МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 — 92 «Межгосударственная система стандартизации. Основ* ныв положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки. принятия, применения, обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. № 57-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166)004-97
Код страны no МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 год
Информация об изменениях х настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Методы лабораторной диагностики бешенства
Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies
Дата введения — 2015 — 01 — 01
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:
• метод флуоресцирующих антител (МФА);
• метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1);
— метод иммукоферментного анализа (ИФА);
• реакция диффузионной преципитации (РДП).
1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavwus.
2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).
3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест- систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ ИСО/МЭК 17025 — 2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 12.0.004 — 90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.005-68 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.008 — 76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.4.011 — 89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 17.0.0.01 — 76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения
ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия ГОСТ 2603 — 79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 2768 — 84 Ацетон технический. Технические условия ГОСТ 4204 — 77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 6709 — 72 Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ ISO 7218 — 2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 8074 — 82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.
ГОСТ 9147 — 80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрелзратое. Технические условия ГОСТ 12026 — 76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 21241-69 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.
ГОСТ 22967 — 90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 24661 — 91 (ИСО 7866 84) Шприцы инъекционные однократного применения
ГОСТ 25046 — 81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 25336 — 82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29230 — 91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и ло выпускам ежемесячного информационного указателя «На-циональные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабДовирус), и приводящее к летальному исходу в 100 % случаев.
3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.
3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.
3.1.2 метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеиниэотиоциаиатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.
3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства. основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.
3.1.3 биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.
3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства. основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.
3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.
3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
ФАГ- флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин;
АнГ- антирабический глобулин;
КФГ — контрольный флуоресцирующий глобулин;
ФБР — фосфатно-буферный раствор;
НГУК-1-невринома Гассерова узла крысы;
РНК — рибонуклеиновая кислота:
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота:
ССЫ31 — культура клеток мышиной нейробластомы:
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами I — II групп патогенности — ло ГОСТ ISO 7218.
4.1.2 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.
4.1.3 Требования к персоналу — по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК 17025. (1).
К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами I — II групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ. вакцинированные против бешенства.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ согласно ГОСТ 12.1.008.
4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.
4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.5 Утилизацию полученного для исследования материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 15 мин при давлении (0.11 ± 0.20) МПа.
5.1 Для проведения исследований используют:
• спектрофотометр сканирующий со спектральным диапазоном измерения длин волн от 190 до 1100 нм с погрешностью не более ± 0,5 нм и диапазоном измерения оптической плотности (ОП) от 0.1 до 3.0;
• планшеты для иммунологических реакций 96-луночные:
• термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 ‘-С до 50 °С:
• холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от О °С до 10 °С по ГОСТ 16317:
— микроскоп люминесцентный инвертированный по ГОСТ 8074:
— ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147 или гомогенизатор по ГОСТ ИСО/МЭК 17025;
• стекла предметные по ГОСТ 9284:
• пробирки стеклянные по ГОСТ 25336;
— чашки Петри по ГОСТ 25336;
• пипетки вместимостью 1.0; 2,0 и 10.0 см 3 по ГОСТ 29230;
• пипетки автоматические вместимостью от 0,05 до 0,20 см 3 с наконечниками:
• пинцеты медицинские по ГОСТ 21241:
— шприцы инсулиновые вместимостью 1,0 см 3 по ГОСТ 22967 или ГОСТ 24861;
• иглы инъекционные ло ГОСТ 25046:
• стекла культуральные на восемь лунок;
• клетки для содержания мышей;
• ацетон по ГОСТ 2603 или ГОСТ 2768;
• флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ);
— антирабический глобулин (АнГ);
— контрольный флуоресцирующий глобулин (КФГ);
• масло нефлуоресцирующее иммерсионное ло ГОСТ 13739;
— воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
• раствор фосфатно-буферный молярной концентрации 0.01моль/дм 3 (ФБР). pH 7,2 — 7.4;
• культуру клеток мышиной нейробластомы ССЫ31 или неериномы Гассерова узла крысы —
— среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (ДМЕМ), pH 7,2;
• сыворотку эмбриональную крови крупного рогатого скота для культур клеток 10 %-ную;
• перекись водорода 3 %-ную по ГОСТ 177;
• набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА;
• раствор серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 по ГОСТ 4204;
• бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
• штамп для приготовления лунок;
• агар «Дифко» или аналогичный;
• раствор метилового оранжевого 1 %-ный в 50 %-ном этиловом спирте:
— антигены положительный и отрицательный;
• сыворотку антирабическую или иммуноглобулин;
— мышей белых клинически здоровых массой 6 — 8 г.
