Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.
Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.
Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.
Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.
Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.
Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.
Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.
Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.
Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.
Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:
а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.
Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.
Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.
Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов
Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.
Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).
Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.
В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.
Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.
При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.
Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).
Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.
Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.
Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.
Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.
Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.
Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.
Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.
ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.
Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.
Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.
В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.
Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.
Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).
Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».
Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.
Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.
По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.
Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).
Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).
источник
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 — 92 «Межгосударственная система стандартизации. Основ* ныв положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки. принятия, применения, обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. № 57-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166)004-97
Код страны no МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 год
Информация об изменениях х настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Методы лабораторной диагностики бешенства
Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies
Дата введения — 2015 — 01 — 01
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:
• метод флуоресцирующих антител (МФА);
• метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1);
— метод иммукоферментного анализа (ИФА);
• реакция диффузионной преципитации (РДП).
1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavwus.
2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).
3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест- систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ ИСО/МЭК 17025 — 2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 12.0.004 — 90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.005-68 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.008 — 76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.4.011 — 89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 17.0.0.01 — 76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения
ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия ГОСТ 2603 — 79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 2768 — 84 Ацетон технический. Технические условия ГОСТ 4204 — 77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 6709 — 72 Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ ISO 7218 — 2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 8074 — 82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.
ГОСТ 9147 — 80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрелзратое. Технические условия ГОСТ 12026 — 76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 21241-69 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.
ГОСТ 22967 — 90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 24661 — 91 (ИСО 7866 84) Шприцы инъекционные однократного применения
ГОСТ 25046 — 81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 25336 — 82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29230 — 91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и ло выпускам ежемесячного информационного указателя «На-циональные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабДовирус), и приводящее к летальному исходу в 100 % случаев.
3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.
3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.
3.1.2 метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеиниэотиоциаиатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.
3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства. основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.
3.1.3 биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.
3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства. основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.
3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.
3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
ФАГ- флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин;
АнГ- антирабический глобулин;
КФГ — контрольный флуоресцирующий глобулин;
ФБР — фосфатно-буферный раствор;
НГУК-1-невринома Гассерова узла крысы;
РНК — рибонуклеиновая кислота:
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота:
ССЫ31 — культура клеток мышиной нейробластомы:
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами I — II групп патогенности — ло ГОСТ ISO 7218.
4.1.2 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.
4.1.3 Требования к персоналу — по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК 17025. (1).
К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами I — II групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ. вакцинированные против бешенства.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ согласно ГОСТ 12.1.008.
4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.
4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.5 Утилизацию полученного для исследования материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 15 мин при давлении (0.11 ± 0.20) МПа.
5.1 Для проведения исследований используют:
• спектрофотометр сканирующий со спектральным диапазоном измерения длин волн от 190 до 1100 нм с погрешностью не более ± 0,5 нм и диапазоном измерения оптической плотности (ОП) от 0.1 до 3.0;
• планшеты для иммунологических реакций 96-луночные:
• термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 ‘-С до 50 °С:
• холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от О °С до 10 °С по ГОСТ 16317:
— микроскоп люминесцентный инвертированный по ГОСТ 8074:
— ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147 или гомогенизатор по ГОСТ ИСО/МЭК 17025;
• стекла предметные по ГОСТ 9284:
• пробирки стеклянные по ГОСТ 25336;
— чашки Петри по ГОСТ 25336;
• пипетки вместимостью 1.0; 2,0 и 10.0 см 3 по ГОСТ 29230;
• пипетки автоматические вместимостью от 0,05 до 0,20 см 3 с наконечниками:
• пинцеты медицинские по ГОСТ 21241:
— шприцы инсулиновые вместимостью 1,0 см 3 по ГОСТ 22967 или ГОСТ 24861;
• иглы инъекционные ло ГОСТ 25046:
• стекла культуральные на восемь лунок;
• клетки для содержания мышей;
• ацетон по ГОСТ 2603 или ГОСТ 2768;
• флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ);
— антирабический глобулин (АнГ);
— контрольный флуоресцирующий глобулин (КФГ);
• масло нефлуоресцирующее иммерсионное ло ГОСТ 13739;
— воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
• раствор фосфатно-буферный молярной концентрации 0.01моль/дм 3 (ФБР). pH 7,2 — 7.4;
• культуру клеток мышиной нейробластомы ССЫ31 или неериномы Гассерова узла крысы —
— среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (ДМЕМ), pH 7,2;
• сыворотку эмбриональную крови крупного рогатого скота для культур клеток 10 %-ную;
• перекись водорода 3 %-ную по ГОСТ 177;
• набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА;
• раствор серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 по ГОСТ 4204;
• бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
• штамп для приготовления лунок;
• агар «Дифко» или аналогичный;
• раствор метилового оранжевого 1 %-ный в 50 %-ном этиловом спирте:
— антигены положительный и отрицательный;
• сыворотку антирабическую или иммуноглобулин;
— мышей белых клинически здоровых массой 6 — 8 г.
