЕ в 0,5 мл среды). После дополнительного 3-дн инкубирования при 37°С культуры исследуют на наличие ЦПД. В культурах, первоначально инфицированных нецитопатогенным штаммом ВД, после заражения вирусом БН появляется четко выраженные ЦПИ. В контрольных культурах один вирус БН обычно не вызывает ЦПИ. Незараженные культуры, в которые не вводили ни одни из вирусных агентов, должны оставаться нормальными.

Для пассирования не цитопатогенных штаммов культуры, инокулированные вирусом диареи каждого пассажа, инкубируют 3 дн при 37°С, после чего собирают культуральную жидкость, которую используют для дальнейших пассажей, а культуры инфицируют вирусом БН и дополнительно инкубируют для индикации ВД при помощи феномена экзальтации.

Заражение телят. Биопробу на телятах ставят в тех случаях, когда попытки выделить специфический вирус оказались безуспешными или возникает сомнение в его наличии в связи с тем, что в зараженных культурах клеток нет ЦПИ. Используют телят 2-6-мес возраста, проверенных на отсутствие ВНА к ВД, или телят 4-6-дн возраста, полученных из благополучного хозяйства. В качестве материала для заражения используют культуральную жидкость 3-5 пассажей, 5-10 мл которой вводят внутривенно. Если в исследуемом материале есть вирус диареи, у телят на 4-7-й день после заражения отмечают повышение температуры, лейкопению, появление слизистых истечений из носовой полости и диарею; у некоторых животных могут отмечаться тенезмы. В случае положительного результата у зараженных животных вирус сравнительно легко удается выделить из крови. В наибольшей концентрации (10 3 -10 5 ИД₅₀/мл) вирус обнаруживают через 4 дн после заражения, хотя присутствие его в крови подтверждается на протяжении 15 дн.

ИФ. Аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции. Этим методом АГ ВД обнаруживают в клетках слизистой оболочки прямой кишки, селезенки, легких и лимфоузлов экспериментально зараженных животных. Изучено распределение АГ ВД-БС в тканях животных остром и хроническом течениях болезни. В лимфоидных тканях АГ располагается в клетках системы фагоцитирующих мононуклеаров. Между первоначальным обнаружением АГ в слизистой кишечника, кератинизированном эпителии верхних отделов пищеварительной системы и кожи и прогрессированием патологических признаков имеется скрытый период.

ИФ биопсийного материала слизистых оболочек ротовой и носовой полостей пригодна для ранней прижизненной диагностики вируса диареи. ИФ для обнаружения АГ вируса в клетках из носоглоточных смывов — надежный и быстрый способ выявления животных, персистентно инфицированных вирусом. При исследовании препаратов обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме не разрушенных клеток. Яркая зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. Удобным оказался непрямой метод ИФ с использованием конъюгированных РаЬ-фрагментов АТ из гипериммунной свиной сыворотки против ВД-БС КРС. Специфическая флюоресценция вирусного АГ в культуре бычьих макрофагов обнаруживалась в цитоплазме клеток. Для идентификации не цитопатогенных изолятов метод ИФ практически единственный. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной флюоресценции проводят окончательное типирование вируса в РН.

РН. Это основной метод идентификации вируса. Новые изоляты возбудителя ВБ-БС, не обладающие цитопатогенной активностью, могут быть идентифицированы при помощи гипериммунной сыворотки к вирусу диареи по подавлению феномена экзальтации вируса НБ, который используют для индикации подобных штаммов.

РДП. Обеспечивает быструю и точную постановку диагноза, однако пока чувствительность метода невелика, и его следует использовать в комплексе с другими методами лабораторной диагностики и идентификации возбуди теля. Приготовление испытуемого АГ и методика постановки РДП описаны ранее. Антисыворотку для РДП готовят на КРС. Для иммунизации животных используют нитрированную кровь, взятую асептически от экспериментально зараженных животных в период подъема температуры. Кровь вводят внутривенно (некоторым животным делают несколько таких инъекций). Кровь берут через 60-90 I дн после инокуляции.