5.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше. Допускается использование посуды одноразового применения.
6.1 Для проведения исследований на наличие вируса бешенства в лабораторию направляют патологический материал — свежий труп или голову мелких животных, голову или головной мозг крупных животных.
6.2 Отобранный для исследований патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в металлических контейнерах. Замороженный материал помещают в криоконтейнер.
6.3 Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные; наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-элиэоотологические данные.
6.4 Пабораторные исследования проводят сразу же при получении патологического материала.
6.5 Для исследования отбирают от крупных животных кусочки ткани из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кору больших полушарий, продолговатый мозг) размером 0.5 — 1.0 см. мозг мелких животных, например мышей, исследуют целиком.
Для исследования МФА и методом выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) пригодны только свежие или свежезамороженные пробы ткани головного мозга. Не допускаются для исследований пробы мозга животных, разлагающиеся (в стадии загнивания), консервированные глицерином, фиксированные метиловым спиртом, формалином или другими средствами, способствующими возникновению неслецифической флуоресценции.
Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30 % -50 %*ном растворе глицерина. Использование других консервантов не допускается. Для сохранности патологический материал может быть заморожен при температуре не выше минус 10 в С.
Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс «антиген-антитело», меченный ФИТЦ. обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.
7.2 Подготовка к исследованию
7.2.1.1 Из кусочков ткани, отобранных по 6.5, готовят не менее трех препаратов (отпечатков или мазков) из каждого отдела мозга на тщательно обезжиренных предметных стеклах. Если состояние патолсгического материала позволяет, то готовят отпечатки, в остальных случаях делают мазки.
7.2.1.2 Приготовление отпечатков
Кусочки ткани, отобранные по 6.5. кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре -шесть слоев. Мозг мелких животных разрезают поперек, захватывая все его отделы, и кладут его пиниетом срезом вверх на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре — шесть слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом, слегка надавливая его до получения на стекле тонкого отпечатка.
7.2.1.3 Приготовление мазков
Кусочек ткани из каждого отдела мозга (у мелких животных весь мозг целиком), отобранный по 6.5. растирают в фарфоровой ступке пестиком до образования гомогенной массы, из которой делают мазки на предметных стеклах.
7.2.1.4 Для контроля делают мазки или отпечатки из мозга здоровых, не болевших бешенством и не вакцинированных против бешенства, белых мышей, какописано в 7.3.1.2 и 7.3.1.3.
7.2.1.5 После приготовления мазки или отпечатки высушивают на воздухе в течение 20-30 мин. фиксируют в охлажденном ацетоне при температуре 4’Св течение 4 — 12 ч или при температуре минус 20 *С в течение 1 ч. после чего извлекают из ацетона и высушивают на воздухе в течение 10 — 15 мж.
ФАГ. АнГ и КФГ растворяют дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Срок хранения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ при температуре (5 ± 2) в С — не более двух недель.
Непосредственно для исследования необходимое количество растворенных ФАГ. АнГ и КФГ разводят ФБР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Рабочие разведения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ используют в день приготовления.
7.3 Проведение исследования
Предметные стекла с препаратами (мазками или отпечатками) по 7.2.1 помещают во влажную камеру (чашку Петри или кювету с увлажненным дном). Затем на один из трех приготовленных препаратов наносят ФАГ в рабочем разведении равномерно на всю поверхность мазка или отпечатка при помощи пипетки. На второй препарат наносят рабочее разведение КФГ. Закрывают камеру с препаратами. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30
мин. Параллельно окрашивают контрольные препараты. По окончании окрашивания препараты трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20 — 30 мин.
На третий препарат наносят рабочее разведение АнГ. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30 мин. Затем препарат трехкратно промывают, погружая каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе в течение 20 — 30 мин и окрашивают рабочим разведением ФАГ. как описано выше.
На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.
8 окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым. серовато-желтым цветом.
Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины — от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15 — 20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.
Диагноз бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желтовато-зеленые гранулы. При этом в контрольных препаратах (в мазках или отпечатках из мозга здоровых не болевших бешенством белых мышей, окрашенных ФАГ), а также в исследуемых препаратах, окрашенных КФГ и предварительно обработанных АнГ и окрашенных ФАГ. подобных образований быть не должно.