5.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше. Допускается использование посуды одноразового применения.
6.1 Для проведения исследований на наличие вируса бешенства в лабораторию направляют патологический материал — свежий труп или голову мелких животных, голову или головной мозг крупных животных.
6.2 Отобранный для исследований патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в металлических контейнерах. Замороженный материал помещают в криоконтейнер.
6.3 Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные; наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-элиэоотологические данные.
6.4 Пабораторные исследования проводят сразу же при получении патологического материала.
6.5 Для исследования отбирают от крупных животных кусочки ткани из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кору больших полушарий, продолговатый мозг) размером 0.5 — 1.0 см. мозг мелких животных, например мышей, исследуют целиком.
Для исследования МФА и методом выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) пригодны только свежие или свежезамороженные пробы ткани головного мозга. Не допускаются для исследований пробы мозга животных, разлагающиеся (в стадии загнивания), консервированные глицерином, фиксированные метиловым спиртом, формалином или другими средствами, способствующими возникновению неслецифической флуоресценции.
Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30 % -50 %*ном растворе глицерина. Использование других консервантов не допускается. Для сохранности патологический материал может быть заморожен при температуре не выше минус 10 в С.
Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс «антиген-антитело», меченный ФИТЦ. обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.
7.2 Подготовка к исследованию
7.2.1.1 Из кусочков ткани, отобранных по 6.5, готовят не менее трех препаратов (отпечатков или мазков) из каждого отдела мозга на тщательно обезжиренных предметных стеклах. Если состояние патолсгического материала позволяет, то готовят отпечатки, в остальных случаях делают мазки.
7.2.1.2 Приготовление отпечатков
Кусочки ткани, отобранные по 6.5. кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре -шесть слоев. Мозг мелких животных разрезают поперек, захватывая все его отделы, и кладут его пиниетом срезом вверх на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре — шесть слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом, слегка надавливая его до получения на стекле тонкого отпечатка.
7.2.1.3 Приготовление мазков
Кусочек ткани из каждого отдела мозга (у мелких животных весь мозг целиком), отобранный по 6.5. растирают в фарфоровой ступке пестиком до образования гомогенной массы, из которой делают мазки на предметных стеклах.
7.2.1.4 Для контроля делают мазки или отпечатки из мозга здоровых, не болевших бешенством и не вакцинированных против бешенства, белых мышей, какописано в 7.3.1.2 и 7.3.1.3.
7.2.1.5 После приготовления мазки или отпечатки высушивают на воздухе в течение 20-30 мин. фиксируют в охлажденном ацетоне при температуре 4’Св течение 4 — 12 ч или при температуре минус 20 *С в течение 1 ч. после чего извлекают из ацетона и высушивают на воздухе в течение 10 — 15 мж.
ФАГ. АнГ и КФГ растворяют дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Срок хранения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ при температуре (5 ± 2) в С — не более двух недель.
