Ифа на вирус бешенства

Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

источник

Что такое бешенство? Причины возникновения, диагностику и методы лечения разберем в статье доктора Александров П. А., инфекциониста со стажем в 11 лет.

Бешенство (rabies, гидрофобия, водобоязнь) — острое, безусловно смертельное для человека заболевание, вызываемое вирусом бешенства, который посредством специфического воспаления тканей центральной нервной системы приводит к развитию энцефалита и, как правило, к летальному исходу. Является предотвратимым при проведении своевременного курса вакцинации до (в профилактических целях) или после момента заражения.

Вид — вирус бешенства Rabies virus:

• дикий — патогенный для человека;
• фиксированный — лабораторный, лишённый заражающей способности.

Вирус бешенства имеет вид винтовочной пули, размерами 75-175 нм, с одним плоским и другим закруглённым концами. РНК-содержащий вирус снаружи покрыт гликопротеиновым каркасом, имеющим специфические шипы (рецепторы — гликопротеин G ответственен за проникновение вируса в клетку и иммуногенность; при проведении вакцинации к нему образуются антитела, нейтрализующие вирус). Внутри содержит нуклеокапсид и матриксные белки: N-белок, L-белок, NS-белок. Различают семь серотипов вируса бешенства. В РФ распространён серотип 1.

Вирус бешенства неустойчив в окружающей среде, практически мгновенно погибает под воздействием прямых солнечных лучей, при нагревании до 60°C инактивируется в течении 10 минут, при действии различных бытовых дезинфектантов и спирта, а также при высушивании — практически мгновенно, при воздействии желудочного сока — за 20 минут.

В трупах павших животных может сохраняться до трёх месяцев. Вирус достаточно устойчив к низким температурам, (при 0°C может сохраняться несколько недель), однако при этом быстро теряет свою вирулентность — способность вызывать заболевание. При оттаивании и повторном замораживании погибает — это, в совокупности в другими факторами, обуславливает невозможность такого пути заражения.

Культивация вируса происходит посредством внутримозгового заражения лабораторных животных (белые мыши, крысы) — в таких случаях скрытый период длится до 28 дней. [1] [2] [3]

Бешенство — зоонозная природно-очаговая инфекция. Распространение практически повсеместное (исключение — Япония, Новая Зеландия, Великобритания, Австралия и Антарктида). Источником инфекции могут быть собаки (до 99%), лисы, летучие мыши, волки, кошки и мелкие грызуны. Любое млекопитающее и птицы могут болеть бешенством, но в подавляющем большинстве не представляют опасности для человека (например, птицы).

• контактный — при укусе или ослюнении, редко возможно заражение при разделке убитого животного;
• маловероятен аэрозольный механизм заражения — например, в пещере, населённой летучими мышами;
• алиментарный — при поедании павших от бешенства животных;
• трансплацентарный путь — при пересадке органов от умерших людей от бешенства (при неверно поставленном диагнозе).

В широкой практике вирус передаётся только через слюну, всё остальное является казуистическими случаями (при поедании животного — через мозговое вещество, при пересадке роговицы и т.п.).

Передача вируса от человека к человеку при укусе или поцелуе, при укусе мышей (кроме летучих) теоретически возможна, однако таких случаев не зарегистрировано.

Рост заболеваемости характеризуется периодичностью, зависящей от природных условий, колебаний наличия кормовой базы грызунов, численности плотоядных животных.

Заражение может наступить при:

• укусе больного животного (становится заразным за несколько дней до начала клинических проявлений — в среднем 5-7 дней, максимально до 10);
• прямом ослюнении повреждённых кожных покровов и слизистых оболочек (даже микроскопическом);
• теоретически возможно заражение при оцарапывании кожи когтями больного животного (на когтях вируса нет, но после получения царапины слюна животного может попасть в свежую рану, например, при лае).

Следует понимать, что не каждое больное бешенством животное выделяет вирус со слюной и не каждый укус передаёт человеку вирус бешенства. В среднем, при укусе животного, у которого доказано заболевание бешенством, при отсутствии антирабической вакцинации у укушенного заболевают не более 30% человек. Слюна на полу, земле, траве, пакете, дверной ручке, в реке и т.п. опасности для человека не представляет.

Восприимчивость всеобщая. Наибольшей опасности подвергаются дети, особенно в сельской местности (множество бродячих и диких животных). Ежегодно от бешенства погибает около 50 тысяч человек, в основном в Южно-Азиатском регионе.

Интересной особенностью является наличие естественного иммунитета к вирусу у холоднокровных животных и рыб. [1] [4] [5]

Инкубационный период составляет от 10 дней до 3 месяцев. Он зависит от локализации укуса:

• наиболее быстро заболевание развивается при укусе в лицо, шею, голову, больших повреждениях;
• более длительный период при локализации укусов в конечности, туловище, особенно единичных.

Описаны казуистические случаи скрытого периода до 1 года.

В развитии бешенства выделяют несколько периодов, последовательно сменяющих друг друга (иногда без чётко прослеживающейся динамики):

• инкубационный (10 дней — 1 год);
• продромальный (1-3 дня);
• возбуждения (2-3 дня);
• паралитический (1-3 дня).
• смерть.

После укуса формируется рубец, ничем не отличающийся от рубцов другого происхождения.

Начальными признаками развития бешенства наиболее часто являются:

• зуд;
• неприятные ощущения;
• малоинтенсивные боли в месте укуса и близлежащей области;
• воспаление рубцовой ткани (происходит нечасто).

Появляются общее недомогание, повышенная потливость, субфебрильная температура тела (37,1–38,0 °C), сухость во рту, снижение аппетита, чувство стеснения в груди. Сон больных нарушен — нередки кошмары в начале болезни, сменяющиеся бессонницей. Нарастает беспричинная тревога, беспокойство, тоска, появляется страх смерти (с нарастающим компонентом), причём выраженность данных симптомов повышается в зависимости от того, насколько сильно человек осознает возможность заболевания.

Повышается чувствительность к раздражителям (звуковым, тактильным, световым) с постепенным нарастанием их выраженности. Крайняя степень — аэрофобия, фотофобия, акустикофобия, гидрофобия — характеризуется вздрагиванием всего тела при малейшем дуновении ветра, звуках, ярком свете, судорогами мышц глотки, одышкой, вытягиванием рук вперёд, чувством страдания на лице с экзофтальмом, расширением зрачка, взглядом в одну точку в течении нескольких секунд.