О результатах исследования сообщают компетентным органам в соответствии с порядком, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
8 случае отрицательного результата проводят исследования по 8 или 9.
8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1)
нейробластомы CCL-131 или НГУК-1 с последующей его идентификацией методом флуоресцирующих антител.
Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.
8.2 Подготовка к исследованию
Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого животного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5. измельчают ножницами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0.9 %-ный изотонический раствор натрия хлорида до получения 10 %-ной суспензии. В суспензию мозга добавляют пенициллин и стрептомицин по ЮС ЕД/см 3 и 1 мг/см 3 соответственно.
Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Над осадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при температуре не выше 4 °С до использования.
8.2.2 Подготовка культуральных стекол
Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культурального флакона при помощи 0,25 %-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10 %-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3 %-ным глютамином до концентрации 2 * 10 s клеток/см 3 . В лунки культурального стекла вносят по 0.1 см 3 полученной суспензии клеток, накрывают крышкой и помещают во влажный СОг-инкубатор с содержанием СОг 5 % при температуре (37±1)°С на 18-20ч
8.3 Проведение исследования
В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0.05 см 3 суспензии из каждого отдела головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом бешенства — штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный СОг-инкубатор с содержанием СОг 5 % при температуре (37 ± 1) *С на 42 — 48 ч.
По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0.2 см 3 раствора е каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 — 30 мин. Затем в каждую лунку вносят по 0.1 см 3 охлажденного до температуры минус 20 *С ацетона и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.
После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 — 30 мин. С помощью скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В каждую лунку добавляют по 0.05 — 0.10 см 3 ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем), приготовленном в ФБР. помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37 ± 1) в С в течение 30 мин.
По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.
На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.
В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым. серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).
Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.
Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.
Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.
Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител по 7.
9.2 Подготовка проб к исследованию — по 6.2.1.
9.3 Проведение исследования
Пять — шесть белых мышей заражают 10 %*ной суспензией патологического материала им-трацеребрально в объеме 0.02 — 0,03 см 3 . Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на ко* торую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30 дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.
При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взьерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.
Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включе* кия вируса бешенства.
Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми.
Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.
8 основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антиге* лом. иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго антирабического антитела, меченного пероксидазой. продукт реакции которой окрашивается при до* бавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количеству антигена.
10.2 Подготовка к исследованию
10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально зараженных вирусом бешенства животных.
10.2.2 Приготовление исследуемого антигена
Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят 10 %*ные суспензии в С.9 %-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной бане при температуре 60 *С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.
10.2.3 Подготовка реагентов
все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22 ± 1) *С.
Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.
10.3 Проведение исследования
10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.
Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.
Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет
10.3.2 Сенсибилизация планшета
6 лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 3 ч или при температуре 4 *С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхивают. а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.
8 ряды планшета А. 8 и С вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные положительный (лунка А1) и отрицательный (лунка А2) антигены, входящие в состав набора, а также исследуемые пробы (лунки АЗ. А4 и тщ.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1 : 2 до 1 : 8. При большом количестве проб заполняют и другие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в гермостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 1 ч. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как описано в 10.3.2.
10.3.4 Внесение антирабического лероксидазного конъюгата
В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, после чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) в С в течение 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.
10.3.5 Внесение субстратной смеси
Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию проявляют в течение 15 — 30 мин при температуре (22 ± 0.5) *С в темноте. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 .
10.4 Обработка результатов
Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с инструкцией по применению набора.
Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД. то измерение оптической плотности проводят при 490 нм. если используют ТМБ. то при 450 км.
Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным антигеном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контрольным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.
При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специфичности Ксп. который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП«) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОПг). Реакцию считают положительной. если коэффициент специфичности более 2.1 и отрицательной, если менее 2.1.
ОП1 * 0,641, ОПг а 0,120, Ксп = 5,34 — реакция положительная или ОП1 = 0,180, ОПг в 0,120 Кс„ * 1,5 — реакция отрицательная.
В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 — 9.
Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.
11.2 Подготовка к исследованию
Подготовка проб к исследованию — по 8.2.1.
Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бактериальной микрофлорой.
Для приготовления агара смешивают 1.5 г агара «Дифко». 1 см 3 1 %-ного раствора метилового оранжевого в 50 %-ном этиловом спирте. 0.01 г мертиолята. 100 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по пробиркам, автоклавируют при давлении 0.5 атм в течение 30 мин и хранят в холодильнике при температуре 4 в С.