Непосредственно для исследования необходимое количество растворенных ФАГ. АнГ и КФГ разводят ФБР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Рабочие разведения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ используют в день приготовления.
7.3 Проведение исследования
Предметные стекла с препаратами (мазками или отпечатками) по 7.2.1 помещают во влажную камеру (чашку Петри или кювету с увлажненным дном). Затем на один из трех приготовленных препаратов наносят ФАГ в рабочем разведении равномерно на всю поверхность мазка или отпечатка при помощи пипетки. На второй препарат наносят рабочее разведение КФГ. Закрывают камеру с препаратами. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30
мин. Параллельно окрашивают контрольные препараты. По окончании окрашивания препараты трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20 — 30 мин.
На третий препарат наносят рабочее разведение АнГ. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30 мин. Затем препарат трехкратно промывают, погружая каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе в течение 20 — 30 мин и окрашивают рабочим разведением ФАГ. как описано выше.
На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.
8 окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым. серовато-желтым цветом.
Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины — от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15 — 20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.
Диагноз бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желтовато-зеленые гранулы. При этом в контрольных препаратах (в мазках или отпечатках из мозга здоровых не болевших бешенством белых мышей, окрашенных ФАГ), а также в исследуемых препаратах, окрашенных КФГ и предварительно обработанных АнГ и окрашенных ФАГ. подобных образований быть не должно.
О результатах исследования сообщают компетентным органам в соответствии с порядком, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
8 случае отрицательного результата проводят исследования по 8 или 9.
8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1)
нейробластомы CCL-131 или НГУК-1 с последующей его идентификацией методом флуоресцирующих антител.
Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.
8.2 Подготовка к исследованию
Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого животного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5. измельчают ножницами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0.9 %-ный изотонический раствор натрия хлорида до получения 10 %-ной суспензии. В суспензию мозга добавляют пенициллин и стрептомицин по ЮС ЕД/см 3 и 1 мг/см 3 соответственно.
Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Над осадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при температуре не выше 4 °С до использования.
8.2.2 Подготовка культуральных стекол
Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культурального флакона при помощи 0,25 %-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10 %-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3 %-ным глютамином до концентрации 2 * 10 s клеток/см 3 . В лунки культурального стекла вносят по 0.1 см 3 полученной суспензии клеток, накрывают крышкой и помещают во влажный СОг-инкубатор с содержанием СОг 5 % при температуре (37±1)°С на 18-20ч
8.3 Проведение исследования
В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0.05 см 3 суспензии из каждого отдела головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом бешенства — штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный СОг-инкубатор с содержанием СОг 5 % при температуре (37 ± 1) *С на 42 — 48 ч.
По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0.2 см 3 раствора е каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 — 30 мин. Затем в каждую лунку вносят по 0.1 см 3 охлажденного до температуры минус 20 *С ацетона и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.
После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 — 30 мин. С помощью скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В каждую лунку добавляют по 0.05 — 0.10 см 3 ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем), приготовленном в ФБР. помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37 ± 1) в С в течение 30 мин.
По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.
На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.
В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым. серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).
Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.
Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.
Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.
Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител по 7.
9.2 Подготовка проб к исследованию — по 6.2.1.
9.3 Проведение исследования
Пять — шесть белых мышей заражают 10 %*ной суспензией патологического материала им-трацеребрально в объеме 0.02 — 0,03 см 3 . Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на ко* торую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30 дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.
При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взьерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.
Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включе* кия вируса бешенства.
Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми.
Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.
8 основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антиге* лом. иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго антирабического антитела, меченного пероксидазой. продукт реакции которой окрашивается при до* бавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количеству антигена.
10.2 Подготовка к исследованию
10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально зараженных вирусом бешенства животных.
10.2.2 Приготовление исследуемого антигена
Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят 10 %*ные суспензии в С.9 %-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной бане при температуре 60 *С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.
