Фиксированный вирус бешенства штамм cvs

Изобретение предназначено для получения средства специфической профилактики против бешенства. Вакцина против бешенства содержит авирулентный мутант штамма SAD Berne вируса бешенства. Штамм характеризуется тем, что содержит в положении 333 природную глутаминовую кислоту, кодон которой отличается от кодонов аргинина по крайней мере двумя нуклеотидами. Штамм депонирован в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов и имеет регистрационный номер C. N.С.М. 1-1238. Штамм получен путем отбора с использованием моноклональных антител, нейтрализующих штамм SAD и нейтрализующих штамм ТAG 1. Штамм и вакцина на его основе характеризуются повышенной безопасностью и эффективностью. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Изобретение относится к новой вакцине против бешенства.

Вирус бешенства является рабдовирусом, содержащим пять протеинов, в котором один внешний протеин, гликопротеин, инициирует синтез нейтрализующих антител у привитых животных. Введение очищенного гликопротеина защищает животное от внешней инфекции. Наиболее используемые штаммы вируса бешенства, а именно штаммы CVS и SAD, которые происходят от штаммов SAD, таких как SAD Berne и SAD B19, описаны в «Rabies Viruses», H.F. Clark и T.I. Wictor-Strains of Human Viruses, изд. Majer and Plotkin Karger, Bale, 1972, стр. 177 — 182. Последовательность аминокислот гликопротеина штамма CVS описана Yelverton и др. в «Rabies virus glucoprotein analogs: biosynthesis in Escherichia coli» Science 219, 614 — 620.

Этот гликопротеин содержит два основных антигенных различных сайта, связанных с нейтрализацией вируса /сайты II и III/. Сайт III в положении 330 — 340 содержит аргинин 333, который определяет вирулентность этого штамма.

Последовательность аминокислот гликопротеина штамма SAD Berne не установлена полностью. Однако можно определить, что антигенный сайт III гликопротеина штамма SAD Berne идентичен этому же сайту гликопротеина штамма CVS.

Используемые в настоящее время вакцины против бешенства являются либо вакцинами, полученными из инактивированного вируса, либо вакцинами, состоящими из вирусных штаммов, вирулентность которых уменьшена, либо рекомбинантными вирусами /например, вакцина/.

Инактивация вируса может быть осуществлена различными способами, в частности химическими способами, такими как обработка формолом или -пропиолактоном.

Главным недостатком способа получения вакцины является работа с вирулентными штаммами, что требует точного соблюдения условий работы, и создает риск отравления для работающего персонала.

С другой стороны, инактивированные вакцины, вводимые оральным путем, не обладают защитными свойствами.

Снижение вирулентности вирусных штаммов основано на хорошо известной методике; оно может быть осуществлено, например, последовательным пропусканием вирусных штаммов через хозяина другого вида штамма /кролика или мыши, например/ или через клеточную культуру. Получают таким образом штаммы, несвойственные первоначальному хозяину, и, следовательно, менее патогенные при сохранении их вакцинирующей способности.

Штаммы SAD, такие как SADB19 и SAD Berne, являющиеся доступными, являются ослабленными штаммами и были испытаны в Европе для вакцинации лисиц. Они могут быть смешаны с приманкой для орального введения. Однако эти штаммы проявляют патогенность на других видах животных и на человеке. Следовательно, они создают потенциальный риск отравления, что значительно уменьшает интерес к этим штаммам для оральной вакцинации.

Действительно, например, оральное введение штамма SAD Berne группе из 23 диких грызунов, выбранных среди Apodemus flavicolus et sylvaticus, Arvicola terrestris, Clethrionomys clareolus, Minotus agresti, вызывает смерть от бешенства двух животных.

Испытания на мышах также показывают, что штамм SAD Berne является патогенным для этого типа животных, как при внутричерепном, так и при внутримышечном введении, как это показывают кривые на фиг. 1a и 1b, на которых соответственно показано:
фиг. 1a — кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, вводимых интрацеребральным путем (в единицах образующих пятна, ЕОП);
фиг. 1b — кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, введенных внутримышечным путем (в единицах, образующих пятна).

При оральном пути введения у мышей отмечается 10%-ная смертность при дозе 10 5,5 ЕОП.

Штамм SAD Berne, применяемый как таковой в вакцинационной кампании на лисицах, представляет опасность для дикой фауны и человека. Это же относится и к штамму SAD B19.

Для устранения этого недостатка уже предлагалась авирулентная вакцина против бешенства. Эта вакцина, описанная в заявке на патент EP 350398, содержит авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, который характеризуется тем, что вместо аргинина 333 гликопротеина он имеет аминокислоту, отличающуюся от лизина, например глицин, изолейцин или серин.

Этот мутант получают заменой одного нуклеотида в кодоне аргинина 333.

К сожалению, этот мутант может при простой обратной мутации вновь дать родительский штамм.

Следовательно, эта вакцина, используемая оральным путем, не всегда безопасна для животных других видов.

Настоящее изобретение относится к эффективной вакцине, которая позволяет устранить указанные недостатки.

Вакцина по изобретению включает авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, который характеризуется тем, что вместо аргинина 333 гликопротеина он содержит природную аминокислоту, кодон которой отличается от кодонов, кодирующих аргинин двумя нуклеотидами.

Изобретение относится также и к способу получения авирулентного мутанта, указанного выше. Этот способ включает:
1) отбор, исходя из штамма SAD вируса бешенства, мутантов, которые не нейтрализованы моноклональными антителами, нейтрализующими вышеупомянутый штамм SAD, но не нейтрализующими штамм TAG1, описанный ниже;
2) отделение путем секвенирования области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) от мутанта, содержащего в положении 333 лизин;
3) получение моноклонального антитела, которое одновременно нейтрализует вышеупомянутый штамм SAD и мутант, полученный на стадии 2), но не нейтрализует штамм TAG1;
4) проведение повторного отбора из мутантов, полученных на стадии 1) с помощью моноклонального антитела, полученного на стадии 3).

Моноклональные антитела, используемые при отборе мутантов по изобретению, получают слиянием клеток миеломы и клеток, производящих антивирусные антитела по методике гибридизации, описанной KOHLER et MILSTEIN, в журнале NATURE, 256, 495 — 497 /1975/, эта методика широко известна в настоящее время специалистам.

Согласно этой методике можно подвергать слиянию клетки, происходящие от различных видов, однако предпочтительными являются клетки животного одного и того же вида. Например, используют преимущественно, с одной стороны, клетки миеломы мыши и, с другой стороны, клетки селезенки мыши, предварительно иммунизированные штаммом вируса бешенства согласно протоколу, приведенному ниже.

В основном, этот способ гибридизации, описанный для клеток мышей, включает следующие стадии:
1) иммунизация мышей заданным количеством вируса, инактивированного -пропиолактоном;
2) извлечение селезенки у иммунизированной мыши и отделение спленоцитов;
3) слияние полученных таким образом спленоцитов с клетками миеломы мыши в присутствии стимулятора слияния;
4) культивирование полученных гибридных клеток в избирательной среде, в которой не развиваются неслившиеся клетки миеломы, в присутствии усваиваемых элементов;
5) отбор клеток, вырабатывающих желаемые антитела и клонирование этих клеток.

Протокол иммунизации включает внутрибрюшинное введение мышам Balb-C 100 мкг инактивированного -пропиолактоном вируса CV5 с адъювантом Фрейда и повторную инъекцию внутривенным путем за 4 дня до слияния клеток после периода отдыха в течение 1 месяца.

Спленоциты иммунизированных мышей собирают после извлечения селезенки классическим способом.

Клетки миеломы мышей, используемые для получения нейтрализующих моноклональных антител, являются клетками миеломы мышей Balb-C, происходящих из колонии SP 2 O. Эти клетки миеломы были отобраны с точки зрения их чувствительности к аминоптерину и культивированы в соответствующей среде, такой как основная среда Игла, модифицированная DULBECCO (Dulbecco Modified Eagle medium), называемая далее среда DMEM, к которой добавлено 15% сыворотки жеребенка.