11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)
Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стекло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при комнатной температуре на 20 — 30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2.5 см 3 расплавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм. и оставляют на 20 — 30 мин. 8 застывшем слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4 — 5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.
Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10 — 15 см 3 расплавленного агара для получения слоя толщиной 2-3 мм.
11.3 Проведение исследования
Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки (иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1.0 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 1.0 см 3 антирабической сыворотки, получая разведение 1 : 2.
перемешивают, и переносят 1.0 см 3 смеси во вторую пробирку и т. д. Таким образом, получают четыре пробирки с разведениями 1 : 2.1 :4.1 : 8 и 1 :16.
8 приготовленные лунки вносят по 0.05 — 0,07 см 3 пробы мозга (каждую пробу в отдельную лунку), полученной по 8.2.1. и разведения антирабической сыворотки или иммуноглобулина (1 : 2; 1 : 4; 1 : 8:1 :16) согласно рисунку 1.
Рисунок 1 — Схема внесения материала
Ар — эммонов рог; Пм — продолговатый мозг; А+ — положительный контрольный антиген; М -мозжечок; К — кора больших полушарий; А- — отрицательный контрольный антиген.
возможно применение других схем внесения материала, но при этом обязательно использование положительного и отрицательного антигенов.
Предметные стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри с увлажненным дном или влажный эксикатор, а затем в термостат при температуре (37 ± 1) *С на 48 ч (чашки Петри накрывают крышкой и помещают в термостат).
Реакцию учитывают через 6. 24 и 48 ч.
11.4 Обработка результатов
Реакцию считают положительной при появлении даже одной линии преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими исследуемый материал и антирабическую сыворотку (иммуноглобулин).
При этом между положительным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) должна наблюдаться заметная линия преципитации, а между отрицательным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) линии преципитации быть не должно.
8 случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 -10.
[1] ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary UseУДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220
Ключевые слова: бешенство, диагностика, метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ, биопроба, реакция диффузионной преципитации
Подписано в печать 01.04.2014. Формат 60x84V
Уел. пвч. л. 1,40. Тираж 31 экэ. Зак. 1363.
Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта
источник
По данным Роспотребнадзора, за январь-декабрь 2015 г. в Российской Федерации зарегистрировано 6 случаев инфицирования человека вирусом бешенства, что превышает показатели 2014 г. в два раза. Так же в стране зарегистрировано 3739 случаев заболеваемости животных, сообщает Центральная научно-методологическая ветеринарная лаборатория. Из них на долю диких животных, приходится 48,8%, собак и кошек – 37,9%, сельскохозяйственных животных – 12,4% эпизодов.
Полученные данные свидетельствуют о резком усугублении эпизоотической ситуации по бешенству, что заставляет обратить специалистов ветеринарной медицины усиленное внимание на данную проблему.
Наиболее действенным методом контроля бешенства среди животных является своевременная иммунопрофилактика и диагностика.
Возбудителем заболевания является вирус бешенства Rabies lyssavirus.
Family/ Семейство – Rhabdoviridae;
Species/ Вид — Rabies lyssavirus.
Методы лабораторной диагностики бешенства стандартизированы. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30-09-2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 г.
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства: метод флуоресцирующих антител (МФА); метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1); биопроба на белых мышах; метод иммуноферментного анализа (ИФА); реакция диффузионной преципитации (РДП).
Для диагностики используются:
1. Метод флуоресцирующих антител. Выявление антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.
Для выявления вирусного антигена в мазках-отпечатках мозга используют прямую и непрямую реакцию иммунофлюоресценции. Мазки фиксируют в холодном ацетоне в течение 8-10 ч при температуре 4° С и обрабатывают во влажной камере 30 мин. антирабический иммуноглобулин, меченым ФИТЦ, промывают фосфатным буфером, высушивают и исследуют в люминесцентном микроскопе. Антигены вируса наблюдается в виде зеленых гранул разной формы и величины. В случае отрицательного результата, требуется провести другие методы диагностики.
2. Метод выделения вируса в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131. Основан на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.