10.2.3 Подготовка реагентов
все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22 ± 1) *С.
Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.
10.3 Проведение исследования
10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.
Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.
Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет
10.3.2 Сенсибилизация планшета
6 лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 3 ч или при температуре 4 *С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхивают. а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.
8 ряды планшета А. 8 и С вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные положительный (лунка А1) и отрицательный (лунка А2) антигены, входящие в состав набора, а также исследуемые пробы (лунки АЗ. А4 и тщ.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1 : 2 до 1 : 8. При большом количестве проб заполняют и другие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в гермостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 1 ч. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как описано в 10.3.2.
10.3.4 Внесение антирабического лероксидазного конъюгата
В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, после чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) в С в течение 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.
10.3.5 Внесение субстратной смеси
Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию проявляют в течение 15 — 30 мин при температуре (22 ± 0.5) *С в темноте. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 .
10.4 Обработка результатов
Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с инструкцией по применению набора.
Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД. то измерение оптической плотности проводят при 490 нм. если используют ТМБ. то при 450 км.
Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным антигеном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контрольным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.
При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специфичности Ксп. который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП«) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОПг). Реакцию считают положительной. если коэффициент специфичности более 2.1 и отрицательной, если менее 2.1.
ОП1 * 0,641, ОПг а 0,120, Ксп = 5,34 — реакция положительная или ОП1 = 0,180, ОПг в 0,120 Кс„ * 1,5 — реакция отрицательная.
В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 — 9.
Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.
11.2 Подготовка к исследованию
Подготовка проб к исследованию — по 8.2.1.
Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бактериальной микрофлорой.
Для приготовления агара смешивают 1.5 г агара «Дифко». 1 см 3 1 %-ного раствора метилового оранжевого в 50 %-ном этиловом спирте. 0.01 г мертиолята. 100 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по пробиркам, автоклавируют при давлении 0.5 атм в течение 30 мин и хранят в холодильнике при температуре 4 в С.
11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)
Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стекло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при комнатной температуре на 20 — 30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2.5 см 3 расплавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм. и оставляют на 20 — 30 мин. 8 застывшем слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4 — 5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.
Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10 — 15 см 3 расплавленного агара для получения слоя толщиной 2-3 мм.
11.3 Проведение исследования
Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки (иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1.0 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 1.0 см 3 антирабической сыворотки, получая разведение 1 : 2.
перемешивают, и переносят 1.0 см 3 смеси во вторую пробирку и т. д. Таким образом, получают четыре пробирки с разведениями 1 : 2.1 :4.1 : 8 и 1 :16.
8 приготовленные лунки вносят по 0.05 — 0,07 см 3 пробы мозга (каждую пробу в отдельную лунку), полученной по 8.2.1. и разведения антирабической сыворотки или иммуноглобулина (1 : 2; 1 : 4; 1 : 8:1 :16) согласно рисунку 1.
Рисунок 1 — Схема внесения материала
Ар — эммонов рог; Пм — продолговатый мозг; А+ — положительный контрольный антиген; М -мозжечок; К — кора больших полушарий; А- — отрицательный контрольный антиген.
возможно применение других схем внесения материала, но при этом обязательно использование положительного и отрицательного антигенов.
Предметные стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри с увлажненным дном или влажный эксикатор, а затем в термостат при температуре (37 ± 1) *С на 48 ч (чашки Петри накрывают крышкой и помещают в термостат).
Реакцию учитывают через 6. 24 и 48 ч.
11.4 Обработка результатов
Реакцию считают положительной при появлении даже одной линии преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими исследуемый материал и антирабическую сыворотку (иммуноглобулин).
При этом между положительным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) должна наблюдаться заметная линия преципитации, а между отрицательным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) линии преципитации быть не должно.
8 случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 -10.