Слияние клеток миеломы со спленоцитами осуществляют путем смешивания 5 10 7 клеток миеломы с 5 10 7 клеток селезенки иммунизированной мыши в присутствии стимулятора слияния, такого как, например, полиэтиленгликоль.

После инкубации при 37 o C клетки промыват в среде DMEM и вновь суспензируют, затем культивируют в избирательной среде, предназначенной исключительно для роста гибридных клеток. Эта среда содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин.

Отбирают затем супернатанты культур, спустя 7 — 20 дней после слияния клеток, приводя во взаимодействие супернатанты с суспензией вируса CVS и удерживая антитела, которые нейтрализуют вышеупомянутую суспензию.

Термин «антитело, нейтрализующее вирус» обозначает такие антитела, которые при помещении их в суспензию данного вируса ингибируют его вирулентность.

Нейтрализующая способность моноклональных антител, полученных выше, определяется классическим способом, хорошо известным специалисту. Этот способ состоит в смешивании 100 мкл суспензии вируса с содержанием вируса 1000 ЕОП и 100 мкл супернатанта культуры гибридомы, в инфицировании культуры клеток этой смесью и, после 4 дней инкубирования, в подсчете лизированных пятен на агаре по методу, описанному BUSSEREAU et al., 1982, J. Virol. Meth. Vol. 4, стр. 277 — 282. Антитела являются нейтрализаторами, если они ингибируют образование пятен на агаре в вышеупомянутых условиях.

Среди этих антител отбирают затем антитела, которые не нейтрализуют авирулентный мутант TAG1, производный штамма CVS, представленный в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (C.N.C.M. — Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes) Института Пастера — Франция 12 апреля 1985 под N 1-433. Полученные моноклональные антитела, которые нейтрализуют штамм CVS, но не нейтрализуют авирулентный мутант TAG1, позволяют селекционировать авирулентные мутанты исходя из любого штамма вируса бешенства, который нейтрализуется этими моноклональными антителами.

Моноклональные антитела, полученные таким образом, являются антителами, нейтрализующими также штаммы SAD вируса бешенства. Они подходят также для осуществления первичного отбора по способу изобретения.

Секвенирование области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) осуществляют по классической методике, хорошо известной специалисту [SANGER et al., 1977, Proc. Nat. Acad.Sci. USA, vol. 74, p. 5463 — 5467].

Это секвенирование позволяет изолировать мутант, который имеет в положении 333 гликопротеина лизин; этот мутант именуется далее «мутант SK».

Кодон /AAA/ этой аминокислоты /лизина/ отличается от кодона аргинина в положении 333 штамма SAD единственным нуклеотидом, причем кодон аргинина в положении 333 имеет строение AGA.

Далее переходят к получению моноклонального антитела, нейтрализующего одновременно штамм SAD и мутант, полученный выше.

Это моноклональное антитело получают удерживанием среди моноклональных антител, нейтрализующих SAD и не нейтрализующих TAG1, такого, который нейтрализует равным образом лизиновый мутант или мутант SK, полученные выше.

Это моноклональное антитело позволяет осуществить второй отбор /стадию 4/ способа по изобретению.

Патогенная возможность мутантов, полученных после второй селекции, определяется путем интрацеребральной инъекции 10 5 ЕОП взрослым мышам. Мутанты, которые не убивают при этой дозе и при этом методе введения, рассматриваются как авирулентные.

Мутанты по изобретению являются двойными авирулентными мутантами штамма SAD, в частности штамма SAD Berne, получаемыми двумя последовательными селекциями с помощью моноклональных антител, определенных выше.

Мутанты по изобретению могут, кроме того, заключать в себе другие мутации, как например мутацию, придающую устойчивость к моноклональным специфичным антителам антигенного сайта II, что позволяет распознать возможный ревертант вирулентности штаммов SAD, используемых для оральной вакцинации лис.

Мутанты по изобретению могут быть размножены на клетках почки новорожденного хомяка BHK 21, в присутствии среды GEM (основная среда минимум-модификации Глазгоу, выпускаемая фирмой FLOW) и 2%-ной сыворотки теленка при 33 o C во влажной атмосфере с 5%-ным содержанием CO 2 .

Их охарактеризовывают обычными методами, например, определяя летальную дозу 50 /ЛД 50 / на мышах, иммунофлуоресценцией или обсчитывая лизированные пятна на агаре. Они могут храниться при -70 o C.

Анализ последовательности нуклеотидов гликопротеина этих мутантов показывает, что кодон аминокислоты в положении 333 отличается по крайней мере двумя нуклеотидами от всех кодонов, возможных для аргинина. Среди мутантов, которые отвечают этим условиям, предпочтительным особенно является мутант, имеющий в 333 глутаминовую кислоту, так как он хорошо размножается на клеточной культуре, менее патогенен для новорожденных мышей, и он обладает высокой защитной способностью.

Двойной мутант, несущий глутаминовую кислоту, кодон которой: GAA на месте аргинина в положении 333, полученный по вышеприведенному способу; исходя из штамма SAD Berne, называемый далее SAG2, представлен в Национальную Коллекцию Культур Микроорганизмов /C.N.C.M. — Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes/ Института Пастера — Франция 9 июля 1992 под N 1-1238. Этот мутант содержит другую мутацию, а именно устойчивость к моноклональному специфическому антителу антигенного сайта II, что является дополнительным маркером штамма.

Далее представлено детальное описание изобретения, на примере мутанта SAG2, что однако не ограничивает изобретение только этим мутантом.

A — Исследование генетической стабильности штамма при проведении пассажей на мозге мышат.

10 3 ЕОП SAG2 вводят 6 мышатам в возрасте 4 дней. Когда животные заболевают /6/, их умерщвляют. Готовят 6 отдельных измельченных образцов; каждый образец оттитровывают и 30 мкл разбавленного 1/10 образца вводят 3 взрослым мышам /патогенный контроль/ и мышонку /следующий пассаж/, 6 мышат позволяют сделать 6 независимых серий из 3 пассажей.

Титры мозговых веществ в ЕОП /мл даны в таблице.

Все инъектированные взрослые особи /54 мыши/ после 1-го, 2-го и 3-го пассажей остались живы и показали отсутствие реверсии.

B — Защитная способность SAG2.

Мутант SAD2 вводят интрацеребральным путем мышам и определяют защитную способность мутанта в опыте внутримышечного введения 100 ЛД 50 штамма CVS.

Полученные результаты представлены на фиг. 2, где графически показана защитная способность /%/ как функция количества введенного мутанта, выраженного в (ЕОП) UFP/мышь (log). Повторяют то же исследование с мутантом SK, имеющим в положении 333 лизин.

C — Патогенность SAG2 при интрацеребральном введении.

Вводят мутант SAG2 мышам в дозах от 10 -0,5 до 10 6 ЕОП/мышь и не отмечают смертности в течение периода времени 28 дней.

Параллельно, осуществляют тот же опыт с вирусом SAD Berne или мутантом SK.

Результаты представлены на фиг. 3, где дан график зависимости % смертности /ось ординат/ от количества введенного мутанта мышам /ось абсцисс/.

Установлено, что мутант SAG2 не вызывает никакой смертности, тогда как мутант SK имеет слабую остаточную патогенность.

D — Патогенность SAG2 при внутримышечном введении.

Повторяют испытание, приведенное выше, но при внутримышечном введении. Полученные результаты представлены на фиг. 4, где приведен % смертности /ось ординат/ в зависимости от введенной дозы в ЕОП/мышь /ось абсцисс/.

Видно, что SAG2 и мутант SK не вызывают никакой смертности.

Мутанты по изобретению могут применяться в виде живой вакцины при всех обычно используемых способах введения при вакцинации и особенно при внутримышечном или оральном способе введения. Мутанты предварительно разбавляют в инертном фармацевтически пригодном растворителе, таком как физиологическая сыворотка.

1. Авирулентная вакцина против бешенства, отличающаяся тем, что содержит авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, в котором гликопротеин содержит в положении 333 природную глутаминовую кислоту, кодон который отличается от кодонов аргинина, по крайней мере двумя нуклеотидами.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что мутантом является мутант штамма SAD Berene.