Суспензированый пат. материал вносят в культуру клеток, оставляя лунки для контроля. Положительный контроль — суспензия мозга мыши со штаммом вируса бешенства CVS, отрицательный — суспензия мозга клинически здоровой мыши. Далее инкубируют во влажном CO2 инкубаторе с содержанием 5 CO2% при 37±1°С в течении 42-28ч. Высушивают, фиксируют в холодном ацетоне в течении 30 мин, вновь высушивают. Далее с добавлением ФАГ в рабочем разведении, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при 37±1°С в течении 30 мин. По окончании трехкратно промывают, погружая на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе. Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы с четкими краями.
3. Метод биопробы. Выделение вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.
Наиболее пригодными для заражения являются мыши-сосунки. Для постановки биопробы используют 15-20 животных. Заражение проводят под наркозом путем интрацеребрального введения 0,03 мл суспензии исследуемого материала. При наличии в исследуемом материале вируса бешенства у мышей возникает тремор мышц, параличи. В большинстве случаев животные погибают в течение пяти дней. Наличие вируса бешенства в зараженных и погибших мышах необходимо подтвердить с помощью прямой реакции иммунофлуоресценции или обнаружения телец Бабеша-Негри. Идентификацию обнаруженного вируса бешенства проводят также с помощью реакции нейтрализации на белых мышах.
4. Метод иммуноферментного анализа. (ELISA) Основан на специфическом взаимодействии вирусного антигена с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго, меченного ферментом, антитела, путем окрашивания продукта реакции хромогеном.
ИФА проводят в «сэндвич» варианте. На твердой фазе иммобилизуют гамма-глобулин. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают. В лунки вносят антирабический пероксидазный коъюгат. После инкубации проводят отмывку. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем. Отрицательный результат нуждается в подтверждении другими методами диагностики.
5. Реакция диффузионной преципитации. Метод, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый в виде линии преципитации.
Готовые разведения антирабической сыворотки вносят в приготовленные лунки в агаровом геле. Чашки Петри помещают в термостат при 37±1°С на 48 часов. Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-глобулин. Отрицательный результат подтверждается другими методами.
Принимая во внимание высокую опасность болезни, обусловленную полной летальностью, специалисту ветеринарной медицины нужно знать, что окончательный диагноз может быть поставлен только методами лабораторной диагностики. Поэтому трудно переоценить значимость вышеперечисленных методов для практической ветеринарной медицины.
Библиографический список
Гайсаров, М.С. Эпизоотологическая характеристика бешенства животных в Республике Башкортостан, профилактика и меры борьбы с ним [Текст] : автореферат дис. канд. биол. наук : 16.00.03 / Гайсаров М. С.; Башкирский ГАУ. — Уфа : [б. и.], 2009. с. 18-19
Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза [Текст] / А.М. Гулюкин // М.:Вопросы вирусологии № 3, 2014 г. — с. 5-10.
Масимов, Н.А. Инфекционные болезни собак и кошек. [Электронный ресурс] / Н.А. Масимов, С.И. Лебедько. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2009. — 128 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/book/256
Методы лабораторной диагностики бешенства. [Текст] : ГОСТ 26075-2013 — Введ. 2015-01-01. — М.: Госстандарт России, 2013. — 19с.
источник
Бешенство (Б) – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением ЦНС. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек.
Болезнь регистрируется в различных регионах земного шара. Не отмечено случаев распространения болезни в Австралии, Великобритании, Японии. Заболевание почти всегда заканчивается смертью. Имеются фактически документированные случаи выздоровления от бешенства человека и собак после экспериментальной инфекции.
Вирус бешенства (ВБ) относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В настоящее время установлено, что ВБ имеет 4 серотипа, что обусловлено, видимо, различием в составе мембранных белков. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности. ВБ обладает ГА и ГАД свойствами. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА, антиГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) АТ.
Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений (они имеют меньшее значение) и, главным образом, результатов лабораторных исследований.
Лабораторная диагностика заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного АГ в ИФ, РДП, обнаружении телец Бабеша — Негри и биопробе на белых мышах.
В Российской Федерации в настоящее время организовано производство наборов для диагностики Б в ИФ и РДП в ВНИТИБП и КазНИВИ.
Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мелких животных, от крупных животных — голову или головной мозг. В некоторых случаях допускается консервирование головного мозга в 50%-ном глицерине. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в полиэтиленовый мешок, мозг — в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитой парафином. Материал упаковывается во влагонепроницаемую тару. Для вирусологических исследований пригоден только не консервированный мозг. Необходимо помнить, что вскрытие трупа, извлечение мозга и другие операции с патологическим материалом следует проводить в условиях стерильности и строгого соблюдения мер личной профилактики: прочно фиксируют голову животного, защищают руки 2-мя парами перчаток (хирургические и анатомические), для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот-6-слойную марлевую повязку.