[1] ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary UseУДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220
Ключевые слова: бешенство, диагностика, метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ, биопроба, реакция диффузионной преципитации
Подписано в печать 01.04.2014. Формат 60x84V
Уел. пвч. л. 1,40. Тираж 31 экэ. Зак. 1363.
Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта
источник
Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа
РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» КН МОН РК, пгт. Гвардейский, Кордайский район, Жамбылская область, Республика Казахстан
Разработана тест-система и оптимизированы условия её постановки для выявления антигенов вируса бешенства на основе сэндвич метода твердофазного иммуноферментного анализа. Приведены результаты, свидетельствующие о достаточно высокой специфичности и чувствительности тест-системы, что позволяет предложить его для рутинной диагностики бешенства в качестве альтернативы импортным диагностикумам.
Ключевые слова: бешенство, вирус, антиген, иммуноглобулин, ТФ-ИФА, тест-система, сыворотка, конъюгат.
Восприимчивость к заболеванию всех видов домашних и диких животных, огромная опасность для человека определяют социальное и экономическое значение бешенства, и привлекает к нему пристальное внимание ветеринарной, медицинской науки и практики [1].
В большинстве регионов Казахстана эпизоотическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна — резко активизировались природные очаги этой инфекции, увеличилось число случаев заболеваний среди различных видов животных, ежегодно регистрируются случаи заболеваний людей с летальным исходом [2, 3]. Несмотря на проводимые мероприятия, в Республике Казахстан ограничить распространение рабической болезни и полностью ликвидировать бешенство животных до сих пор не удается.
Значимое место в борьбе с бешенством принадлежит экспресс диагностике, которая служит основанием необходимости проведения лечебно-профилактических и противоэпизоотических мероприятий. Для диагностики и выявления возбудителя бешенства разработаны и предлагаются различные методы: морфологическое исследование, реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП), метод иммунофлуоресценции, биологическая проба на лабораторных животных [4]. Среди тестов для ускоренной лабораторной диагностики бешенства животных интенсивно развивается метод иммуноферментного анализа. Явными преимуществами этого теста являются простота и быстрота выполнения, высокая чувствительность, стабильность реагентов, возможность количественного учета реакции, обработки большого количества проб, автоматизации процесса и объективность инструментального учета результатов [5]. Специфичность и чувствительность иммуноферментного теста для диагностики бешенства зависит от качества используемых иммунореагентов, оптимизации постановки теста и подтверждается способностью выявлять локальные предоминантные варианты вируса [6].
До настоящего времени использование данного теста в Республике Казахстан ограничено в связи с отсутствием коммерческих отечественных тест-систем для диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа и высокой стоимостью импортных диагностикумов. Разработка и внедрение данного теста позволит проводить активный надзорза бешенством, результаты которого позволят адекватно оценить масштабы распространения данного заболевания на территории Республики Казахстан и своевременно принять научно-обоснованные противоэпизоотические и противоэпидемиологические мероприятия.
Целью настоящей работы являетсяразработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом ТФ-ИФА.
В качестве доноров антирабических антител были использованы козы и ослы. Для гипериммунизации использовали антиген, приготовленный из мозга животных, лабораторно зараженных вирусом бешенства штамм «Овечий» с использованием метода описанного Slonim О. etal [7]. Гипериммунизацию осуществляли с использованием схемы, описанной Luekrajang T. Etal [8] с соблюдением видоидентичности антигенов и вида продуцентов. Для выделения иммуноглобулинов использовали антирабические сыворотки с активностью в РДП не ниже 1:64. Иммуноглобулины выделяли спиртовым фракционированием по методу Кона [9], вирусоспецифические конъюгаты получали по модифицированному методу Wilson и Nakane[10], с использованием пероксидазы хрена фирмы «Sigma» (USA) тип VI-А.
Специфичность и активность антирабических сывороток и иммуноглобулинов оценивали в РДП с использованием антигенов из тест-системы для лабораторной диагностики бешенства в реакции диффузионной преципитации СТ ДГП 4-2009(НИИПББ, РК) и набора компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации (ВНИТИБП, РФ). Постановку реакции осуществляли по общепринятой методике.