Выявление вируса ПЦР. Данный метод рекомендован для быстрой диагностики ВД-БС. После цикла обратной транскрипции образцы ткани инфицированной культуры клеток . подвергают амплификации с использованием праймеров, обеспечивающих репликацию определенного сегмента гена белка gр48 ВД. Для обнаружения амплифицированных последовательностей используют электрофорез в ПААГ и гибридизацию с биотинилированным, ДНК-зондом на последовательности генома вируса лейкоза. При идентификации молочных стад, инфицированных вирусом ВД-БС КРС, также предложен метод ПЦР для работы с пробами молока. Вирусную ДНК выделяют из соматических клеток цельного молока методом экстракции изотиоцианатом гуанидина и фенолом-хлороформом. При острой инфекции РНК вируса обнаруживалась через 6-10 дн после заражения, а при хронической — с использованием обоих праймеров (5′-нетранслируемая область (S’-НТ) и область р80) до разведения молока 1:640. ПЦР оказалась в 14,6 раза чувствительнее других методов выде ления вируса. Для выяснения РНК ВД методом ПЦР необходимо не менее 580 соматических клеток, тогда как для выделения вируса — не менее 8500 клеток. Чувствительность и специфичность ПЦР подтверждена гибридизацией по Соузерену. Чувствительность метода превышает чувствительность выделения вируса в культуре клеток в 10 2 -10 4 раза. Показана возможность обнаружения персистентной инфекции ВД-БС КРС методом ДНК-гибридизации и ПЦР.

Биотинилированные зонды комплементарной ДНК уже широко используются для обнаружения пестивирусов (КЧС, ВД-БС КРС и ПБО). В Бельгии разработан метод обнаружения специфических АТ к ВД с помощью ИФА, проводимого с рекомбинантным АГ и монАТ. ИФА с монАТ удобен для выявления виремии у животных; с его помощью в лейкоцитах обнаруживали 2 родственных неструктурных белка (р80К и р120-130К). Вирусный АГ был обнаружен в В- и Т-лимфоцитах, моноцитах. Помимо общепринятого метода ИФА предложена иммуноферментная реакция захвата АГ ВД КРС в лимфоцитах периферической крови КРС. В реакции для захвата АГ используют монАТ к консервативному АГ домену неструктурного белка (р125/р80) ВД.

Кроме ИФА разработан и предложен метод взаимодействия специфической антисыворотки с вирусным АГ ВД в лимфоцитах инфицированных животных с помощью проточной цитометрии. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Для повышения чувствительности реакции лимфоциты фиксируют, их клеточные мембраны солюбилизируют, и вирусный АГ выявляют при использовании биотинилированных Ig из антисыворотки свиней с последующей инкубацией с ФИТЦем, конъюгированным авидином.

ИФА. ИФА позволяет легко идентифицировать культуры клеток, инфицированные В Д. Идентификация с помощью монАТ в практическом диагностическом применении не разработана. Однако получено 5 монАТ (XI А9, АЕЗЕ2, АМ2G5, ВТ48, ВТ6G9) против вируса ВД-БС КРС с ВН-активностью, которые позволили разделить изоляты ВД на 4 группы. Получена и изучена панель монАТ против Singer-изолята, с помощью которой были обнаружены полипептиды мол.м. 56-58 кД и доказано, что гликопротеин, локализуется на поверхности вирионов и является носителем нейтрализующих эпитопов. Анализ с панелью монАТ показал АГ гетерогенность среди изолятов этого вируса.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Серодиагностика заболевания затруднительна, так как при хроническом течении инфекции АТ обнаруживаются непостоянно и бывают в невысоких титрах. Диагноз на прошедшую инфекцию, а также латентное вирусоносительство обычно ставят при помощи РН в культуре клеток, определяя титры АТ в сыворотках реконвалесцентов. Для этого лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом 3-4 нед. При диагностике скрытого течения инфекции чаще используют сыворотки крови убойного скота, поступающего с клиникой не диагностированной инфекции кишечного и респираторного трактов. Обычно в таких случаях процент положительных сывороток (титры от 1:16 до 1:128) варьирует в широких пределах и может достигать 30-50 (иногда до 80). У клинически здоровых животных процент положительных проб может колебаться от 6-8 до 20-30. Динамика появления и угасания титров ВНА недостаточно изучена. Перед исследованием сыворотки прогревают в водяной бане при температуре 57-58°С 30 мин.