Лабораторные исследования материала на бешенство проводят вне всякой очереди; результаты немедленно сообщают врачу хозяйства и главному врачу района (города).
Индикация и идентификация вируса. Порядок проведения исследований: из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого) готовят по 4 мазка-отпечатки для ИФ и обнаружения телец Бабеша — Негри; с мозговой тканью ставят РДП; при отрицательных результатах ставят биопробу.
Обнаружение специфических телец-включений. Мазки-отпечатки окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматривают в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша — Негри (при окраске по Селлерсу — четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплазме, при окраске по Муромцеву — светло-фиолетовые с темно-синими включениями тельца Бабеша — Негри, чаще они расположены вне нервных клеток.
Наиболее характерная особенность телец Бабеша — Негри — их внутренняя структура, позволяющая абсолютно точно дифференцировать их. Внутри видны маленькие зернышки — базофильные зернистости темно-голубого, даже черного цвета величиной 0,2-0,5 мкм.
Диагностическая ценность обнаружения телец-включений для доказательства заражения ВБ общепризнана. Однако и у здоровых животных, в особенности у кошек и белых мышей, имеются образования, присутствие которых может вызвать диагностические затруднения. В отдельных случаях в мозге кошки можно с уверенностью дифференцировать подобные включения от телец Бабеша — Негри, и здесь рекомендуется воспользоваться методами идентификации, в особенности ИФ. Равным образом и у собак, погибших в результате отравления змеиным ядом или поражения электрическим током, можно найти тельца-включения, напоминающие тельца Бабеша – Негри. Тельца Бабеша — Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом, и материал исследуется в других тестах (ИФ, РДП, биопроба).
ИФ. Один из основных тестов при диагностике Б. При высококвалифицированном выполнении получают в 99-100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюоресцирующего Ig. Фиксацию препаратов в охлажденном (8-10°С) ацетоне проводят не менее 4-х ч. В качестве отрицательного контроля используют мазки-отпечатки головного мозга здоровых белых мышей. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микроскопе на основе оценки интенсивности свечения комплекса АГ-АТ. АГ ВБ выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек, В контроле подобного свечения не должно быть.
Для доказательства специфичности свечения комплекса АГ-АТ используют метод подавления ИФ, который заключается в способности рабического АГ, связанного с нефлюоресцирующими AT, вторично не вступать в соединение с флюоресцирующими специфическими AT. Для этого на фиксированные препараты, приготовленные из исследуемого головного мозга, наносят 5%-ный антирабический нефлюоресцирующий Ig, выдерживают 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают физраствором, а затем окрашивают флюоресцирующим антирабическим Ig общепринятым прямым методом. В обработанных таким образом препаратах флюоресценции не должно быть.
Метод ИФ дает возможность обнаруживать ВБ в клетках роговицы глаз и предварительно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического её проявления. Метод может быть использован для исследования подозреваемых в заболевании Б животных, а также клинически здоровых собак и кошек, покусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все правила личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. Нужно следить, чтобы животное не моргало третьим веком, так как со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Для контроля аналогичным образом готовят отпечатки роговицы от здоровых животных. Их можно приготовить в хозяйстве. Отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в течение 4 ч при 4°С, упаковывают и отправляют в лабораторию. Окрашивают препараты, как при ИФ, по общепринятой методике.
В препаратах, полученных от больных животных или находящихся в конце инкубационного периода болезни, в цитоплазме многих эпителиальных клеток наблюдаются разной формы ярко светящиеся гранулы разного размера — от пылевидных точек до 2 мкм и более. С целью получения достоверных результатов в каждом препарате просматривают по 50-100 клеток, а всего от животного — не менее 200-400 клеток. Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более клеток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здоровых животных (контроль), вследствие аутофлюоресценции, могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками.
Важно отметить, что ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постановке диагноза путем биопробы, поскольку диагноз при Б может быть установлен только на 4-8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубационный период заболевания мышей может достигать и 20 дн. ИФ может выявлять ВБ в тканях подчелюстной слюнной железы. Из подчелюстных слюнных желез готовят препараты-мазки, беря материал не менее чем из 6 разных участков железы, так как распределение в ней вируса неравномерно. Часто, чтобы получить отпечаток, приходится делать сильный нажим, поскольку из-за обилия муцина на стекле остается мало материала.