источник

1.1. Настоящие методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ, «Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании» и санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами. СП 1.2.731-99».

1.2. Требования настоящих методических указаний обязательны для органов и учреждений здравоохранения субъектов Российской Федерации.

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативные документы:

2.1. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.

2.2. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами. СП 1.2.731-99».

2.3. Санитарные правила «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности. СП 1.2.036-95».

2.4. Санитарные правила «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний. СП 3.1/3.2.558-96».

2.5. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), утв. Минздравом СССР от 6 апреля 1973 № 1045-73.

2.6. Строительные нормы и правила «Общественные здания и сооружения». СНиП 2.08.02-89 и «Пособие по проектированию учреждений здравоохранения» в 5 томах. — Т. 1, 3, 5. Госгражданстрой. — М., 1989.

2.7. ОСТ-42-21-2-85 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства. Режимы».

2.8. Приказ «Об утверждении временных перечней вредных, опасных веществ и производственных факторов, а также работ, при выполнении которых проводятся предварительные и периодические медицинские осмотры», утв. Минздравмедпромом и Госкомсанэпиднадзором России от 05.10.95 № 280/88.

2.9. «Инструкция по эксплуатации и контролю эффективности вентиляционных устройств на объектах здравоохранения», утв. Минздравом СССР от 20 марта 1975 г.

2.10. «Методические рекомендации по проектированию вирусологических лабораторий», утв. Минздравом СССР от 28 декабря 1990 № 15-6/51.

2.11. «Методические указания по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях» утв. Минздравмедпромом России от 28.02.95 № 11-16/03-06.

2.13. «Правила техники безопасности, производственной санитарии и санитарно-противоэпидемического режима для предприятий по производству бактерийных и вирусных препаратов», утв. Минздравом СССР от 30 августа 1979 г.

2.14. Методы лабораторных исследований по бешенству. ВОЗ. — Женева, 1975.

Авария — нештатная ситуация, при которой создается реальная или потенциальная возможность выделения патогенного агента в воздух производственной зоны, окружающую среду или заражение персонала.

Биологическая безопасность — система медико-биологических, организационных и инженерно-технических мероприятий и средств, направленных на защиту работающего персонала, населения и окружающей среды от воздействия патогенных биологических агентов.

Бокс биологической безопасности — конструкция, используемая для физической изоляции (удержания и контролируемого удаления из рабочей зоны) микроорганизмов с целью предотвращения возможности заражения персонала и контаминации воздуха рабочей зоны и окружающей среды.

Боксированное помещение (бокс) — изолированное помещение с тамбуром (предбоксником).

Лаборатория — структурное подразделение, выполняющее экспериментальные и /или/ производственные работы с патогенными биологическими агентами.

«Заразная» зона — помещение или группа помещений лаборатории, где осуществляются манипуляции с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства.

«Чистая» зона — помещение или группа помещений лаборатории, где не проводятся манипуляции с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства. Производственная работа — работа по производству медицинских иммунобиологических препаратов с использованием производственных штаммов фиксированного вируса бешенства.

Фиксированный вирус бешенства* — аттенуированный штамм вируса бешенства, полученный путем длительного пассирования через головной мозг кролика. Производственные штаммы фиксированного вируса бешенства хранятся в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и выдаются один раз в год учреждениям, имеющим право на работу с микроорганизмами III — IV группы патогенности.

СИЗ — средства индивидуальной защиты.

* Например, штаммы фиксированного вируса бешенства «Москва» и «CVS».

Работа с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства может проводиться в лабораториях, имеющих разрешение, выданное в установленном порядке Главным государственным санитарным врачом субъекта Российской Федерации сроком на 5 лет. Оно утрачивав силу при передислокации или перепланировке лаборатории, а также может быть аннулировано при нарушениях требований биологической безопасности.

Комитет экспертов ВОЗ (1972) рекомендовал следующие требования к производственным штаммам фиксированного вируса бешенства:

— тщательная регистрация истории пассажей;

— проведение в производстве не более 10 пассажей с момента последнего контроля его биологических свойств;

— минимальная патогенная активность для лабораторных животных при экстраневральном введении;

— антигенная специфичность и иммуногенная активность;

— изучение свойств производственного штамма фиксированного вируса бешенства после каждых 10 пассажей.

Фиксированный вирус бешенства должен иметь следующие основные признаки:

— короткий инкубационный период (4 — 5 дней);

— большую патогенность для кроликов при интрацеребральном заражении;

— значительное ослабление способности образовывать тельца Негри;

— вызывать паралитическую форму бешенства без явлений возбуждения;

— накопление в ЦНС мышей до 6,0 — 7,0 lg LD_50/0,03 мл;

— высокую тропность к ЦНС и низкую тропность к внутренним органам.

4.3.1. Лаборатории, работающие с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства должны располагаться в отдельно стоящем здании или изолированной части здания с отдельным входом.

4.3.2. Лаборатория должна быть обеспечена водопроводом, канализацией, электричеством, отоплением и вентиляцией. Все помещения лаборатории должны иметь естественное и искусственное освещение в зависимости от вида работ в соответствии с требованиями действующих нормативных документов.

4.3.3. Помещения лаборатории должны быть разделены на «заразную» и «чистую» зоны. Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность продвижения производственных штаммов фиксированного вируса бешенства и выполнение требований настоящей инструкции.

4.3.4. Лаборатория должна иметь набор рабочих комнат и других помещений, включая душевую комнату, в соответствии с производственной мощностью и номенклатурой выполняемых технологических операций.

4.3.5. Внутренняя отделка помещений должна быть выполнена в соответствии с функциональным назначением. Поверхность пола, стен, потолка в лабораторных помещениях «заразной» зоны должна быть гладкой, без щелей, легко обрабатываемой, устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств, полы не должны быть скользкими.

4.3.6. Окна и двери помещений «заразной» зоны лаборатории должны быть герметичными.

4.3.7. Имеющаяся вытяжная вентиляция из «заразной» зоны лаборатории должна быть изолирована от других вентиляционных систем и оборудована фильтрами тонкой очистки воздуха. При использовании боксов биологической безопасности II класса, снабженных системой вытяжной вентиляции с фильтрами тонкой очистки типа «Лайк», система вытяжной вентиляции может быть использована без установки фильтров.

4.3.8. Разрешается установка кондиционеров в рабочих комнатах и боксах. Во время работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства кондиционеры должны быть отключены.

4.3.9. Лабораторная мебель в «заразной» зоне должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь швов и трещин.

4.3.10. Ширина проходов к рабочим местам или между двумя рядами выступающего оборудования должна быть не менее 1,5 м (с учетом выступающих конструкций).

4.3.11. Помещения, где проводится работа с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, должны быть оборудованы бактерицидными лампами в соответствии с «Методическими указаниями по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях». Лампы включают после проведения влажной уборки. Вход в помещение разрешается только после проветривания не менее 30 мин (при применении безозоновых бактерицидных ламп проветривания не требуется). Необходимо вести учет времени работы каждой лампы с отметкой в журнале.

4.3.12. При ориентации окон на юг необходимо предусмотреть защиту рабочих столов от попадания прямого солнечного света путем использования светозащитных пленок, жалюзи из материала, устойчивого к дезинфектантам.

4.3.13. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых.

4.3.14. Лаборатория должна быть обеспечена средствами пожаротушения.

4.4.1. Работу с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства выполняют специалисты с высшим и средним специальным образованием, прошедшие специальную подготовку.

4.4.2. Персонал допускается к работе с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства после проведения инструктажа по соблюдению требований биологической безопасности. Последующие инструктажи проводят не реже 1 раза в год, с записями в соответствующих журналах.

4.4.3. Приборы, оборудование и средства измерений, используемые в работе лаборатории, должны быть аттестованы, технически исправны, подвергаться метрологическому контролю в установленные сроки, иметь технический паспорт. На каждый прибор (установку) должны быть разработаны правила (инструкция) по их эксплуатации с учетом требований биологической безопасности.

4.4.4. В лаборатории должны использоваться дезинфицирующие средства, допущенные к применению (3 %-ный хлорамин). Срок хранения готового раствора не должен превышать 15 суток.