Оптимальную сенсибилизирующую дозу иммуноглобулинов определяли в серии опытов «шахматного титрования» препаратов специфического и нормального антигенов против препаратов пероксидазных коньюгатов на планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином в разведениях с 1:100 до 1:600. Определяли средние величины (коэффициент позитивности) P/N, где Р и N — показатели оптической плотности положительной и отрицательной контрольной сывороток. Чем выше данный показатель, тем эффективнее идет процесс адсорбции. Оптимальные временные и температурные взаимодействия компонентов реакции: сенсибилизации лунок планшета специфическим иммуноглобулином, контакт антигена с иммуносорбентом и контакт антигена с коньюгатом проводили при 37°С, 30÷180 мин. Подбирали оптимальное рабочее разведение коньюгатов иммуноглобулинов (1:200÷1:1000), дающее максимальную цветовую реакцию при внесении их в планшеты с иммобилизированным на иммуносорбенте антигеном. Для выбора оптимальной твердой фазы испытывали полистироловые планшеты фирм «Costar» (USA), «Медполимер»(РФ), «Aptaca» (Италия), «Kohinoor» (Чехия), Nunc (Дания).
Учет результатов теста ТФ-ИФА проводили на фотометре марки «MultiskanPlus» при длине волны 405 нм (для АБТС) по отношению оптической плотности испытуемой сыворотки к оптической плотности нормальной сыворотки. Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемой сыворотки в 2 и более раза превышала оптическую плотность нормальной сыворотки и была не ниже 0,15.
Для проверки специфичности тест-системы ТФ-ИФА использовали культуральные и тканевые антигены вакцинных штаммов «Овечий», «МПТ-НИСХИ», «VRC-RZ2», «РВ-97», «ТС-80», локальных полевых изолятов«РАШТ», «РТ 001-07», «SVR-S1-2008», «SVR-B1-2007», «SVR-F1-2011», нормальные тканевые антигены (мыши, кролика, собаки, кошки, овцы, козы, КРС), нормальные культуральные антигены (ВНК-21, ПС, Vero), гетерогенные антигены (вируса болезни Ауески, чумы плотоядных, чумы мелких жвачных животных, катаральной лихорадке овец, листериоза).
Историческая диагностика, основанная на обнаружении телец Бабеша-Негри в инфицированном мозгу, уступила свое место более чувствительным методам иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа. Несмотря на то, что до настоящего времени МФА является «золотым стандартом» в диагностике бешенства [6], данный метод имеет ряд недостатков, связанных с необходимостью использования для учета результатов люминесцентного микроскопа, подавления неспецифического свечения в патологически измененных тканях, возможностью исследования только проб свежего мозга, а также отсутствием количественной оценки теста [11].
Не уступая чувствительности и специфичности МФА, методы иммуноферментного анализа лишены выше перечисленных недостатков и к настоящему времени находят все большее применение в рутиной диагностики бешенства во многих странах мира [12]. Из всего многообразия известных на сегодняшний день различных вариантов ИФА, отличающихся по характеру используемых реагентов и последовательности отдельных этапов, для решения поставленной задачи нами был выбран двухцентровый метод ТФ ИФА. Высокая корреляция результатов сэндвич варианта ТФ-ИФА с результатами классической биопробы и МФА, а также возможность выявлять антиген вируса в пробах любой степени разложения и вне зависимости от использованных консервантов и фиксаторов делает этот тест идеальным, как в качестве самостоятельного метода диагностики, так и в сочетании с вышеописанными методами.