В США разработан быстрый количественный метод титрования ВД КРС. Он состоит в микротитровании с использованием цитопатогенных и не цитопатогенных изолятов вируса и перевиваемой линии клеток бычьей почки — МДВК. Для этого серийные разведения вирус-содержащей жидкости и суспензию клеток в концентрации 1-10 5 в среде с 2% сыворотки крови лошади заливают в лунки пластин Теrasaki и проводят микротитрование в НИФ, которую учитывают на дне лунок пластин, используя водно-иммерсионный объектив микроскопа. Вирус также титруют и по бляшкообразованию. Специфическую флюоресценцию в клетках наблюдали уже через 12 ч после заражения, окончательные результаты считали через 72 ч инкубирования. Результаты титрования вируса по бляшкам и в микротитровании совпадали. Микротитрование вируса по ИФ имеет ряд преимуществ над стандартным методом титрования по бляшкам: требует меньше времени и материалов и особенно незаменимо при титровании не цитопатогенных изолятов ВД.

РН. Её ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой стам дартного вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Положительными считают сыворотки титром АТ 1:16 и выше, в парных сыворотках — повышение титра АТ во второй пробе в раза и более. При экспериментальном заражении у всех телят через 15-61 день обнаруживали ВНА в титре 1:64 — 1:1024. Реакция, суть которой заключается в подавлении образованя бляшек АТ исследуемой сыворотки, оказалась пригодной для серологических исследований при ВД-БС. После получения гомогенного слоя клеток культуру промывают 1 раз фосфатным буферным р-ром и заражают 15 мл суспензии вируса в таком разведении, чтобы в 1 мл ее содержалось около 20 БОЕ. После адсорбции вируса при 37°С в течение 30 мин суши зию отсасывают и наносят на культуру 15 мл агара. После застывания агара на его повед ности раскладывают кружки фильтровальной бумаги, насыщенной неразведенной иссм дуемой сывороткой. После 4 дн инкубации при 37°С учитывают результаты. Доказательством того, что исследуемая сыворотка содержит АТ, служит отсутствие повреждения слоя клеток вокруг насыщенного ею кружка фильтровальной бумаги, что обнаруживается в виде венка клеток.

РСК. Ставят микрометодом с использованием микротитратора Такачи или Титертека. При их отсутствии возможна постановка РСК в пробирках в общем объеме 0,5 мл.

РДП. Не нашла широкого применения в ветеринарной диагностической практике при обнаружении АТ в сыворотках животных. ПА появляются в сравнительно поздние сроки (3-4 нед) после инфицирования и могут сохраняться 4 мес (титры АТ до 1:16).

ЕLISА. В 500 раз чувствительнее РН, менее трудоемок и быстрее выполним. В качесм АГ использовали вирус, концентрированный ПЭГ и очищенный градиентным равновесии ультрацентрифугированием. Оптимальная концентрация АГ составляла 1 мкг на лунку.

Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза на ВД-БС необходимо исключить ИРТ, аденовирусную инфекцию, ПГ-3, злокачественную катаральную лихорадку, ящур, паратуберкулезный энтед и др. Ввиду того, что ВД-БС может проявляться в различных формах (от острой до латентной), часто ассоциируется с такими инфекциями, как ПГ-3, аденоинфекция, хламидиозы др., для окончательного диагноза необходимы лабораторные исследования. Лишь в качесд подозрения на ВД-БС следует учитывать быстрое распространение в стаде болезни, сопровождающейся лихорадкой, диареей, эрозиями в ротовой полости и ранней лейкопенией.

Лабораторная диагностика парагриппа -3 крупного рогатого скота

Парагрипп-3 (ПГ-3) КРС (транспортная лихорадка КРС, параинфлюэнца-3) — острая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания.

В настоящее время ПГ-3 зарегистрирован во всех странах мира с развитым животноводством.