Часто появляется икота, рвота. Во рту скапливается густая вязкая слюна, больной покрывается холодным липким потом, повышается ЧСС (пульс).

Часто на этом фоне при прогрессировании заболевания возникает возбуждение, больные мечутся, взывают о помощи, могут приходить в яростное состояние с помрачением сознания — дерутся, рвут одежду, могут ударить окружающих или укусить. После наступает состояние относительного покоя, сознание проясняется, и поведение становиться вполне адекватным.

Наиболее известный симптом бешенства — гидрофобия, когда при попытке выпить воды или даже при виде и мысли о воде развивается характерный судорожный приступ. В течении нескольких дней из-за невозможности пить и есть развивается обезвоживание, снижение массы тела. Начинается обильное слюноотделение, больные не сглатывают слюну, и она стекает с уголков рта и по подбородку.

Если во время одного из приступов не наступает смерть, развивается период параличей. Исчезают приступы, возбуждение и страх, больные начинают питаться и пить воду. Данное состояние можно принять за улучшение и тенденцию к выздоровлению, однако это грубое заблуждение и признак скорой смерти. Снижаются двигательные и чувствительные характеристики мышц лица, языка, конечностей. Повышается температура тела до гиперпиретических цифр (40–42°C), нарастает тахикардия, снижается артериальное давление, нарастает вялость, апатия. Смерть неизбежно наступает от паралича дыхательного и сосудистого центров на 6-8 день болезни.

Не всегда бешенство включает все указанные периоды, иногда наблюдается выпадение продромального периода, фазы возбуждения, может наблюдаться картина восходящих параличей («тихое» бешенство) с более длинным инкубационным периодом и временем развития заболевания без типичных симптомов (часто верный диагноз не устанавливается).

Бешенство у детей имеет более короткий инкубационный период и чаще протекает в «тихой» форме без выраженного периода возбуждения.

У беременных бешенство может протекать в достаточно видоизменённой форме (часто первично принимается за токсикоз), летальность 100%, влияние на плод в настоящее время недостаточно изучено. [1] [2] [5]

После укуса или ослюнения повреждённого кожного покрова вирус бешенства некоторое время (до трёх недель) находится в месте внедрения. После этого начинается его центростремительное распространение в направлении центральной нервной системы (ЦНС) по периневральным пространствам со средней скоростью 3 мм/ч (аксоплазматический ток). Каких-либо значимых изменений в структуре нервной ткани не отмечается.

Возможно лимфогенное распространение вируса, однако роли в патогенезе и заражении это не играет.

Достигнув ЦНС вирус активно размножается в клетках (наиболее значимые области — аммонов рог, мозжечок, продолговатый мозг), где происходят воспалительно-дистрофические изменения умеренной выраженности (негнойный полиэнцефалит), обусловливающие изменение жизнедеятельности, паралитические явления и смерть (от паралича дыхательного и сосудодвигательного центров).

При исследовании материала мозга в цитоплазме клеток обнаруживаются специфические тельца Бабеша-Негри (цитоплазматические эозинофильные включения).

Из мозга вирус по центробежным нефронам попадает в различные органы и ткани, в том числе и слюнные железы и выделяется со слюной в окружающую среду. [1] [2] [3]

1. по стадиям:
2. продромальная (предвестники заболевания);
3. разгара (возбуждения/депрессии);
4. параличей (отключение функционирования органов);
5. по клиническим формам:
6. бульбарная (расстройство речи, глотания, асфиксия);
7. менингоэнцефалитическая (симптоматика психоза);
8. паралитическая (ранее развитие параличей);
9. мозжечковая (головокружение, неустойчивость походки);
10. по МКБ-10:
11. лесное бешенство (от диких животных);
12. городское бешенство (от домашних животных);
13. бешенство неуточнённое;
14. по типу:
15. эпизоотия (одномоментное прогрессирующее распространение заболевания среди большого количества животных) бешенства городского типа;
16. эпизоотия бешенства природного типа. [3][4]

Ввиду быстрого наступления смерти при развитии бешенства осложнения просто не успевают развиться. [1]

Диагностика бешенства происходит на основании комплекса эпидемиологических и клинико-лабораторных данных. Общеклинические методы исследований малоинформативны.

Из специфических лабораторных тестов выделяют прижизненные методы и посмертные (имеют наибольшее значение). Практически все они недоступны в общелабораторной сети и выполняются только в лаборатории особо опасных инфекций (например, в антирабическом центре ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России в Москве).

• определение вирусных антигенов в отпечатках роговицы или биоптате кожи затылка методом МФА (метод флуоресцирующих антител);
• определение антител к вирусу бешенства с седьмого дня болезни (чаще всего не удаётся ввиду наступления гибели человека);
• ПЦР спинномозговой жидкости.

Посмертные диагностические методы:

• гистологический экспресс-метод мазков-отпечатков головного мозга (обнаружение телец Бабеша-Негри — достоверность около 85-90%, время выполнения до 2 часов);
• биологический метод (основанный на заражении лабораторных животных и обнаружении телец Бабеша-Негри в мозговой ткани погибших животных, достоверность до 100%, время выполнения до 30 дней);
• методы ИФА и ПЦР тканей мозга, слюны, роговицы. [2][4]

При заражении человека и появлении начальных симптомов бешенства практически неизбежен летальный исход. В мире известно лишь о нескольких случаях излечения от развившегося бешенства (т.н. «Милуокский протокол» — введение в искусственную кому с поддержанием основных жизненных функций), однако в большинстве случаев любые методы лечения оказываются неэффективными и способны лишь незначительно продлить время жизни человека.

В целях повышения качества жизни и уменьшения страданий больного помещают в отдельную изолированную палату с минимизированными факторами внешней агрессии (затемнение, звукоизоляция, отсутствие сквозняков). Назначается комплекс лекарственных средств, направленный на уменьшение возбудимости нервной системы, дезинтоксикацию организма, поддержку дыхательной и сердечно-сосудистой функций. [1] [3]

Основным средством предупреждения распространения и заболевания бешенством является выполнение ряда профилактических мероприятий, позволяющий снизить риски инфицирования и развития заболевания.