4.4.5. В помещениях «заразной» зоны лаборатории проводятся:

— работа с животными (заражение, вскрытие);

— содержание инфицированных животных;

— дезинтеграция, гомогенизация мозговых тканей и другие операции с вероятным образованием аэрозоля;

— заражение культуры клеток;

— приготовление взвесей и суспензий:

— работа с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства;

4.4.6. Во время работы двери рабочих комнат должны быть закрыты. Перед работой включается вентиляция «на отток». Выход из рабочей комнаты во время проведения работы запрещается.

4.4.7. Заражение животных осуществляется не менее чем двумя сотрудниками.

4.4.8. При пилотировании необходимо пользоваться резиновыми грушами или автоматическими устройствами.

4.4.9. Перед использованием посуда, пипетки, оборудование, шприцы и т.д. должны быть проверены на целостность и исправность.

4.4.10. Ампулы с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства вскрывают стерильно над подносом или лотком с марлевой салфеткой, пропитанной дезинфицирующим раствором. Верхний конец ампулы нагревают над пламенем горелки, снимают парафин, затем кусочком стерильной ваты, смоченным в стерильной воде, осторожно прикасаются к оттянутому концу ампулы для образования трещины. Той же влажной ватой обводят вокруг носика ампулы. После образования круговой (или не полностью круговой) трещины конец ампулы накрывают марлевой салфеткой или ватой и обламывают пинцетом.

4.4.11. После вскрытия ампулы в нее добавляют 1,0 мл стерильной дистиллированной воды и осторожно встряхивают. Полученную суспензию, содержащую фиксированный вирус бешенства используют для заражения лабораторных животных.

4.4.12. Для внутримозгового заражения кролика его надежно фиксируют на специальном станке или дают легкий наркоз (2 — 2,5 мл раствора Рометара внутримышечно за 20 — 30 мин до заражения). Затем аккуратно выстригают шерсть в зоне предполагаемого введения, обрабатывают 70 %-ным раствором этанола и 5 %-ным раствором йода и с помощью стерильного шприца емкостью 2 мл и иглы размером № 20 (10×0,90) вводят 0,25 мл суспензии фиксированного вируса бешенства штамм. Прокол делают приблизительно на середине линии, условно соединяющей наружный угол глаза и ухо. При заражении крупных кроликов можно пользоваться шилом из нержавеющей стали или троакаром. Явные признаки паралича появляются у кроликов на 4 день после инокуляции; в редких случаях они развиваются до 7 дня. Извлечение мозга производят у животного только после развития полной картины паралича, характерного для фиксированного вируса бешенства. К числу первых симптомов экспериментального бешенства относятся: повышение температуры тела, пугливость и расширение зрачков. Затем появляются менингеальные явления, парезы, начинающиеся обычно с задних конечностей, быстро прогрессирующие параличи, захватывающие все конечности, шейную к затылочную мускулатуру.

4.4.13. Больных кроликов с картиной полного паралича, но с еще сохранившимся дыханием забивают путем тотального обескровливания. Головной мозг используется для изготовления рабического антигена. После декапитации производят снятие шкурки, отделяют позвоночник вместе со спинным мозгом, которые подвергают автоклавированию (2,0 кГс/см 2 (0,2 МПа), 132 ± 2 °С), как заразный материал.

4.4.14. Для извлечения головного мозга животное укладывают на секционный лоток животом вниз так, чтобы голова оказалась на краю стола. С помощью пинцета, скальпеля и ножниц отделяют голову от туловища. Затем скальпируют кожу головы, удаляя уши и верхние веки. Обнаженную поверхность черепа смачивают 70 %-ным спиртом и помещают в кристаллизатор. Кристаллизатор переносят в стерильный бокс для приготовления антигена. Перед вскрытием черепа его двухкратно обрабатывают 70 %-ным этиловым спиртом. Затем череп кролика закрепляют в специальное приспособление (прилож. 1), обеспечивающее надежную фиксацию головы животного. Удерживая секционный нож в левой руке, правой рукой с помощью молотка вскрывают черепную коробку четырьмя прямоугольными разрезами. Сначала следует сделать разрез по линии соединяющей середины глаз, затем разрез в теменной области, а затем соединить эти два разреза перпендикулярными разрубами. Затем, отложив в сторону секционный нож и молоток, с помощью пинцета и ножниц высвобождают твердую мозговую оболочку и переднюю часть мозга отделяют на уровне обонятельной доли; пересекают продолговатый мозг позади мозжечка, приподнимают мозг, пересекают перекрест зрительных нервов и затем переносят его на стерильную чашку Петри для взвешивания.

4.4.15. Для приготовления антигена головной мозг после взвешивания помещают в стерильную ступку или гомогенизатор и измельчают. К измельченному мозгу добавляют дистиллированную воду, содержащую 0,5 % фенола до получения 10 %-ной мозговой суспензии. Суспензию мозга фильтруют через тройной слой марли. Стерильность мозговой суспензии проверяют посевом на сахарный бульон, мясопептонный агар и мясопептонный бульон с 0,1 % агара и кусочками мяса. Посевы выдерживаются при 37 °С в течении 5 сут. Разрешается для иммунизации лошадей-продуцентов использовать стерильный антиген, сохранившийся при температуре 4 °С не более 14 сут.

4.4.16. Для приготовления исходных культур фиксированного вируса бешенства головной мозг кролика помещают в стерильную ступку или гомогенизатор и измельчают. К измельченному мозгу добавляют дистиллированную воду до получения 10 % мозговой суспензии. Стерильность мозговой суспензии проверяют посевом на сахарный бульон, мясопептонный агар и мясопептонный бульон с 0,1 % агара и кусочками мяса. Мозговую взвесь разливают стерильно по аликвотам объемом 4 — 5 мл и замораживают при температуре не выше минус 18 °С. Оптимальной температурой для хранения штаммов фиксированного вируса бешенства является минус 70 °С. Для заражения достают одну аликвоту из морозильника и помещают в холодильник на 4 °С на 18 — 20 ч. После оттаивания осторожно пастеровской пипеткой отбирают среднюю фазу мозговой суспензии, содержащую максимальное количество вируса.

4.4.17. Для проведения реакции нейтрализации и определения LD₅₀ штаммов фиксированного вируса бешенства используют беспородных белых мышей или мышей любой инбредной линии в возрасте 6 — 8 недель и весом 11,0 ± 1,0 г. Пол мышей принципиального значения не имеет. Животные должны быть в хорошем состоянии. Непосредственно перед заражением необходимо тщательно осмотреть всех животных. При обнаружении эктопаразитов, взъерошенной шерсти или признаков диареи животные не используются. Мышь укладывают головой на деревянную подставку толщиной 1 см и надежно, но не сильно, чтобы не вызвать асфиксию, фиксируют пальцами. Экспериментатор берет в левую руку тампон, смоченный 70 %-ным этиловым спиртом, и тщательно обрабатывает место предполагаемого введения. Затем, взяв в правую руку шприц, придает ему строго вертикальное положение и быстрым движением прокалывает иглой череп животного в точке, находящейся в вершине воображаемого угла, стороны которого ведут к правому глазу и правому уху животного. Игла легко проникает через кость и погружается далее на 0,1 — 0,2 см в ткань мозга. При этой манипуляции следует применять иглы № 0416 длиной не более 1,5 см. Продвинув поршень до конца, осторожно извлекают иглу. Объем вводимого материала не более 0,03 мл. Зараженную мышь следует тотчас поместить в предварительно заготовленную банку с этикеткой, на которой указывают название вируса, заражающую дозу и другие необходимые отметки. Если заражают большую группу животных, по окончании эксперимента необходимо точно проконтролировать число живых мышей в каждой группе. При обнаружении погибших животных надо провести дополнительную инокуляцию, добавив в группу недостающее число мышей. После того как инокуляция всех мышей закончена, шприцы с иглами осторожно разбирают и погружают в воду, находящуюся в стерилизаторе. Инструменты стерилизуют кипячением в течение 30 мин. Инкубационный период штаммов фиксированного вируса бешенства равняется 5 — 6 дням, поэтому экспериментальных животных, павших ранее 5 дня в эксперименте не учитывают. Животных осматривают ежедневно, начиная со следующего дня после заражения. Число нормальных, больных и погибших животных регистрируют на специальной карте, которая служит постоянным протоколом опыта. Период наблюдения составляет 14 сут.