Лабораторная диагностика включает: а) обнаружение АГ в патологическом материале (мазках, отпечатках, срезах), полученном от больных животных в РИФ; б) выделение возбудителя из патологическо го материала в культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) или легких эмбриона коровы (ЛЭК) и его идентификацию в РТГА, РИФ и др.; в) выя вление АТ в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РТГА. Лабораторную диагностику ПГ-3 проводят с использованием набора диагностикумов, выпускаемого биологической промышленностью. Ее обычно ведут параллельно с исследованием материала на аденовирусную и РС-инфекции, ИРТ и ВД-БС КРС. Схема проведения исследований на ПГ 3 аналогична схеме диагностики аденовирусной инфекции КРС. Предварительный диагно: на ПГ-3 ставят в течение 2-3 дн на основании положительных результатов обнаружения АГ в патологическом материале в РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологоанатомических изменений, а окончательный — в течение 10-30 дн на основании совпадения результатов РИФ с выделением и идентификацией вируса. В настоящее время для быстрой индикации вируса ПГ-3 может быть использована ПЦР; г) обнаружение 4-кратного и более прироста АТ в парных пробах сывороток.

Выделение вируса. Ввиду малой устойчивости парагриппозного вируса испытуемый материал рекомендуется помещать в контейнеры с обычным льдом, немедленно доставлять в лабораторию и сразу же использовать для заражения культуры клеток. Если сделать это невозможно, нужно заморозить материал в смеси сухого льда и спирта и хранить при — 20-60°С до исследования.

ВПГ-3 выделяют в первичных субкультурах клеток ПЭК, ЛЭК, ПТ, ТБ и др., которые готовят по общепринятой методике. Для парагриппозных вирусов характерным является диффузный характер РГАд, которая проявляется раньше, чем ЦПД вируса.

Первые ЦПИ зараженной культуры можно наблюдать иногда спустя 48 ч после инокуляции. Они состоят в появлении округлившихся клеток, сильнее преломляющих свет, в дальнейшем образуется синцитий и дегенерация клеток. При отрицательном результате в первом пассаже проводят второй пассаж на том же виде культуры клеток. Параллельно с пробирочными культурами ее выращивают и на покровных стеклах для ИФ. Всего рекомендуется не менее 4-х «слепых» пассажей. Изолят считают выделенным, если он вызывает стабильное однотипное ЦПД и положительную ГАд. В этом случае возможна его идентификация в РТГАд, РН, РТГА и других реакциях. Метод выделения вируса на эмбрионах менее чувствителен, чем заражение культур клеток и применяется сравнительно редко.

Заражение естественно-восприимчивых животных. Применяют редко вследстви; дороговизны и большой трудности в подборе телят, восприимчивых к ПГ-3, не имеющих специфических АТ. Заражать восприимчивых животных вирусом ПГ-3 лучше нанесением на слизистую оболочку носовой полости и трахеи. От экспериментально зараженных телят вирус удается выделить из экссудата носовой полости во время подъема темпера туры или же из крови на 4-6-й день после интраназального и на 2-й день после внутривенного заражения. С носовым истечением вирус обычно выделяется со 2-го по 10-й день.

Индикация и вируса. В клетках НеLа и КВ вирус размножается менее активно, чем в клетках почки теленка. В культуре этих клеток, а также клеток почки обезьяны, помимо синцития, вирус вызывает образование цитоплазматических, а иногда внутриядерных включений. Их находят и в эпителиальных клетках бронхов и бронхиол.

Для ускоренной индикации вирусов ИРТ, ПГ-3 стафилококки обрабатывают иммунной сывороткой. Готовят мазок, на который наносят исследуемый вируссодержащий материал, обрабатывают его иммунной противовирусной сывороткой и вирусспецифическим иммуноглобулином, меченым ФИТЦем. По специфическому свечению на поверхности стафилококка осуществляют индикацию вируса. При использовании ускоренного метода индикации время индикации сокращается до 3-4 ч.

РИФ. В основном АГ локализуется в цитоплазме клеток, однако в ранние сроки инфицирования одновременно наблюдается свечение ядрышек. Парагриппозный АГ выявляют в первые дни болезни и до 10- 14 дня. При осложненных формах болезни АГ выявляют более длительное время. В некоторых случаях его удается выявить даже во время инкубационного периода, за 1-2 дня до появления клинических симптомов. Специфичность ИФ составляет 94% при сопоставлении с результатами серологического исследования. Существует однозначное мнение о большей чувствительности ИФ по сравнению с РГАд при индикации па-рагриппозных вирусов, что делает ее перспективной для быстрой диагностики.