Показана возможность идентификации ВБ в коже методом ИФ, С этой целью берут пробы кожи головы, а также фолликулы сенсорных и тактильных волос морды или латеральных сенсорных сосочков (на щеке собаки). Пробы хранят при -20 или -70°С. Из них делают криосрезы, которые обрабатывают флюоресцирующим глобулином. Результаты ИФ анализа, полученные при идентификации ВБ в коже, в высокой степени коррелируют с данными, полученными при исследовании мозга того же животного. Показана близкая корреляция между обнаружением АГ вируса в пробах мозга и тканях губы методом ИФ.
РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микрометодом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой методике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А — аммонов рог (правая сторона); В — кора головного мозга (правая сторона); С — мозжечок (правая сторона);
Д — продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) — положительный контроль; — (минус) — отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 — лунки с разведением специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно
Из каждого отдела головного мозга с помощью пинцета готовят гомогенную пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки. От мышей исследуют весь головной мозг. Из отделов головного мозга левой стороны готовят АГ аналогичным образом ( на каждую экспертизу в общей сложности требуется 4 предметных стекла с агаровьм гелем). Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии 1 или 2-3 линий преципитации между лунками, содержащими АГ и иммуноглобулин, реакцию считают положительной.
РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного АГ в исследуемом материале составляет 45-70. При исследовании головного мозга мышей, полученного при положительной биопробе, РДП выявляет до 100% случаев. Отсутствие в исследуемом материале телец Бабеша — Негри, специфической флюоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышах с последующей идентификацией вируса.
Биопроба. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша — Негри, ИФ и др. Однако и она в отдельных случаях оказывалась отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза Б путем обнаружения телец-включении и ИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался от 1,3 до 12.
Сведения о различной эффективности биопробы могут быть объяснены рядом факторов: выбора экспериментального животного, количества их в опыте, способа заражения, способа и срока хранения материала до поступления в лабораторию. Может играть роль и явление интерференции инфекционных частиц неактивными частицами, если для инокуляции используют недостаточно разведенный материал.
В мозге и слюнных железах лисиц и скунсов, павших от бешенства, обнаружено вещество, ингибирующее инфекционность вируса, что не позволяет провести диагностику болезни у этих животных методом внутримозгового заражения мышей. Наличие ингибирующего вещества в исследуемом материале не препятствует выявлению вирусного АГ методом ИФ; для скунсов и лисиц это самый чувствительный метод диагностики.
Из животных всех видов (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомячки), использованных для биопробы, многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам ВБ и менее опасны в работе. Сирийские хомячки по чувствительности не уступают мышам, но они менее доступны.
РСК. Выявление специфического АГ в РСК при диагностике бешенства применяется реже, чем другие методы. Из присланного для исследования мозга готовят АГ. Для этого мозговую ткань (особенно богаты АГ, связывающим комплемент, кусочки таламуса и стволового отдела мозга) растирают в вероналовом буфере в соотношении 1:10 и оставляют при комнатной температуре на 1 ч, после чего суспензию инактивируют при 56°С в течение 5 ч. Такая обработка убивает вирус и снимает антикомплементарность мозговой ткани, не повреждая специфический АГ. Суспензию центрифугируют 15 мин при 3500 мин- 1 из надосадочной жидкости, которая представляет собой материал для исследования на наличие АГ, готовят 2-кратно возрастающие разведения от 1:2 до 1:64 и используют для исследования в РСК.
ИФА. В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства животных выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С 8-18 ч. Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ ВБ в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ным р-ром формалина с рН 5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.
В отличие от РН на мышах и в культуре клеток ИФА позволяет выявить AT у животных в течение нескольких часов, ИФА — наиболее перспективный лабораторный метод обнаружения AT и индикации самого вируса. Экспресс-методом диагностики бешенства является техника захвата и метод ИФ для выявления АГ ВВ. Доказано, что метод выявления АГ ВБ в парафинизированных срезах пероксидазо-антиперокисдазным методом значительно превосходит метод ИФА. В 1987 г. создан набор для быстрой энзимиммунодиагностики бешенства (RREID), приемлемый для эпидемиологических и лабораторных исследований.