4.4.18. Правила вскрытия мышей. Мышей забивают в состоянии выраженных терминальных симптомов бешенства хлороформом. Труп мыши фиксируют на дощечке спиной кверху. Для этого необходимо две булавки — одной прикалывают основание хвоста, другой — кончик морды. Можно пользоваться и тремя булавками, чтобы фиксировать передние лапы и хвост. После обработки спиртом кожу головы и шеи отпрепаровывают с помощью ножниц и пинцета, открывая череп. Череп зажимают в глазницах хирургическим пинцетом, изогнутыми ножницами отделяют крышку черепа, обнажая мозг. С помощью тех же изогнутых ножниц извлекают мозг и переносят в стерильную чашку Петри, которую заранее взвешивают. Производят взвешивание чашки Петри с мозговой тканью. Затем мозг переносят в стерильную ступку, где с помощью стерильного пестика приготавливают 10 %-ную мозговую взвесь с добавлением дистиллированной воды. Взвесь разливают по аликвотам и хранят при температуре не ниже минус 18 °С. Оптимальной температурой для хранения штаммов фиксированного вируса бешенства является минус 70 °C.

4.4.19. По окончании работы все объекты с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства должны быть убраны в хранилища (холодильники, термостаты, шкафы и т.д.); в обязательном порядке проводится дезинфекция рабочих поверхностей столов 3 %-ным раствором хлорамина.

4.4.20. Использованные пипетки полностью (вертикально) погружаются в дезинфицирующий раствор (3 %-ный хлорамин), избегая образования в каналах пузырьков воздуха. Длительность дезинфекции 60 мин.

4.4.21. Использованная посуда, твердые отходы из «заразной» зоны лаборатории должны собираться в закрывающиеся емкости и передаваться в автоклавную или дезинфицироваться на месте. Слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть запрещается.

4.4.22. Перенос производственных штаммов фиксированного вируса бешенства и использованной посуды для обеззараживания должен осуществляться в закрытых емкостях, исключающих инфицирование персонала во время транспортирования. После завершения работы помещение «заразной» зоны лаборатории запирается и опечатывается. Опечатывание и снятие печатей производят сотрудники лаборатории, имеющие разрешение руководителя лаборатории (подразделения).

4.4.23. Иммунизацию лошадей-продуцентов осуществляют согласно регламента производства «Иммуноглобулина антирабического жидкого из сыворотки крови лошади».

4.4.24. Правила введения антигена. Введение антигена лошади производится в специально оборудованном помещении (операционной). Сотрудники, осуществляющие инъекцию антигена, одеты в противочумный костюм 3-типа с резиновыми перчатками. Для введения антигена используют прибор для массовых прививок ПМП-1, который соединяется посредством силиконового шланга с иглой и флаконом с антигеном. Вся инъекционная система соединяется герметично. Место введения антигена предварительно обрабатывают 70 %-ным раствором спирта. Иглу вводят подкожно и под небольшим давлением медленно вводят антиген. После инъекции вентилем перекрывают подачу антигена, кожу на месте введения иглы зажимают кровоостанавливающим пинцетом на 1 мин. Пинцет снимают, место инъекции обрабатывают тампоном, смоченным 70 %-ным раствором спирта, и накладывают тампон с коллодием или фурапластом с перхлорвинилом. После использования вся инъекционная система подвергается кипячению в течение 30 мин в 2 %-ном содовом растворе. В процессе гипериммунизации постоянно следят за общим состоянием и температурной реакцией продуцентов. В случае повышения температуры очередную инъекцию антигена производят после ее снижения до нормы.

4.4.25. Хранение производственных штаммов фиксированного вируса бешенства осуществляется в помещениях заразной зоны. Хранение, учет, передача, транспортирование и уничтожение производственных штаммов фиксированного вируса бешенства проводятся в соответствии с требованиями СП 1.2.036-95.

4.4.26. Прием посетителей разрешается только в специально отведенных местах в «чистой» зоне лаборатории.

4.4.27. Вынос из лаборатории оборудования, лабораторной или хозяйственной посуды, инструментов и др. производится только после их дезинфекции и с разрешения ее руководителя.

4.4.28. В «заразной» зоне лаборатории запрещается:

— оставлять после окончания работы на рабочих местах посуду с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства «Москва» и «CVS»;

— пипетировать ртом, переливать жидкий инфекционный материал через край сосуда (пробирки, колбы, флакона);

— хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, зонты, хозяйственные сумки, косметику и т.п., а также продукты питания;

— оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любого вида работ с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства;

— сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый материал и т.д.) в канализацию без предварительного обеззараживания.

4.4.29. Допускается в одном и том же помещении проведение экспериментальных и производственных работ с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства. Экспериментальная и производственная работа должны быть разнесены по времени. Экспериментальный материал должен храниться отдельно от производственного в специально отведенном для него холодильнике или термостате.

4.4.30. Все сотрудники, работающие с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, должны находиться на диспансерном наблюдении. Периодические медицинские осмотры проводятся в соответствии с действующими приказами (№ 280/88 — Минздравмедпром и Госкомсанэпиднадзор России).

4.5.1. Сотрудники лаборатории должны быть обеспечены медицинскими халатами, пижамами (комбинезонами), шапочками, сменной обувью и другими средствами индивидуальной защиты в зависимости от характера выполняемых работ и в соответствии с действующими нормами.

4.5.2. Рабочая одежда и обувь должны быть индивидуальными, соответствовать размерам работающих и храниться отдельно от личной одежды.

4.5.3. При проведении исследований в боксированных помещениях производится смена медицинского халата на противочумный или хирургический, доходящий до нижней трети голени. Дополнительно используются резиновые перчатки, тапочки и, при необходимости, респираторы (маски). Операции, требующие вскрытия черепа и позвоночника необходимо проводить в резиновых перчатках, защитных очках и в противочумных халатах. Необходимо также надевать резиновые или прочные полиэтиленовые фартуки, которые легко дезинфицировать или уничтожить.

4.5.4. Смена рабочей одежды должна проводиться по мере загрязнения, но не реже 1 раза в неделю.

4.5.5. Перед сдачей в стирку защитная одежда должна быть обеззаражена замачиванием в растворе 1 %-ного хлорамина.

4.6.1. Дезинфекцию различных объектов при работе с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства проводят в соответствии с характером объекта, подлежащему обеззараживанию.

источник

Бешенство — остропротекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. Оно относится к числу наиболее опасных заболеваний человека и животных, которое регистрируется на пяти континентах. Вирус передается главным образом со слюной при укусах.

После размножения в экстраневральных тканях он вскоре достигает спинальных ганглиев и головного мозга, где реплицируется только в определенных группах нейронов. Заболевание, как правило, завершается летальным исходом.

Основную роль в иммунитете у вакцинированных против бешенства играют ВНА, направленные против G белка, который вызывает выраженный В клеточный ответ. Нейтрализующие IgG появляются на 6-8 дни после вакцинации. ВНА достигают титра 1:16— 1:32 на 9-12 дни, а максимального уровня через 3 недели и сохраняются более 6 месяцев. После переболевания у лошадей, КРС и свиней антитела могут сохраняться более 7 лет. Т-клеточный иммунный ответ сохраняется в течение длительного периода.

Несмотря на высокую антигенность белков вируса бешенства, его размножение в инкубационный период заболевания, т.е. в период продвижения вируса от места внедрения до центральной нервной системы, практически остается безответным со стороны иммунной системы организма. Вероятно, в этот период очень мало вирусного антигена достигает иммунной системы, так как основная масса его задерживается в мышечных клетках или в нервных аксонах. Однако ранние стадии инфекции чувствительны к антителам, поэтому эффективна классическая пастеровская вакцинация, особенно в сочетании с применением гипериммунного глобулина. Иммунологическое вмешательство является эффективным в течение первого этапа длительного инкубационного периода между началом репликации вируса в мышечных клетках и проникновением вируса в защищаемое окружение нервной системы.