РТГАд. Является быстрым методом идентификации выделенного вируса. Для этого используют иммунные сыворотки кроликов или морских свинок. РТГАд ставят общепринятым методом с эритроцитами морской свинки. Исследуемый вирус считают идентифицированным, если иммунная сыворотка к ПГ-3 блокирует гемадсорбцию.

РНГАд. Используют 100 ГАд единиц вируса. По реакции гемадсорбции вирус ПГ-3 можно титровать в культуре ткани, используя для заражения культуры последовательные 10-кратные разведения. После 3 дн инкубации ставят РГАд с содержимым всех пробирок и регистрируют наличие гемадсорбции. За одну ГАд единицу принимают конечное разведение вируса, вызвавшего гемадсорбцию. Положительная РГАд в контрольных пробирках, отсутствие реакции в пробирках со смесью вируса и сыворотки свидетельствует об идентичности выделенного вируса данному типу сыворотки.

РТГА. Применяется для типирования выделенного вируса при наличии в жидкой фракции зараженных культур клеток гемагглютинина в титре, достаточном для выбора 4 ГАЕ. Следует иметь в виду, что вирус парагриппа, выращенный в культуре клеток почки КРС, агглютинирует эритроциты гусей, индюков и морских свинок, в отличие от эритроцитов кур и уток. Агглютинация развивается в следующие сроки: эритроциты гусей за — 1-3 мин, индюка — за 2-5, морской свинки — за 60-90 мин. Наиболее высокие и стабильные титры выявляются с эритроцитами индюка и при значениях рН: эритроциты гусей при 5,7; индюка 5,7-7,2; морской свинки 6,8-7,2. Иммунные сыворотки, используемые в РТГА, должны быть освобождены от термолабильных и термостабильных ингибиторов, для этого сыворотки прогревают при 56°С 30 мин и обрабатывают каолином или фильтратом холерного вибриона. РТГА ставят общепринятым методом.

Иммуноферментная идентификация. Сотрудниками ВНИТИБП разработана методика идентификации вируса ПГ-3 в ЕLISА.

Иммунодиффузия (ИД) может быть с успехом использована для диагностики ПГ-3 инфекции. В ИД выявлено 2 линии преципитации, что соответствует 2-м АГ ПГ-3.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При серологической диагностике ПГ-3 КРС исследуют парные сыворотки телят или взрослых животных для выявления прироста АТ. Интервал между взятием проб 2-3 нед. РГА, РН, РЗГАд и РСК дают в целом идентичные результаты при исследовании АТ в период развития болезни и реконвалесценции. Однако РТГА самая чувствительная и самая простая. Кроме исследования парных сывороток крови, при серодиагностике ПГ-3 рекомендуется метод выявления секреторных АТ в РТГА. Для этого берут парные пробы носовых секретов от 8-10 животных, проявивших клинические признаки болезни (повышение температуры, истечения из носовой полости и др.), и повторяют исследования через 6-8 дн.

Перед постановкой РТГА пробы размораживают, центрифугируют 10 мин при 2 000 мин- 1 , затем обрабатывают следующим образом: к 0,2 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл 20%-ной суспензии эритроцитов морской свинки, встряхивают, выдерживают 30 мин при 4°С, 10 мин центрифугируют при 1500 мин- 1 ; надосадочную жидкость в объеме 0,3 мл смешивают с 25%-ной суспензией каолина на физиологическом р-ре, встряхивают 25 мин, центрифугируют 15 мин при 2000 мин- 1 . После этого надосадочную жидкость используют в РТГА.

Положительный результат исследования на ПГ-3 считают в случае выявления АТ во 2-й пробе носовых секретов в титре 1:16 и выше (при отсутствии титров АТ в 1-й пробе) или установления 4-кратного и более увеличения титра АТ во 2-й пробе носовых секретов по сравнению с 1-й.

При положительной РНГАд в контролях вируса (пробирки с культурой клеток, куда был внесен вирус в рабочем разведении с равным объемом питательной среды), учитывают её отсутствие в пробирках, куда была залита смесь того или иного разведения сыворотки и вируса. Диагностическим является не менее чем 4-кратный прирост нейтрализующих гемадсорбцию АТ в реконвалесцентной сыворотке по сравнению с сывороткой, взятой в начале болезни. РСК не нашла широкого применения в ветеринарной диагностической практике.