РН. Используется редко. Рекомендуется модификация с разведением ВБ и постоянной дозы γ-глобулина. ИН 2 указывает на АГ специфичность выделенного вируса.
Вариантная идентификация с помощью монАТ. С помощью монАТ к гликопротеинам ВБ селектированы АГ варианты, среди которых выделены фенотипически термолабильные (авирулентные) варианты. При использовании 2-х групп монАТ показано, что штаммы дикования отличаются от шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA и «утиных» штаммов по АГ детерминантам. Изучение с помощью монАТ 7-ми штаммов, выделенных от больных Б людей, позволило выявить определенные отличия их от вакцинного штамма в отношении АГ детерминант.
Общепризнано, что AT отличия между дикими штаммами удается обнаружить, используя монАТ против нуклеокапсидного AT N, которые реагируют с цитоплазматическими включениями зараженных вирусом клеток; против гликопротеина (G АГ), которые реагируют с мембранами инфицированных клеток, лизируют эти клетки в присутствии комплемента и нейтрализуют вирус. В связи с возможной АГ вариабельностью поверхностного гликопротеина ВБ из различных географических зон в качестве протективного АГ использовали рибонуклеопротеин, характеризующийся консервативностью АГ структуры. Таким образом, не только G белок, но и РНП ВБ обладают протективной активностью.
Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Эти методы для бешенства нетипичны, поскольку используются только с целью проверки поствакцинального иммунитета. Для обнаружения и титрования поствакцинальных AT используют РН, которую ставят общепринятым методом. В качестве АГ используют фиксированный ВБ. РН на клетках ВНК-21 была более чувствительной, чем непрямая ИФ при выявлении AT в сыворотках вакцинированных лис. Кроме того, предложены РТГА и ELISA.
РТГА. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за наличия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым ВБ высокочувствителен, а главное, ГА АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувствительностью. Для приготовления ГА АГ ВБ предложено использовать шт. Москва, выращенный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. ГА отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугированием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой ГА активностью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 мес при рН 5-9.
Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную 2-кратную трипсинизацию гусиных эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипси-низированных эритроцитов (лучше 10 7 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой р-р (рН 9) с добавлением 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом р-ре с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, окончательный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 мин, а с эритроцитами 2-дн цыплят или макаки-резус — через 1-1,5 ч.
Разработан радиоиммунологический анализ, основанный на способности AT связываться с меченым 125 1-АГ ВБ. Меченый IgG, выделенный из антирабической гипериммунной сыворотки, можно применять для обнаружения АГ ВБ твердофазным РИА. Лучшие результаты получены при использовании фосфатно-солевого р-ра (рН 6,0) с ионной силой 0,01 М и меченого IgG с активностью 200-250 тыс. имп./мин.
Твердофазный конкурентный РИА применим для выявления антирабических AT в сыворотке и гибридомных супернатантах.
Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить болезнь Ауески, при которой больные животные неагрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломиелите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов ВБ, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в ПЦР сегмента гена N.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
источник
Бешенство — острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие животные.
Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфекции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.
Продолжительность инкубационного периода зависит от места и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1—3 нед до года и даже более.
Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у собак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (паралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бешенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения может не быть.
Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.
Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Проникая с периферии (место укуса) по нервным стволам в центральную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.
Вирус относится к семейству Rhabdoviridae,родуLyssavirus. Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион вируса — РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5—10 мин, солнечный свет — за 5—7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5—10 мин.
Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наружный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих антител, а нуклеокапсидный — комплементсвязывающих и преципитирующих антител.
В организме вирус локализуется главным образом в центральной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.
Культивируется на мышах, кроликах, морских свинках и других животных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предварительной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуцирует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.
Источником инфекции являются больные животные. Они передают вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.
Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, имеющих решающее значение.
При работе с больными животными и инфекционным материалом необходимо строго соблюдать меры личной безопасности: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, резиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защитные очки, защитную маску на лицо.
Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством животных в полевых условиях запрещено.
Получение пат.материала. Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных — голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектицидами.
Патологический материал упаковывают в пластмассовые мешки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.
Лабораторная диагностика. Она включает: обнаружение вирусного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.
РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин.
Методика постановки РИФ. На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воздухе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влажную камеру при 37 °С на 25—30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.
В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуоресцирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток.
В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.
Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.
Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.
В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и
т. д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.
РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
источник