Блестящим примером применения живой антирабической вакцины для человека явилась вакцина Ферми. Эту вакцину готовили из суспензии мозга овец или коз, инфицированных фиксированным штаммом вируса бешенства. Вирус частично инактивировали добавлением небольшого количества фенола. В дальнейшем для размножения фиксированного штамма вируса использовали мозг зараженных кроликов, новорожденных мышей, а также утиные эмбрионы и культуры клеток (первичные культуры клеток почек новорожденных хомяков, собак, поросят, телят, фибробласты эмбрионов кур; диплоидные клетки обезьян; линию клеток Vero). С использованием различных систем для пассирования и размножения получены разные варианты фиксированного штамма вируса бешенства (CVS, ERA, SAD, PM, HEP, LEP, Kelev, Kissling, Внуково 32). По данным ВОЗ (1992 г.), культуральные вакцины для иммунизации людей являются безопасными и более иммуногенными, чем вакцины из нервной ткани. С целью исключения возможных осложнений по причине использования живого вируса в вакцине для человека, вакцинный вирус стали полностью инактивировать фенолом, формалином или (3- пропиолактоном. В дальнейшем аналогичная рекомендация сделана в отношении вакцин против бешенства животных.

Вакцины, применяемые для профилактики бешенства животных (преимущественно собак и кошек), принципиально не отличаются от вакцин, применяемых людям. Отличие заключается в том, что в ряде стран по экономическим соображениям для иммунизации животных используют живые вакцины из безопасных аттенуированных штаммов вируса бешенства. Для иммунизации собак и кошек в основном применяют инактивированные комбинированные вакцины против нескольких заболеваний.

Современные инактивированные культуральные вакцины и иммуноглобулин против бешенства являются основой борьбы с бешенством людей. Специфическая профилактика бешенства у животных основана на применении безопасных и эффективных живых и инактивированных вакцин. Хотя антирабические вакцины начали применять еще в 1885 г., однако до сих пор остается нерешенным ряд проблем, касающихся профилактики бешенства и борьбы с ним среди животных. Вакцинация векторных домашних и диких животных направлена в первую очередь на охрану здоровья человека. Антирабические вакцины особенно нужны в районах, где бешенство является эндемическим заболеванием диких и домашних плотоядных. Основным резервуаром вируса бешенства в природе являются собаки, лисицы, еноты, скунсы и летучие мыши.

В мире ежегодно более 4 млн людей подвергаются вакцинопрофилактике и около 50000 погибают преимущественно от покусов инфицированными собаками. Специфическая профилактика бешенства людей в основном приходится на Африку, Азию и Южную Америку.

В европейских странах, где преобладает лесной цикл передачи этой болезни, с 1981 г. зарегистрированы единичные случаи смерти среди людей. В странах Южной Америки для иммунизации собак широко применяли вакцину из фиксированного штамма вируса, размноженного в культуре клеток мозга мышей-сосунов. Там ежегодно производили до 20 млн доз такой вакцины. Систематическое ее применение на протяжении 10 лет в ряде стран привело к резкому снижению случаев бешенства среди собак. По данным ВОЗ, при массовой вакцинации в 1992 г. было привито 36 млн собак (в основном в Америке). Количество собак, подлежащих вакцинации против бешенства в мире, может достичь 500 млн.

источник

Вирус Бешенства. Уличный и фиксированный вирусы бешенства. Патогенность, диагностика, антирабические прививки

Возбудитель болезни — РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Lissavirus семейства Rabdoviridae. Как и другие рабдовирусы, он имеет пулевидную форму. Длина вирионов — 180 нм, диаметр — 75 — 80 нм. Вирус удается культивировать в развивающихся куриных и утиных эмбрионах, в культурах некоторых клеток. Штаммы возбудителя бешенства, циркулирующие в природе (уличный вирус), патогенны для всех теплокровных животных. В наиболее высоких титрах вирус накапливается в центральной нервной системе зараженных животных, особенно в аммониевых рогах и коре больших полушарий головного мозга, в мозжечке и продолговатом мозге. Высокий титр возбудителя бешенства и в слюнных и слезных железах. Различают «дикий» (уличный) и «фиксированный» вирусы бешенства. Уличный вирус бешенства циркулирует в естественных условиях и характеризуется высокой патогенностью для людей и животных, образует в мозговых клетках специфические тельца Бабеша — Негри. «Фиксированный» вирус был получен Л. Пастером путем многоразового интрацеребрального пассажа вируса уличного бешенства через организм кролей, вследствие чего вирус потерял свою вирулентность для человека и животных, а также способность образовывать в мозге тельца Бабеша — Негри. Фиксированный вирус используется как исходный материал для изготовления антирабических вакцин. Все 7 серотипов полевых штаммов вируса бешенства, которые были изолированы от людей, животных и грызунов в Центральной Европе, от летающих мышей в Нигерии, от африканских землероек, а также от комаров и москитов в Нигерии и Судане, от коней в Нигерии, имеют широкую антигенную вариабельность и родственные связи в иммунобиологическом отношении, а прививка животных антирабической вакциной из пастеровского штамма создает иммунитет против вируса бешенства, выделенного в разных частях мира.

Реакции преципитации (РП) предложены Краусом (1897) и основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии Аг с AT. РП ставят в специальных узких пробирках. В качестве реагентов используют гипериммунные преципитирующие сыворотки с высокими титрами AT к гомологичным Аг. При постановке РП разводят не сыворотку, а Аг. Реакционная среда должна содержать электролиты (физиологический раствор) и иметь нейтральный рН. РП позволяет быстро (в течение нескольких секунд) выявлять незначительные количества Аг. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси Аг. Метод имеет несколько разновидностей (рис. 10-16). Реакция кольцепреципитации: На слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую растворимый Аг, и через несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата. Цели: индикация, идентефикация, титрование антиген или антитела. Сущность: АГ и АТ движутся на встречу друг к другу и при специфичности в месте соединяются в комплекс АГ+АТ в виде светлой полосы.

Сем. Тогавирусов (вирусная диарея крупного рогатого скота)

(Togaviridae), семейство вирусов, состоящее из родов Alphavirus, Flavivirus, Rubivirus и Pestivirus. Вирусы содержат однонитчатую РНК с мол. м. 3—4 X 106 дальтон, линейной формы, к-рая является инфекционной. Вирионы диам. 50—70 нм (альфавирусы), 40—50 нм (флявивирусы), 70 нм (рубивирусы), 40 нм (пестивирусы). Для капсида альфавирусов свойствен икосаэдральный тип симметрии. Сборка вирионов происходит в цитоплазме клеток на мембранных структурах. У флявивирусов в составе вириона имеются 3 структурных белка, у альфавирусов 2—3. При репликации в клетках вирусы обоих родов индуцируют образование РНК-зависимой РНК-полимеразы. Вирусы чувствительны к действию жирорастворителей. Этиология. Возбудитель болезни — сферич. РНК-содержащий вирус рода Pestivirus сем. Togaviridae. Величина вирусных частиц 30—40 нм. Вирус может годами сохраняться при t ниже 20°С, в культуральной жидкости не теряет биол. активность до 1 года, в крови, лимфатич. узлах, селезёнке и др. патол. материале — до 6 мес. При t 25 °С в течение 1 сут вирус практически не снижает биол. активности, при t 37 °С погибает через 5 сут. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину и дезоксихолату натрия. Эпизоотология. В естеств. условиях В. д. к. р. с. болеют кр. рог. скот, буйволы, олени и косули. Наиболее восприимчивы животные в возрасте от 6 мес до 2 лет. Источник возбудителя инфекции — больные животные.

48.Сплит-вакцины, методы получения.