По данным разных авторов, порог данного теста варьирует в пределах 2-3lg МЛД50/мл [13]. Чувствительность метода может быть повышена использованием тестов на основе моноклинальных антител (МА), но для целей идентификации возбудителя болезни имеется необходимость использовать панели антинуклеокансидных и антигликопротеиновых МА на различные антигенные варианты вируса. Поэтому для диагностики бешенства наибольшее распространение получили наборы препаратов на основе поликлональных антител, поскольку данные антитела позволяют выявлять не только уникальные эпитопы, но и общие антигенные детерминанты антигенов вируса бешенства, тем самым повышая результативность реакции.
Важными критериями чувствительности, специфичности и воспроизводимости теста является активность, специфичность конъюгатов антител. А качество конъюгатов, в свою очередь, зависит от активности, специфичности и чистоты применяемых для конъюгации иммуноглобулинов или антител.
С этой целью нами была разработана схема получения гипериммунной антирабической сыворотки крови коз и ослов, которая позволила получить иммуноглобулины с титром преципитирующих анти:64÷1:128. В результате электрофореза в ПААГ препаратов иммуноглобулинов выявлены профили, соответствующие легким и тяжелым цепям иммуноглобулинов G класса и слабовыраженные профили белков других классов, что свидетельствует о достаточной чистоте полученных препаратов. На основе выделенных иммуноглобулинов был приготовлен иммунопероксидазный конъюгат.
Поскольку чувствительность ИФА зависит от целого ряда физико-химических факторов (температура, ионная сила и рН реакционной среды, концентрационные соотношения компонентов и продолжительность их взаимодействия), при конструировании тест-систем на основе полученных препаратов использовали эмпирический подбор оптимальных параметров постановки теста.
Конструирование иммуноферментного диагностикума включало поиск оптимальных параметров тест-системы, от которых зависят чувствительность и специфичность проводимой реакции. Важным фактором в разработке тест-системы являлось определение условий адсорбции на твердой фазе, т. е. установление оптимальной концентрации иммуноглобулиновой фракции антирабических антител, состава сенсибилизирующего буфера, условий отмывания не связавшихся компонентов, времени и температуры связывания иммуноглобулинов с поверхностью лунок полистироловых планшетов, рабочей дозы приготовленного специфического конъюгата антител с пероксидазой.
Для подбора оптимальных условий сорбции оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при различных концентрациях иммуноглобулинов в растворе. Недостаток антител приводит к снижению чувствительности теста, а избыток к перерасходу дорогостоящего реагента. На достоверность результатов ИФА оказывает влияние неспецифическое связывание реагентов со свободными сайтами полистироловых планшет. В наших экспериментах мы испытывали различные количества антител в интервале 1÷20 мкг/мл (разведение иммуноглобулина 1:50 ÷ 1:600). Процесс адсорбции антител оценивали по интенсивности реакции с контрольными специфическими и негативными сыворотками. Наиболее оптимальный уровень насыщения поверхности планшет достигался при концентрации белка, равной 5 мкг/мл (1:200), при этом антитела с нормальными сыворотками реагировала отрицательно, а показатель позитивности составлял 4,5. При других испытанных концентрациях антител коэффициент позитивности варьировал от 3,0-4,2.
С целью снижения неспецифической реакции были проведены исследования по уменьшению фоновых «помех» при использовании различных концентраций бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буферном растворе для антигенов, конъюгата, и в качестве промывочного раствора. Были испытаны концентрации БСА 0,1, 0,5, 1, 2%. Исследования, проведенные в этом направлении, позволили установить, что блокирование свободных центров связывания на планшете целесообразно проводить 1% раствором БСА на фосфатно-солевом буфере рН 7,4 с добавлением 0,05% Твин-20, поскольку использование БСА в буфере уменьшало фоновые «помехи», на что указывали максимальные значения показателя позитивности, которые соответствовали для концентрации 0,1% — 3,8; 0,5% — 4,0; 1% — 4,6; 2% — 4,2, тогда как без использования БСА этот показатель равнялся 3,0. На основании этих данных в последующих исследованиях блокирование осуществляли 1%-ным раствором БСА в буферном растворе.
Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является рН комплексирующего буфера. Полистироловые планшеты сенсибилизировали антителами к антигенам вируса бешенства в буферных растворах с рН от 4,0 до 10,0: ацетатном, фосфатном и карбонат-бикарбонатном. На основании анализа результатов проведенных исследований было установлено, что при рН 9,6 0,1М карбонат-бикарбонатного буфера обеспечивался самый высокий уровень адсорбции поликлональных антител к антигенам вируса бешенства на поверхности полистироловых планшет.
Следующим этапом наших исследований стало изучение влияния температуры и времени экспозиции на адсорбцию антител к антигенам вируса бешенства в лунках планшета. Анализ результатов проведенных исследований позволил установить, что оптимальным для сенсибилизации лунок планшета иммуноглобулинами является режим при температуре 4°С в течение 24 ч. или в течение 18 ч. при температуре 20°С (коэффициент позитивности равен 4,5-5,0), в то время как при 37°С и выдержке в 1 ч. адсорбционная способность иммуноглобулинов несколько ниже (коэффициент позитивности около 4,4).
Для определения оптимального уровня активности полученных конъюгатов при проведении ИФА подбирали оптимальное рабочее разведение, дающее максимальную цветовую реакцию при внесении их в полистироловые планшеты. Было установлено, что при рабочем разведении 1:600 коэффициент позитивности составил 6,0 против 4,8-5,2 при разведениях 1:1000-1:800. При изменении концентрации в диапазоне 1:400-1:200 существенной разницы в значениях коэффициента позитивности отмечено не было. Данный факт свидетельствует о насыщении сорбционной емкости планшета конъюгатом, начиная с разведения 1:600.
Для определения оптимальной продолжительности инкубации антигена в твердофазном методе ИФА оценивали интенсивность реакции по коэффициенту позитивности в зависимости от времени инкубирования (15, 30, 60, 90 минут) при температуре 37°С.
Результаты проведенных нами исследований позволили установить, что 60-минутная экспозиция при температуре 37°С является оптимальным временем инкубации рабического антигена с адсорбированными иммуноглобулинами при постановке ИФА, поскольку установлено, что коэффициент позитивности в диапазоне от 15 до 60 мин возрастал с 5,4 до 6,4, а далее стабилизировался.
Оптимальнымиусловиями инкубирования пероксидазного конъюгата с антигеном на иммуносорбенте, являлись 40-60 мин, при 37°С. Увеличение коэффициента позитивности в данном случае происходило по мере увеличения срока инкубации. Однако разница в величине данного показателя при 40; 60; 90 и 120 мин. экспозицией оказалась незначительной.
При оптимизации условий постановки ТФ-ИФА также осуществлены испытания сорбционных свойств твердой фазы, в качестве которых использовались 96-луночные планшеты для ИФА. С этой целью проводили титрацию положительного антигена в планшетах различных производителей. В результате установлено, что максимальной способностью сорбировать рабический антиген и однородностью сорбции (вариации 4-5%) обладают планшеты фирмы Nunc (Maxisorb) и планшеты фирмы Costar. Другие испытанные планшеты обладали меньшей сорбционной способностью и однородностью сорбции (вариации 4-15%). В связи с этим для дальнейших экспериментов выбраны планшеты Nunc, Costar, позволяющие достигать более высокую чувствительность и стандартность анализа.
Изучение влияния растворов для разбавления специфических компонентов показало, что применение для разбавления антигенов ФБС (0,01М), NaCl (0,15М) или физиологического раствора показывает сравнительно равные результаты по чувствительности и специфичности метода ИФА.
С использованием полученных оптимальных параметров постановки теста были проведены испытания специфичности и чувствительности ТФ-ИФА. Результаты специфичности ТФ-ИФАпредставлены в таблице.
Результаты специфичности тест-системы ТФ-ИФА
для выявления антигенов вируса бешенства
источник