Выделяют мероприятия, направленные на предотвращение распространения бешенства в природе (как дикой, так и в антропургической среде):

• регуляция численности диких и одичавших домашних животных-хищников (отлов, отстрел, вакцинация);
• соблюдение правил содержания собак, кошек и пушных зверей;
• обязательная вакцинация от бешенства домашних животных, особенно собак и кошек, профилактическая вакцинация лиц, связанных с постоянным контактом с животными;

В случае, если произошла встреча с животным и последующее прямое ослюнение им повреждённых кожных покровов (слизистых оболочек) или укус необходимо провести комплекс профилактических мероприятий, направленных на предотвращение потенциального заражения вирусом бешенства и развитие заболевания.

В первую очередь необходимо оценить и зафиксировать:

• с каким именно животным столкнулись (дикое, домашнее);
• какого его поведение (адекватное ситуации, агрессивное, излишне дружелюбное);
• есть ли возможность проводить за ним наблюдение — это очень важно: нельзя убивать или прогонять животное, так как элементарное наблюдение за поведением зверя до 10 дней от укуса позволяет исключить бешенство с вероятностью 100% (при отсутствии гибели или изменения в поведении можно спокойно выдохнуть и забыть об инциденте).

По возможности животное доставляют в ветеринарную службу для осмотра и помещения на карантин до 10 дней, при гибели животного должно быть обязательно проведено исследование на бешенство.

Как можно раньше после укуса необходимо промыть рану концентрированным мыльным раствором и незамедлительно обратиться в ближайшее медицинское учреждение (травматологическое отделение, антирабический кабинет) для консультации врача-рабиолога и определения показаний к проведению антирабической вакцинации и её объёму. При этом будет иметь значение наличие или отсутствие случаев бешенства в районе, принадлежность животного, его поведение, наличие профилактических прививок от бешенства, характер и локализация повреждений и др.

Достаточно распространены мифы и излишние страхи о возможности заражения в абсолютно невозможных для этого ситуациях или, напротив, преуменьшение рисков в действительно опасной ситуации. Поэтому не следует оставлять такие инциденты на самотёк, необходимо изложить все факты врачу на приёме и совместно принять верное решение.

Консультирования на заочных интернет-порталах являются хорошим начинанием, однако зачастую проводятся специалистами, не имеющими должного образования и понимания проблемы, на них невозможно оценить некоторые важные моменты, поэтому ни в коем случае не стоит подменять очную консультацию рабиолога на совет «дяди» из телевизора. Помните, что расплата за неверное решение в данном случае — смерть!

Единственным методом высокоэффективного предотвращения развития заболевания и сохранения жизни человека является вакцинация.

В зависимости от степени риска практикуется введение антирабического иммуноглобулина (при высоком риске) в сочетании с антирабическими вакцинами. Все вакцины от бешенства являются взаимозаменяемыми, в РФ допускается введение до шести доз вакцины, в прочих странах курс может несколько отличаться в зависимости от вакцины.

Введение вакцин должно осуществляться строго по графику, утверждённому производителем и лечащим врачом. Отход от схемы грозит нарушением выработки антител и смертью.

Особо следует отметить, что не существует абсолютных противопоказаний к вакцинации от бешенства. При наличии каких-либо заболеваний и состояний, препятствующих проведению процедуры, её выполнение должно осуществляться в стационаре под контролем медицинского персонала и прикрытием противоаллергических и иных средств.

Чем раньше начат курс вакцинации, тем больше шансов на благоприятный исход ситуации, поэтому основное правильное действие после опасной ситуации — незамедлительно очно посетить врача-рабиолога, который проведёт анализ ситуации и примет ответственное решение.

Как правило, вакцинация не приводит к каким-либо негативным последствиям, наиболее выраженные из них — это умеренная болезненность и чувствительность в районе инъекции и аллергические реакции, достаточно легко купируемые соответствующими средствами.

На время вакцинации следует отказаться от чрезмерных нагрузок на организм, приёма иммунодепрессивных препаратов (при возможности), употребления алкоголя (имеют место случаи ухода в длительный запой и пропуска прививок), так как истощающие и иммунодепрессивные влияния могут ослабить выработку защитных антител и быть причиной неудачи вакцинации.

После окончания курса все ограничения снимаются, так как к этому времени происходит формирование адекватного уровня иммунитета и гибель вируса. [1] [3]

источник

Бешенство (Б) – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением ЦНС. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных регионах земного шара. Не отмечено случаев распространения болезни в Австралии, Великобритании, Японии. Заболевание почти всегда заканчивается смертью. Имеются фактически документированные случаи выздоровления от бешенства человека и собак после экспериментальной инфекции.

Вирус бешенства (ВБ) относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В настоящее время установлено, что ВБ имеет 4 серотипа, что обусловлено, видимо, различием в составе мембранных белков. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности. ВБ обладает ГА и ГАД свойствами. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА, антиГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) АТ.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений (они имеют меньшее значение) и, главным образом, результа­тов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного АГ в ИФ, РДП, обнаружении те­лец Бабеша — Негри и биопробе на белых мышах.

В Российской Федерации в настоящее время организовано производство наборов для диагностики Б в ИФ и РДП в ВНИТИБП и КазНИВИ.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мел­ких животных, от крупных животных — голову или головной мозг. В некоторых случаях до­пускается консервирование головного мозга в 50%-ном глицерине. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в полиэтиленовый мешок, мозг — в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитой парафином. Материал упаковывается во влагонепроницае­мую тару. Для вирусологических исследований пригоден только не консервированный мозг. Необходимо помнить, что вскрытие трупа, извлечение мозга и другие операции с патологи­ческим материалом следует проводить в условиях стерильности и строгого соблюдения мер личной профилактики: прочно фиксируют голову животного, защищают руки 2-мя парами перчаток (хирургические и анатомические), для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот-6-слойную марлевую повязку.

Лабораторные исследования материала на бешенство проводят вне всякой очереди; результаты немедленно сообщают врачу хозяйства и главному врачу района (города).

Индикация и идентификация вируса. Порядок проведения исследований: из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого) готовят по 4 мазка-отпечатки для ИФ и обнаружения телец Бабеша — Негри; с мозговой тканью ставят РДП; при отрицательных результатах ставят биопробу.

Обнаружение специфических телец-включений. Мазки-отпечатки окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматрива­ют в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша — Негри (при окраске по Селлерсу — четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплаз­ме, при окраске по Муромцеву — светло-фиолетовые с темно-синими включениями тельца Бабеша — Негри, чаще они расположены вне нервных клеток.