Сплит-вакцины или расщеплённые (Ваксигрип, Бегривак, Флюарикс) содержат разрушенные инактивированные вирионы вируса гриппа — в её состав входят все вирионные белки вируса, не только поверхностные, но и внутренние антигены. За счёт высокой очистки в ней отсутствуют вирусные липиды и белки куриного эмбриона. Сплит-вакцины или расщеплённые (Ваксигрип, Бегривак, Флюарикс) содержат разрушенные инактивированные вирионы вируса гриппа — в её состав входят все вирионные белки вируса, не только поверхностные, но и внутренние антигены. За счёт высокой очистки в ней отсутствуют вирусные липиды и белки куриного эмбриона. Преимущество сплит-вакцин в том, что они содержат как наружные, так и внутренние антигены вируса гриппа, при этом они избавлены от самого главного недостатка цельновирионных вакцин – наличия токсинов. Сплит-вакцины можно применять с 6-месячного возраста, они рекомендованы для предотвращения гриппа у беременных женщин. Наличие открытых для иммунной системы внутренних антигенов вируса гриппа (нуклеокапсида и матриксного белка) делает сплит-вакцины уникальными. Они защищают не только от ежегодных мутаций вируса гриппа, но частично и от всех возможных разновидностей вируса, поскольку внутренние антигены подвержены лишь незначительным мутациям. По сути дела, сплит-вакцины представляют собой «золотую середину» в профилактике гриппа, поскольку по уровню побочных реакций аналогичны субъединичным вакцинам, а по иммунологической эффективности – цельновирионным. Профилактическая эффективность вакцин этого класса колеблется в интервале от 75 до 96%. Классическим примером препаратов этого класса является французская вакцина Ваксигрип, компании Санофи Пастер (подразделения СанофиАвентис), которая присутствует на рынке Европы уже более 60 лет. Вслед за этой вакциной, другие производители также наладили выпуск сплит-вакцин. В России на сегодняшний день, сплит-вакцины не выпускаются отечественными производителями, а лишь переупаковываются из импортируемого сырья (Бегривак). В 2009 году китайский производитель зарегистрировал свою вакцину Флюваксин.

Дата добавления: 2018-02-28 ; просмотров: 647 ; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ

источник

Сохранность инфекционной активности промышленных штаммов вируса бешенства, хранившихся при различных температурах

Исследовали на модели культур клеток зависимость специфической инфекционной активности вируса бешенства промышленных (фиксированных) штаммов L. Pasteur и CVS от длительности и температуры хранения. Вирусную суспензию накапливали в клеточной культуре / С13 и замораживали при -20 и -80°С. Анализ специфической активности проводили через 1 неделю, 1, 2, 3, 6 и 12 месяцев хранения. Экспериментально установили, что для исследованных штаммов более эффективной для длительного хранения является температура -80°С.

Ключевые слова: вирус бешенства, вируссодержащая суспензия, антирабический иммуноглобулин, антирабическая вакцина, долгосрочное хранение, низкие температуры

The dependence of specific infectious activity on the cell culture model of rabies virus industrial (fixed) strains L. Pasteur and CVS from the duration and storage temperature was investigated. Viral suspension was produced by cell culture / C13 and frozen at -20 and -80°C. Analysis of the specific activity was performed after 1 week, 1, 2, 3, 6 and 12 months of storage. It was experimentally discovered that the temperature -80°C is more effective for storage for the studied strains.

Keywords: rabies virus, virus-containing suspension, rabies immunoglobulin, rabies vaccine, long-term storage, low temperature

Бешенство является опасным нейроинфекционным заболеванием теплокровных животных (в том числе и человека), которое встречается более чем в 150 странах мира [7, 10]. Возбудителем данного заболевания является РНК-содержащий вирус рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae, порядка Mononegavirales. Заражение бешенством главным образом происходит через укус, в ходе которого инфекция передаётся со слюной. Основной мишенью вируса бешенства является центральная нервная система (ЦНС). Вирус бешенства является единственным из царства Virae, который поражает всех теплокровных животных с летальностью 100 %. От укусов животных, больных бешенством, ежегодно в мире погибает более 55 000 человек. В связи с этим согласно оценке Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) бешенство входит в пятёрку болезней, которые наносят наибольший ущерб человечеству и мировой экономике. Единственным методом борьбы с данным заболеванием являются пред- и постэкспозиционная профилактика, в рамках которой используются антирабические иммуноглобулин (АИГ) и вакцина (в дальнейшем — антирабические препараты) [1, 7, 10, 11].

Для получения антирабических препаратов и контроля их качества используются аттенуированные (или фиксированные) штаммы вируса бешенства, которые получают в ходе воздействия на полевые изоляты мутагенов или других факторов, позволяющих менять свойства вирионов. В отличие от полевых изолятов штаммы фиксированного вируса бешенства могут быть полностью или частично лишены способности к заражению целого организма животного или человека, но сохраняют возможность заражать ткани и клетки при непосредственном контакте. Наиболее распространёнными в производстве антирабических препаратов являются фиксированные штаммы вируса бешенства L. Pasteur и CVS, выделенные более 100 лет назад из полевых изолятов, ослабленные путём пассирования через мозг кроликов и адаптированные к мозгу мышей и клеточным линиям. С 1996 года ВОЗ рекомендует при производстве антирабических препаратов полностью отказаться от использования вируса бешенства, полученного пассированием через мозговую ткань животных, и использовать для накопления вирусной суспензии клеточные культуры [8, 11].

ПАО «Фармстандарт-Биолек» (Харьков, Украина) занимается разработкой антигена вируса бешенства для дальнейшего получения АИГ и антирабических вакцин для человека и животных с использованием постоянных клеточных линий и фиксированных штаммов L. Pasteur и CVS. Технологическая схема производства антирабических препаратов требует долгосрочного хранения промышленных штаммов вируса бешенства в виде суспензии. Большинство исследователей рекомендуют хранить вирусную суспензию при различных низких температурах (-20, -60, -70, -80 ° С) или в лиофилизированном состоянии [4, 9, 11, 12]. Но метод лиофилизации не подходит для производства, так как требует дополнительного пассирования и позволяет хранить только небольшие объёмы, которых недостаточно для производственных целей. В связи с этим в условиях производства необходимо хранить вирусную суспензию при низких температурах. Однако данные по эффективности низкотемпературного хранения аттенуированных штаммов вируса бешенства в суспензии противоречивы, что ставит под угрозу качество антирабических препаратов, полученных с использованием суспензии вируса бешенства, хранившейся при низких температурах.

Цель исследования — экспериментально определить эффективный температурный режим для долгосрочного хранения суспензии вируса бешенства штаммов L. Pasteur и CVS в условиях производства.

В качестве субстрата для накопления суспензии вируса бешенства использовали перевиваемую клеточную линию ВНК-21 / C13 (ATCC CCL-10), которая широко применяется для производства культуральной вакцины против бешенства [5, 6, 8, 12]. Клеточную линию накапливали в пристеночном монослое 1 сутки в стерильных пластиковых флаконах (SPL, Германия). В ходе исследования использовали фиксированные штаммы вируса бешенства L. Pasteur (адаптированный к клеточной линии Vero, № 2061 / Vero, 15 пассаж) и CVS (challenge virus standard), рекомендованные ВОЗ для производства АИГ и антирабических вакцин для животных и человека [8, 12]. Штамм L. Pasteur был адаптирован к клеточной линии ВНК-21 / C13 [6] и предоставлен Институтом Пастера (Нови-Сад, Сербия) вместе с технологическим регламентом производства антирабического антигена.

Вирусную суспензию культивировали в течении 4-х суток с момента заражения в поддерживающей среде DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) c 0, 2 % бычьего альбумина (PAA, Австрия) в СО₂-инкубаторе (Binder, Германия) при 33ºС и 5 % СО₂. Сбор вирусной суспензии проводили на 4 сутки после заражения. Полученную вирусную суспензию центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут в рефрижераторной центрифуге (MPW, Польша) при 4ºС для удаления клеточного детрита. Супернатант собирали, добавляли к нему сахарозу с конечной концентрацией 5 %, расфасовывали в пластиковые криопробирки (PAA, Австрия) и замораживали при -20 и -80ºС в морозильных камерах (National Lab, Германия). Контроль температуры, при которой хранили криопробирки, производили с помощью спиртовых термометров [5, 6, 8, 12].