Максимальный срок обнаружения АТ в сыворотках крови телят после инфицирования вирусом ПГ-3 точно не установлен. Ряд исследователей полагают, что АТ сохраняются в течение 4-6 мес. Уровень образования ВНА и анти-ГА достигал пика 1:320 и выше к 14-21 дню после заражения. ЕLISА широко используется за рубежом для индикации и титрования АТ. Он в 4 — 64 раза чувствительнее, чем РТГА.

Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза на ПГ-3 необходимо исключить ИРТ, ВД-БС, адено- и РС-инфекции, имеющие очень сходные эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные. Поэтому материал, поступивший с подозрением на ПГ-3, в лаборатории исследуют параллельно на все вышеуказанные инфекции.

Лабораторная диагностика лейкоза

Лейкоз КРС — хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основной признак которой — злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли.

Лейкозы животных диагностируют почти во всех странах мира. Наиболее широко они распространены в США, ряде стран центральной Европы, Дании, Швеции и странах ближнего Востока.

В нашей стране возникновение лейкоза связано с завозом племенного скота в 1940, 1945 – 1947 гг. из Германии в хозяйства Западной Сибири, Московской, Ленинградской, Калининградской областей, а также Украины, Латвии и Литвы. В дальнейшем лейкоз распространился в Таджикистан, Псковскую, Новгородскую области.

В естественных условиях ВЛКРС распространен среди КРС, овец, зебу и буйволов.

Вирус лейкоза КРС (ВЛКРС) относится к семейству Retroviridae, роду ретровирусов лейкоза КРС и Т-клеточного лейкоза человека. ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью и индуцирует синтез ВНА и КСА. ГА свойства. ВЛКРС агглютинирует только эритроциты мышей

Диагноз на лейкоз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований, которые включают гематологические и гистологические, а также серологические исследования.

Основные характеристики некоторых ретровирусов

Все формы лейкоза характеризуются увеличением в различной степени лимфоузлов. При лимфолейкозе они увеличены равномерно, не сращены с окружающими тканями, капсула снимается легко, на разрезе узлы серо-белого цвета, сочные и саловидные. Лимфоузлы при лимфогранулематозе, лимфосаркоме и гистиоцитарной саркоме бугристые, капсула сращена с паренхимой, на разрезе часто обнаруживают кровоизлияния и некрозы; в органах брюшной, тазовой полостей, на серозных оболочках отмечают опухолевые разрастания узлов в виде конгломератов серо-белого, желто-серого цвета. Селезенка при лимфоидном и миелоидном лейкозах увеличена. При первых 2-х формах она буро-красного цвета с четко выраженной красной и белой пульпой за счет гиперплазии фолликулов. В более поздней стадии болезни граница между белой и красной пульпой стерта. При миелоидном лейкозе селезенка красно-малинового цвета, фолликулы плохо заметны, а в отдельных участках отсутствуют, ткань рыхлой консистенции с кровоизлияниями. При лимфоретикулосаркоме селезенка не увеличена. При всех формах лейкоза отмечают очаговые или диффузные разрастания серо-белого или серо-розового цвета в печени, почках, толще сердечной мышцы, органах пищеварения, матке, скелетных мышцах, диафрагме и других органах.

Взятие и подготовка материала. Для гематологического исследования кровь берут из времной вены в пробирки с антикоагулянтом — 10 %-ном р-ром динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон Б) из расчета 0,02 мл р-ра на 1 мл крови. Не разрешается брать кровь от животных за 15 дней до отела и 15 дней после него. Для серологического исследования кровь берут от животных в возрасте 6 мес и старше. В лабораторию в термосе со льдом направляют 5-6 мл сыворотки. Для гистологического исследования кусочки пораженных органов (селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца и правого ушка сердечной мышцы, стенки сычуга, матки и скелетных мышц) посылают в свежем виде в термосе со льдом или в 10%-ном р-ре формалина.

источник

Для диагностики бешенства используют

Добавить комментарий Отменить ответ