Наиболее характерная особенность телец Бабеша — Негри — их внутренняя структура, по­зволяющая абсолютно точно дифференцировать их. Внутри видны маленькие зернышки — базофильные зернистости темно-голубого, даже черного цвета величиной 0,2-0,5 мкм.

Диагностическая ценность обнаружения телец-включений для доказательства заражения ВБ общепризнана. Однако и у здоровых животных, в особенности у кошек и белых мышей, имеются образования, присутствие которых может вызвать диагностические затруднения. В отдельных случаях в мозге кошки можно с уверенностью дифференцировать подобные включения от телец Бабеша — Негри, и здесь рекомендуется воспользоваться методами иден­тификации, в особенности ИФ. Равным образом и у собак, погибших в результате отравле­ния змеиным ядом или поражения электрическим током, можно найти тельца-включения, напоминающие тельца Бабеша – Негри. Тельца Бабеша — Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом, и материал исследу­ется в других тестах (ИФ, РДП, биопроба).

ИФ. Один из основных тестов при диагностике Б. При высококвалифицированном вы­полнении получают в 99-100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюоресцирующего Ig. Фиксацию препаратов в охлажденном (8-10°С) ацетоне проводят не менее 4-х ч. В качестве отрицательного контроля используют мазки-отпечатки головного мозга здоровых белых мышей. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микро­скопе на основе оценки интенсивности свечения комплекса АГ-АТ. АГ ВБ выявляется в ви­де ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаружи­вают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек, В контроле подобного свечения не должно быть.

Для доказательства специфичности свечения комплекса АГ-АТ используют метод по­давления ИФ, который заключается в способности рабического АГ, связанного с нефлюоресцирующими AT, вторично не вступать в соединение с флюоресцирующими специфиче­скими AT. Для этого на фиксированные препараты, приготовленные из исследуемого голов­ного мозга, наносят 5%-ный антирабический нефлюоресцирующий Ig, выдерживают 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают физраствором, а затем окрашивают флюоресци­рующим антирабическим Ig общепринятым прямым методом. В обработанных таким обра­зом препаратах флюоресценции не должно быть.

Метод ИФ дает возможность обнаруживать ВБ в клетках роговицы глаз и предвари­тельно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического её проявления. Метод может быть использован для исследования по­дозреваемых в заболевании Б животных, а также клинически здоровых собак и кошек, по­кусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все прави­ла личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. Нужно следить, чтобы животное не моргало третьим ве­ком, так как со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Для кон­троля аналогичным образом готовят отпечатки роговицы от здоровых животных. Их можно приготовить в хозяйстве. Отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в тече­ние 4 ч при 4°С, упаковывают и отправляют в лабораторию. Окрашивают препараты, как при ИФ, по общепринятой методике.

В препаратах, полученных от больных животных или находящихся в конце инкубаци­онного периода болезни, в цитоплазме многих эпителиальных клеток наблюдаются разной формы ярко светящиеся гранулы разного размера — от пылевидных точек до 2 мкм и более. С целью получения достоверных результатов в каждом препарате просматривают по 50-100 клеток, а всего от животного — не менее 200-400 клеток. Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более кле­ток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здо­ровых животных (контроль), вследствие аутофлюоресценции, могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками.

Важно отметить, что ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постанов­ке диагноза путем биопробы, поскольку диагноз при Б может быть установлен только на 4-8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубационный период забо­левания мышей может достигать и 20 дн. ИФ может выявлять ВБ в тканях подчелюстной слюнной железы. Из подчелюстных слюнных желез готовят препараты-мазки, беря матери­ал не менее чем из 6 разных участков железы, так как распределение в ней вируса нерав­номерно. Часто, чтобы получить отпечаток, приходится делать сильный нажим, поскольку из-за обилия муцина на стекле остается мало материала.

Показана возможность идентификации ВБ в коже методом ИФ, С этой целью берут пробы кожи головы, а также фолликулы сенсорных и тактильных волос морды или лате­ральных сенсорных сосочков (на щеке собаки). Пробы хранят при -20 или -70°С. Из них де­лают криосрезы, которые обрабатывают флюоресцирующим глобулином. Результаты ИФ анализа, полученные при идентификации ВБ в коже, в высокой степени коррелируют с дан­ными, полученными при исследовании мозга того же животного. Показана близкая корре­ляция между обнаружением АГ вируса в пробах мозга и тканях губы методом ИФ.

РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге жи­вотных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микро­методом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой ме­тодике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А — аммонов рог (правая сторона); В — кора головного мозга (правая сторона); С — мозжечок (правая сторона);
Д — продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) — положительный контроль; — (минус) — отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 — лунки с разведе­нием специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно

Из каждого отдела головного мозга с помощью пинцета готовят гомогенную пастооб­разную массу, которую и помещают в соответствующие лунки. От мышей исследуют весь головной мозг. Из отделов головного мозга левой стороны готовят АГ аналогичным образом ( на каждую экспертизу в общей сложности требуется 4 предметных стекла с агаровьм ге­лем). Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии 1 или 2-3 линий преципитации между лунками, содержащими АГ и иммуноглобулин, реакцию считают положительной.

РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного АГ в ис­следуемом материале составляет 45-70. При исследовании головного мозга мышей, полу­ченного при положительной биопробе, РДП выявляет до 100% случаев. Отсутствие в иссле­дуемом материале телец Бабеша — Негри, специфической флюоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышах с последующей идентификацией вируса.

Биопроба. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша — Негри, ИФ и др. Однако и она в отдельных случаях оказыва­лась отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза Б путем обнаружения телец-включении и ИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался от 1,3 до 12.

Сведения о различной эффективности биопробы могут быть объяснены рядом факторов: выбора экспериментального животного, количества их в опыте, способа заражения, способа и срока хранения материала до поступления в лабораторию. Может играть роль и явление интерференции инфекционных частиц неактивными частицами, если для инокуляции ис­пользуют недостаточно разведенный материал.

В мозге и слюнных железах лисиц и скунсов, павших от бешенства, обнаружено вещество, ингибирующее инфекционность вируса, что не позволяет провести диагностику болезни у этих животных методом внутримозгового заражения мышей. Наличие ингибирующего вещества в исследуемом материале не препятствует выявлению вирусного АГ методом ИФ; для скун­сов и лисиц это самый чувствительный метод диагностики.