Для определения специфической инфекционной активности вирусной суспензии использовали метод титрации вируса в культуре клеток линии ВНК-21 / C13. Суспензию вируса бешенства размораживали через 1 неделю, 1 , 2, 3, 6 и 12 месяцев хрнения при низких температурах (срок наблюдения) и титровали с коэффициентом разведения 5 на культуре клеток ВНК-21 / C13 в 96-луночных планшетах (SPL, Германия) в 5-ти повторах (n = 5). Культивировали клетки 48 часов в СО₂-инкубаторе при 37ºС и 5 % СО₂, затем фиксировали монослой клеточной лини охлаждённым при -20ºС ацетоном. Так как промышленные штаммы вируса бешенства не оказывают на клеточные линии цитопатогенного действия, то для определения инфекционной активности вирусной суспензии использовали метод непрямой флуоресценции. Для этого применяли специфические моноклональные антитела к вирусу бешенства, меченные изотиоцинатом флуоресцина (FITC) (Fujirebio, U.S.A.), которыми производили окрашивание клеточного монослоя. Учёт результатов производили с помощью медицинского микроскопа (МИКМЕД-6, ЛОМО, Россия) (увеличение 100×) с люминисцентной насадкой. При микроскопировании учитывали яркое специфическое свечение зелёного цвета, которое свидетельствует о наличии вируса бешенства в клетках, и лунки с таким свечением отмечали как положительные (рисунок 1) [4, 5, 9, 12].

Рисунок 1 — Клетки лини ВНК-21 / С13, инфицированные вирусом бешенства штамма L. Pasteur. Окраска FITC-меченными моноклональными антителами, увеличение 100×

Расчёт титра вируса проводили с помощью формулы Спирмена-Карбера и выражали в десятичном логарифме 50 %-ой фокусформирующей инфицирующей дозы (lg FFD₅₀):

, где

x — lg наибольшего разведения, в котором во всех лунках отмечается положительное свечение;

n_i — общее количество лунок, приходящихся на каждое разведение титрации вирусной суспензии;

r_i — количество положительных лунок в каждом разведении титрации вирусной суспензии [3, 9, 12].

Статистический анализ данных осуществляли с помощью стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel-2010 и Past. Вид распределения определяли с помощью W-критерия Шапиро-Уилка, достоверность различий между группами данных рассчитывали с использованием параметрического t-критерия Стьюдента (для групп с нормальным распределением данных). Расхождение считали статистически значимым при p ≤ 0, 05.

В ходе проведенных исследований была проанализирована сохранность специфической инфекционной активности суспензии вируса бешенства штаммов L. Pasteur и CVS после хранения при температурах -20 и -80°С через 1 неделю, 1, 2, 3, 6 и 12 месяцев (срок наблюдения). В качестве контроля использовали данные по хранению вируса на протяжении 1-ой недели.

При анализе данных по хранению вирусной суспензии промышленного штамма L. Pasteur при -20ºС были получены следующие результаты. Активность вирусной суспензии через 1 неделю после замораживания при температуре -20°С составила 8,11±0,29 lg FFD₅₀ (n = 5) (рисунок 2). При сравнении данных по специфической активности вируса после 1-ого месяца хранения различия не были статистически значимыми (р ≥ 0, 05). После 2-х месяцев хранения при этой температуре активность вируса данного штамма начала снижаться (р ≤ 0, 05 ). Аналогичные данные были получены при сравнении активности вирусной суспензии после хранения на протяжении 3-х, 6-ти и 12-ти месяцев при температуре -20°С. Различия между данными по специфической активности после указанных сроков хранения были статистически значимы (р ≤ 0, 05). Через 12 месяцев хранения при температуре -20°С активность вируса штамма L. Pasteur составила 4, 75 ± 0, 19 lg FFD₅₀, что на 3, 36 lg FFD₅₀ меньше, чем данные контроля.

Рисунок 2 — Динамика изменения инфекционной активности вируса бешенства штамма L. Pasteur в ходе хранения при температурах -20°С и -80°С, * — статистически значимые различия между контролем и последующими сроками хранения; # — статистически значимые различия между каждым из сроков; $ — статистически значимые различия между показателями активности одного срока хранения, но при разных температурах

Специфическая инфекционная активность вирусной суспензии штамма L. Pasteur через 1 неделю после замораживания при температуре -80°С составила 8, 18 ± 0, 19 lg FFD₅₀ (n = 5) и не изменялась в течение 2-х месяцев (р ≥ 0, 05). Между 2-м и 3-м месяцами хранения при температуре -80°С инфекционная активность вируса начала достоверно снижаться (р ≤ 0, 05 ), как и на протяжении последующего хранения. Через 12 месяцев хранения при температуре -80°С активность вируса штамма L. Pasteur составила 5, 66 ± 0, 29 lg FFD₅₀, что на 2, 52 lg FFD₅₀ меньше, чем данные контроля. Со 2-ого по 12-й месяцы хранения при -80°С показатели инфекционной активности были достоверно выше (р ≤ 0, 05 ), по сравнению с образцами, хранившимися при -20°С.

Активность вирусной суспензии промышленного штамма CVS через 1 неделю после хранения при температуре -20°С составила 6, 78 ± 0, 19 lg FFD₅₀ (n = 5) (рисунок 3) и не изменялась до 2-х месяцев хранения (р ≥ 0, 05). Между 2-м и 3-м месяцами хранения при данной температуре произошло достоверное снижение (р ≤ 0, 05 ), активности, как и на протяжении последующего хранения. Через 12 месяцев хранения при температуре -20°С активность штамма CVS составила 4, 96 ± 0, 29 lg FFD₅₀, что на 1, 82 lg FFD₅₀ меньше, чем специфическая активность вируса при хранении в данном температурном режиме в течение недели.

Рисунок 3 — Динамика изменения инфекционной активности вируса бешенства штамма CVS в ходе хранения при температурах -20°С и -80°С, * — статистически значимые различия между контролем и последующими сроками хранения; # — статистически значимые различия между каждым из сроков; $ — статистически значимые различия между показателями активности одного срока хранения, но при разных температурах

Активность вирусной суспензии штамма CVS через 1 неделю после замораживания при температуре -80°С составила 6, 78 ± 0, 47 lg FFD₅₀ (n = 5) и не изменялась в течение 6-ти месяцев (р ≥ 0, 05). Достоверное снижение (р ≤ 0, 05) показателя активности вируса произошло между 6-м и 12-м месяцами хранения при данной температуре. После 12 месяцев хранения при температуре -80°С активность вирусной суспензии снизилась на 0,28 lg FFD₅₀ и составила 6, 5 ± 0, 19 lg FFD₅₀ по сравнению с данными контроля. С 3-ого по 12-й месяцы хранения при -80°С показатели инфекционной активности данного штамма были достоверно выше (р ≤ 0, 05 ), по сравнению с образцами, хранившимися при -20°С.

В результате проведенных исследований более низкие результаты сохранности обоих штаммов вируса были получены при хранении вирусной суспензии при температуре -20°С. Это может быть связано с тем, что эвтектическая температура солевых растворов, входящих в состав среды консервирования и ультраструктурных компонентов вирионов находится ниже -20°С, и вирионы подвергаются действию повреждающих факторов, связанных с кристаллизацией жидкой фазы, изменением рН и гиперконцентрацией электролитов [2].

Результаты исследования показали, что фиксированный штамм CVS более устойчив к хранению при низких температурах, чем штамм L. Pasteur. Предположительно, различия криоустойчивости изучавшихся промышленных штаммов вируса бешенства обусловлены особенностями строения их капсидов. Этот вопрос требует отдельного изучения.

Полученные результаты по сохранности вируса бешенства промышленных штаммов в суспензии не соответствуют требованиям производства, так как необходимо сохранение спицефической ативности вируса на протяжении более длительных сроков. Поэтому следует провести исследования по применению различных режимов замораживания вирусной суспензии и использованию различных криозащитных сред. Полученные данные, вероятно, смогут позволить хранить промышленные штаммы вируса бешенства при низких температурах более длительное время без потери их специфической активности.

источник