Из животных всех видов (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомячки), использованных для биопробы, многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам ВБ и менее опасны в работе. Сирийские хо­мячки по чувствительности не уступают мышам, но они менее доступны.

РСК. Выявление специфического АГ в РСК при диагностике бешенства применяется реже, чем другие методы. Из присланного для исследования мозга готовят АГ. Для этого мозговую ткань (особенно богаты АГ, связывающим комплемент, кусочки таламуса и стволового от­дела мозга) растирают в вероналовом буфере в соотношении 1:10 и оставляют при комнат­ной температуре на 1 ч, после чего суспензию инактивируют при 56°С в течение 5 ч. Такая обработка убивает вирус и снимает антикомплементарность мозговой ткани, не повреждая специфический АГ. Суспензию центрифугируют 15 мин при 3500 мин- 1 из надосадочной жидкости, которая представляет собой материал для исследования на наличие АГ, готовят 2-кратно возрастающие разведения от 1:2 до 1:64 и используют для исследования в РСК.

ИФА. В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства животных выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С 8-18 ч. Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ ВБ в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ным р-ром формалина с рН 5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.

В отличие от РН на мышах и в культуре клеток ИФА позволяет выявить AT у животных в течение нескольких часов, ИФА — наиболее перспективный лабораторный метод обнару­жения AT и индикации самого вируса. Экспресс-методом диагностики бешенства является тех­ника захвата и метод ИФ для выявления АГ ВВ. Доказано, что метод выявления АГ ВБ в парафинизированных срезах пероксидазо-антиперокисдазным методом значительно пре­восходит метод ИФА. В 1987 г. создан набор для быстрой энзимиммунодиагностики бешенства (RREID), приемлемый для эпидемиологических и лабораторных исследований.

РН. Используется редко. Рекомендуется модификация с разведением ВБ и постоянной дозы γ-глобулина. ИН 2 указывает на АГ специфичность выделенного вируса.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. С помощью монАТ к гликопротеинам ВБ селектированы АГ варианты, среди которых выделены фенотипически термола­бильные (авирулентные) варианты. При использовании 2-х групп монАТ показано, что штаммы дикования отличаются от шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA и «утиных» штаммов по АГ детерминантам. Изучение с помощью монАТ 7-ми штаммов, выделенных от больных Б людей, позволило выявить определенные отличия их от вакцинного штамма в отношении АГ детерминант.

Общепризнано, что AT отличия между дикими штаммами удается обнаружить, исполь­зуя монАТ против нуклеокапсидного AT N, которые реагируют с цитоплазматическими включениями зараженных вирусом клеток; против гликопротеина (G АГ), которые реаги­руют с мембранами инфицированных клеток, лизируют эти клетки в присутствии компле­мента и нейтрализуют вирус. В связи с возможной АГ вариабельностью поверхностного гликопротеина ВБ из различных географических зон в качестве протективного АГ исполь­зовали рибонуклеопротеин, характеризующийся консервативностью АГ структуры. Таким образом, не только G белок, но и РНП ВБ обладают протективной активностью.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Эти методы для бешенства нетипичны, поскольку используются только с целью проверки поствакцинального иммунитета. Для обнаружения и титрования поствакцинальных AT ис­пользуют РН, которую ставят общепринятым методом. В качестве АГ используют фиксиро­ванный ВБ. РН на клетках ВНК-21 была более чувствительной, чем непрямая ИФ при выяв­лении AT в сыворотках вакцинированных лис. Кроме того, предложены РТГА и ELISA.

РТГА. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за на­личия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым ВБ высокочувствите­лен, а главное, ГА АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувстви­тельностью. Для приготовления ГА АГ ВБ предложено использовать шт. Москва, выращен­ный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. ГА отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугирова­нием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой ГА активно­стью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 мес при рН 5-9.

Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную 2-кратную трипсинизацию гу­синых эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипси-низированных эритроцитов (лучше 10 7 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой р-р (рН 9) с добавле­нием 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом р-ре с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, оконча­тельный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 мин, а с эритроцитами 2-дн цыплят или макаки-резус — через 1-1,5 ч.

Разработан радиоиммунологический анализ, основанный на способности AT связы­ваться с меченым 125 1-АГ ВБ. Меченый IgG, выделенный из антирабической гипериммун­ной сыворотки, можно применять для обнаружения АГ ВБ твердофазным РИА. Лучшие ре­зультаты получены при использовании фосфатно-солевого р-ра (рН 6,0) с ионной силой 0,01 М и меченого IgG с активностью 200-250 тыс. имп./мин.

Твердофазный конкурентный РИА применим для выявления антирабических AT в сы­воротке и гибридомных супернатантах.

Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить болезнь Ауески, при кото­рой больные животные неагрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломие­лите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов ВБ, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в ПЦР сегмента гена N.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

По данным Роспотребнадзора, за январь-декабрь 2015 г. в Российской Федерации зарегистрировано 6 случаев инфицирования человека вирусом бешенства, что превышает показатели 2014 г. в два раза. Так же в стране зарегистрировано 3739 случаев заболеваемости животных, сообщает Центральная научно-методологическая ветеринарная лаборатория. Из них на долю диких животных, приходится 48,8%, собак и кошек – 37,9%, сельскохозяйственных животных – 12,4% эпизодов.

Полученные данные свидетельствуют о резком усугублении эпизоотической ситуации по бешенству, что заставляет обратить специалистов ветеринарной медицины усиленное внимание на данную проблему.

Наиболее действенным методом контроля бешенства среди животных является своевременная иммунопрофилактика и диагностика.

Возбудителем заболевания является вирус бешенства Rabies lyssavirus.

Family/ Семейство – Rhabdoviridae;

Species/ Вид — Rabies lyssavirus.

Методы лабораторной диагностики бешенства стандартизированы. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30-09-2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 г.

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства: метод флуоресцирующих антител (МФА); метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1); биопроба на белых мышах; метод иммуноферментного анализа (ИФА); реакция диффузионной преципитации (РДП).

Для диагностики используются:

1. Метод флуоресцирующих антител. Выявление антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.

Для выявления вирусного антигена в мазках-отпечатках мозга используют прямую и непрямую реакцию иммунофлюоресценции. Мазки фиксируют в холодном ацетоне в течение 8-10 ч при температуре 4° С и обрабатывают во влажной камере 30 мин. антирабический иммуноглобулин, меченым ФИТЦ, промывают фосфатным буфером, высушивают и исследуют в люминесцентном микроскопе. Антигены вируса наблюдается в виде зеленых гранул разной формы и величины. В случае отрицательного результата, требуется провести другие методы диагностики.

2. Метод выделения вируса в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131. Основан на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

Суспензированый пат. материал вносят в культуру клеток, оставляя лунки для контроля. Положительный контроль — суспензия мозга мыши со штаммом вируса бешенства CVS, отрицательный — суспензия мозга клинически здоровой мыши. Далее инкубируют во влажном CO₂ инкубаторе с содержанием 5 CO₂% при 37±1°С в течении 42-28ч. Высушивают, фиксируют в холодном ацетоне в течении 30 мин, вновь высушивают. Далее с добавлением ФАГ в рабочем разведении, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при 37±1°С в течении 30 мин. По окончании трехкратно промывают, погружая на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе. Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы с четкими краями.

3. Метод биопробы. Выделение вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.

Наиболее пригодными для заражения являются мыши-сосунки. Для постановки биопробы используют 15-20 животных. Заражение проводят под наркозом путем интрацеребрального введения 0,03 мл суспензии исследуемого материала. При наличии в исследуемом материале вируса бешенства у мышей возникает тремор мышц, параличи. В большинстве случаев животные погибают в течение пяти дней. Наличие вируса бешенства в зараженных и погибших мышах необходимо подтвердить с помощью прямой реакции иммунофлуоресценции или обнаружения телец Бабеша-Негри. Идентификацию обнаруженного вируса бешенства проводят также с помощью реакции нейтрализации на белых мышах.

4. Метод иммуноферментного анализа. (ELISA) Основан на специфическом взаимодействии вирусного антигена с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго, меченного ферментом, антитела, путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

ИФА проводят в «сэндвич» варианте. На твердой фазе иммобилизуют гамма-глобулин. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положи­тельный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различ­ных разведениях. Инкубируют и отмывают. В лунки вносят антирабический пероксидазный коъюгат. После инкубации проводят отмывку. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении опти­мального окрашивания в лунках с положительным контролем. Отрицательный результат нуждается в подтверждении другими методами диагностики.

5. Реакция диффузионной преципитации. Метод, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый в виде линии преципитации.

Готовые разведения антирабической сыворотки вносят в приготовленные лунки в агаровом геле. Чашки Петри помещают в термостат при 37±1°С на 48 часов. Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-гло­булин. Отрицательный результат подтверждается другими методами.

Принимая во внимание высокую опасность болезни, обусловленную полной летальностью, специалисту ветеринарной медицины нужно знать, что окончательный диагноз может быть поставлен только методами лабораторной диагностики. Поэтому трудно переоценить значимость вышеперечисленных методов для практической ветеринарной медицины.

Библиографический список

Гайсаров, М.С. Эпизоотологическая характеристика бешенства животных в Республике Башкортостан, профилактика и меры борьбы с ним [Текст] : автореферат дис. канд. биол. наук : 16.00.03 / Гайсаров М. С.; Башкирский ГАУ. — Уфа : [б. и.], 2009. с. 18-19

Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза [Текст] / А.М. Гулюкин // М.:Вопросы вирусологии № 3, 2014 г. — с. 5-10.

Масимов, Н.А. Инфекционные болезни собак и кошек. [Электронный ресурс] / Н.А. Масимов, С.И. Лебедько. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2009. — 128 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/book/256

Методы лабораторной диагностики бешенства. [Текст] : ГОСТ 26075-2013 — Введ. 2015-01-01. — М.: Госстандарт России, 2013. — 19с.

источник

Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа

РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» КН МОН РК, пгт. Гвардейский, Кордайский район, Жамбылская область, Республика Казахстан

Разработана тест-система и оптимизированы условия её постановки для выявления антигенов вируса бешенства на основе сэндвич метода твердофазного иммуноферментного анализа. Приведены результаты, свидетельствующие о достаточно высокой специфичности и чувствительности тест-системы, что позволяет предложить его для рутинной диагностики бешенства в качестве альтернативы импортным диагностикумам.

Ключевые слова: бешенство, вирус, антиген, иммуноглобулин, ТФ-ИФА, тест-система, сыворотка, конъюгат.

Восприимчивость к заболеванию всех видов домашних и диких животных, огромная опасность для человека определяют социальное и экономическое значение бешенства, и привлекает к нему пристальное внимание ветеринарной, медицинской науки и практики [1].

В большинстве регионов Казахстана эпизоотическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна — резко активизировались природные очаги этой инфекции, увеличилось число случаев заболеваний среди различных видов животных, ежегодно регистрируются случаи заболеваний людей с летальным исходом [2, 3]. Несмотря на проводимые мероприятия, в Республике Казахстан ограничить распространение рабической болезни и полностью ликвидировать бешенство животных до сих пор не удается.

Значимое место в борьбе с бешенством принадлежит экспресс диагностике, которая служит основанием необходимости проведения лечебно-профилактических и противоэпизоотических мероприятий. Для диагностики и выявления возбудителя бешенства разработаны и предлагаются различные методы: морфологическое исследование, реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП), метод иммунофлуоресценции, биологическая проба на лабораторных животных [4]. Среди тестов для ускоренной лабораторной диагностики бешенства животных интенсивно развивается метод иммуноферментного анализа. Явными преимуществами этого теста являются простота и быстрота выполнения, высокая чувствительность, стабильность реагентов, возможность количественного учета реакции, обработки большого количества проб, автоматизации процесса и объективность инструментального учета результатов [5]. Специфичность и чувствительность иммуноферментного теста для диагностики бешенства зависит от качества используемых иммунореагентов, оптимизации постановки теста и подтверждается способностью выявлять локальные предоминантные варианты вируса [6].

До настоящего времени использование данного теста в Республике Казахстан ограничено в связи с отсутствием коммерческих отечественных тест-систем для диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа и высокой стоимостью импортных диагностикумов. Разработка и внедрение данного теста позволит проводить активный надзорза бешенством, результаты которого позволят адекватно оценить масштабы распространения данного заболевания на территории Республики Казахстан и своевременно принять научно-обоснованные противоэпизоотические и противоэпидемиологические мероприятия.

Целью настоящей работы являетсяразработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом ТФ-ИФА.

В качестве доноров антирабических антител были использованы козы и ослы. Для гипериммунизации использовали антиген, приготовленный из мозга животных, лабораторно зараженных вирусом бешенства штамм «Овечий» с использованием метода описанного Slonim О. etal [7]. Гипериммунизацию осуществляли с использованием схемы, описанной Luekrajang T. Etal [8] с соблюдением видоидентичности антигенов и вида продуцентов. Для выделения иммуноглобулинов использовали антирабические сыворотки с активностью в РДП не ниже 1:64. Иммуноглобулины выделяли спиртовым фракционированием по методу Кона [9], вирусоспецифические конъюгаты получали по модифицированному методу Wilson и Nakane[10], с использованием пероксидазы хрена фирмы «Sigma» (USA) тип VI-А.

Специфичность и активность антирабических сывороток и иммуноглобулинов оценивали в РДП с использованием антигенов из тест-системы для лабораторной диагностики бешенства в реакции диффузионной преципитации СТ ДГП 4-2009(НИИПББ, РК) и набора компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации (ВНИТИБП, РФ). Постановку реакции осуществляли по общепринятой методике.

Оптимальную сенсибилизирующую дозу иммуноглобулинов определяли в серии опытов «шахматного титрования» препаратов специфического и нормального антигенов против препаратов пероксидазных коньюгатов на планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином в разведениях с 1:100 до 1:600. Определяли средние величины (коэффициент позитивности) P/N, где Р и N — показатели оптической плотности положительной и отрицательной контрольной сывороток. Чем выше данный показатель, тем эффективнее идет процесс адсорбции. Оптимальные временные и температурные взаимодействия компонентов реакции: сенсибилизации лунок планшета специфическим иммуноглобулином, контакт антигена с иммуносорбентом и контакт антигена с коньюгатом проводили при 37°С, 30÷180 мин. Подбирали оптимальное рабочее разведение коньюгатов иммуноглобулинов (1:200÷1:1000), дающее максимальную цветовую реакцию при внесении их в планшеты с иммобилизированным на иммуносорбенте антигеном. Для выбора оптимальной твердой фазы испытывали полистироловые планшеты фирм «Costar» (USA), «Медполимер»(РФ), «Aptaca» (Италия), «Kohinoor» (Чехия), Nunc (Дания).

Учет результатов теста ТФ-ИФА проводили на фотометре марки «MultiskanPlus» при длине волны 405 нм (для АБТС) по отношению оптической плотности испытуемой сыворотки к оптической плотности нормальной сыворотки. Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемой сыворотки в 2 и более раза превышала оптическую плотность нормальной сыворотки и была не ниже 0,15.

Для проверки специфичности тест-системы ТФ-ИФА использовали культуральные и тканевые антигены вакцинных штаммов «Овечий», «МПТ-НИСХИ», «VRC-RZ2», «РВ-97», «ТС-80», локальных полевых изолятов«РАШТ», «РТ 001-07», «SVR-S1-2008», «SVR-B1-2007», «SVR-F1-2011», нормальные тканевые антигены (мыши, кролика, собаки, кошки, овцы, козы, КРС), нормальные культуральные антигены (ВНК-21, ПС, Vero), гетерогенные антигены (вируса болезни Ауески, чумы плотоядных, чумы мелких жвачных животных, катаральной лихорадке овец, листериоза).

Историческая диагностика, основанная на обнаружении телец Бабеша-Негри в инфицированном мозгу, уступила свое место более чувствительным методам иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа. Несмотря на то, что до настоящего времени МФА является «золотым стандартом» в диагностике бешенства [6], данный метод имеет ряд недостатков, связанных с необходимостью использования для учета результатов люминесцентного микроскопа, подавления неспецифического свечения в патологически измененных тканях, возможностью исследования только проб свежего мозга, а также отсутствием количественной оценки теста [11].

Не уступая чувствительности и специфичности МФА, методы иммуноферментного анализа лишены выше перечисленных недостатков и к настоящему времени находят все большее применение в рутиной диагностики бешенства во многих странах мира [12]. Из всего многообразия известных на сегодняшний день различных вариантов ИФА, отличающихся по характеру используемых реагентов и последовательности отдельных этапов, для решения поставленной задачи нами был выбран двухцентровый метод ТФ ИФА. Высокая корреляция результатов сэндвич варианта ТФ-ИФА с результатами классической биопробы и МФА, а также возможность выявлять антиген вируса в пробах любой степени разложения и вне зависимости от использованных консервантов и фиксаторов делает этот тест идеальным, как в качестве самостоятельного метода диагностики, так и в сочетании с вышеописанными методами.

По данным разных авторов, порог данного теста варьирует в пределах 2-3lg МЛД50/мл [13]. Чувствительность метода может быть повышена использованием тестов на основе моноклинальных антител (МА), но для целей идентификации возбудителя болезни имеется необходимость использовать панели антинуклеокансидных и антигликопротеиновых МА на различные антигенные варианты вируса. Поэтому для диагностики бешенства наибольшее распространение получили наборы препаратов на основе поликлональных антител, поскольку данные антитела позволяют выявлять не только уникальные эпитопы, но и общие антигенные детерминанты антигенов вируса бешенства, тем самым повышая результативность реакции.

Важными критериями чувствительности, специфичности и воспроизводимости теста является активность, специфичность конъюгатов антител. А качество конъюгатов, в свою очередь, зависит от активности, специфичности и чистоты применяемых для конъюгации иммуноглобулинов или антител.

С этой целью нами была разработана схема получения гипериммунной антирабической сыворотки крови коз и ослов, которая позволила получить иммуноглобулины с титром преципитирующих анти:64÷1:128. В результате электрофореза в ПААГ препаратов иммуноглобулинов выявлены профили, соответствующие легким и тяжелым цепям иммуноглобулинов G класса и слабовыраженные профили белков других классов, что свидетельствует о достаточной чистоте полученных препаратов. На основе выделенных иммуноглобулинов был приготовлен иммунопероксидазный конъюгат.

Поскольку чувствительность ИФА зависит от целого ряда физико-химических факторов (температура, ионная сила и рН реакционной среды, концентрационные соотношения компонентов и продолжительность их взаимодействия), при конструировании тест-систем на основе полученных препаратов использовали эмпирический подбор оптимальных параметров постановки теста.

Конструирование иммуноферментного диагностикума включало поиск оптимальных параметров тест-системы, от которых зависят чувствительность и специфичность проводимой реакции. Важным фактором в разработке тест-системы являлось определение условий адсорбции на твердой фазе, т. е. установление оптимальной концентрации иммуноглобулиновой фракции антирабических антител, состава сенсибилизирующего буфера, условий отмывания не связавшихся компонентов, времени и температуры связывания иммуноглобулинов с поверхностью лунок полистироловых планшетов, рабочей дозы приготовленного специфического конъюгата антител с пероксидазой.

Для подбора оптимальных условий сорбции оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при различных концентрациях иммуноглобулинов в растворе. Недостаток антител приводит к снижению чувствительности теста, а избыток к перерасходу дорогостоящего реагента. На достоверность результатов ИФА оказывает влияние неспецифическое связывание реагентов со свободными сайтами полистироловых планшет. В наших экспериментах мы испытывали различные количества антител в интервале 1÷20 мкг/мл (разведение иммуноглобулина 1:50 ÷ 1:600). Процесс адсорбции антител оценивали по интенсивности реакции с контрольными специфическими и негативными сыворотками. Наиболее оптимальный уровень насыщения поверхности планшет достигался при концентрации белка, равной 5 мкг/мл (1:200), при этом антитела с нормальными сыворотками реагировала отрицательно, а показатель позитивности составлял 4,5. При других испытанных концентрациях антител коэффициент позитивности варьировал от 3,0-4,2.

С целью снижения неспецифической реакции были проведены исследования по уменьшению фоновых «помех» при использовании различных концентраций бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буферном растворе для антигенов, конъюгата, и в качестве промывочного раствора. Были испытаны концентрации БСА 0,1, 0,5, 1, 2%. Исследования, проведенные в этом направлении, позволили установить, что блокирование свободных центров связывания на планшете целесообразно проводить 1% раствором БСА на фосфатно-солевом буфере рН 7,4 с добавлением 0,05% Твин-20, поскольку использование БСА в буфере уменьшало фоновые «помехи», на что указывали максимальные значения показателя позитивности, которые соответствовали для концентрации 0,1% — 3,8; 0,5% — 4,0; 1% — 4,6; 2% — 4,2, тогда как без использования БСА этот показатель равнялся 3,0. На основании этих данных в последующих исследованиях блокирование осуществляли 1%-ным раствором БСА в буферном растворе.

Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является рН комплексирующего буфера. Полистироловые планшеты сенсибилизировали антителами к антигенам вируса бешенства в буферных растворах с рН от 4,0 до 10,0: ацетатном, фосфатном и карбонат-бикарбонатном. На основании анализа результатов проведенных исследований было установлено, что при рН 9,6 0,1М карбонат-бикарбонатного буфера обеспечивался самый высокий уровень адсорбции поликлональных антител к антигенам вируса бешенства на поверхности полистироловых планшет.

Следующим этапом наших исследований стало изучение влияния температуры и времени экспозиции на адсорбцию антител к антигенам вируса бешенства в лунках планшета. Анализ результатов проведенных исследований позволил установить, что оптимальным для сенсибилизации лунок планшета иммуноглобулинами является режим при температуре 4°С в течение 24 ч. или в течение 18 ч. при температуре 20°С (коэффициент позитивности равен 4,5-5,0), в то время как при 37°С и выдержке в 1 ч. адсорбционная способность иммуноглобулинов несколько ниже (коэффициент позитивности около 4,4).

Для определения оптимального уровня активности полученных конъюгатов при проведении ИФА подбирали оптимальное рабочее разведение, дающее максимальную цветовую реакцию при внесении их в полистироловые планшеты. Было установлено, что при рабочем разведении 1:600 коэффициент позитивности составил 6,0 против 4,8-5,2 при разведениях 1:1000-1:800. При изменении концентрации в диапазоне 1:400-1:200 существенной разницы в значениях коэффициента позитивности отмечено не было. Данный факт свидетельствует о насыщении сорбционной емкости планшета конъюгатом, начиная с разведения 1:600.

Для определения оптимальной продолжительности инкубации антигена в твердофазном методе ИФА оценивали интенсивность реакции по коэффициенту позитивности в зависимости от времени инкубирования (15, 30, 60, 90 минут) при температуре 37°С.

Результаты проведенных нами исследований позволили установить, что 60-минутная экспозиция при температуре 37°С является оптимальным временем инкубации рабического антигена с адсорбированными иммуноглобулинами при постановке ИФА, поскольку установлено, что коэффициент позитивности в диапазоне от 15 до 60 мин возрастал с 5,4 до 6,4, а далее стабилизировался.

Оптимальнымиусловиями инкубирования пероксидазного конъюгата с антигеном на иммуносорбенте, являлись 40-60 мин, при 37°С. Увеличение коэффициента позитивности в данном случае происходило по мере увеличения срока инкубации. Однако разница в величине данного показателя при 40; 60; 90 и 120 мин. экспозицией оказалась незначительной.

При оптимизации условий постановки ТФ-ИФА также осуществлены испытания сорбционных свойств твердой фазы, в качестве которых использовались 96-луночные планшеты для ИФА. С этой целью проводили титрацию положительного антигена в планшетах различных производителей. В результате установлено, что максимальной способностью сорбировать рабический антиген и однородностью сорбции (вариации 4-5%) обладают планшеты фирмы Nunc (Maxisorb) и планшеты фирмы Costar. Другие испытанные планшеты обладали меньшей сорбционной способностью и однородностью сорбции (вариации 4-15%). В связи с этим для дальнейших экспериментов выбраны планшеты Nunc, Costar, позволяющие достигать более высокую чувствительность и стандартность анализа.

Изучение влияния растворов для разбавления специфических компонентов показало, что применение для разбавления антигенов ФБС (0,01М), NaCl (0,15М) или физиологического раствора показывает сравнительно равные результаты по чувствительности и специфичности метода ИФА.

С использованием полученных оптимальных параметров постановки теста были проведены испытания специфичности и чувствительности ТФ-ИФА. Результаты специфичности ТФ-ИФАпредставлены в таблице.

Результаты специфичности тест-системы ТФ-ИФА

для выявления антигенов вируса бешенства

источник