Напряженность иммунитета к бешенству

Естественный иммунитет к вирусу бешенства существует у черепахи, лягушки и других холоднокровных пресмыкающихся животных (А. П. Муратова и др., Remlinger, Bailly, Battaglino). Выраженной видовой резистентностью к вирусу бешенства обладают взрослые птицы, у которых при экстраневральном пути введения вируса уличного бешенства не развивается болезнь, а после интрацеребрального заражения наблюдаются клинические признаки бешенства лишь в 1/3 случаев. При этом из мозга заболевших животных редко удается выделить вирус или обнаружить тельца Бабеша — Негри. Также не удается поддерживать вирус на взрослых птицах путем серийных интрацеребральпых пассажей (Е. В. Клюева и др., Jacotot, Roux, Remlinger, Bailly).

Теплокровные животные в зависимости от видовых особенностей, возраста, места проникновения вируса и его дозы восприимчивы к вирусу бешенства в неодинаковой степени: новорожденные и очень молодые животные менее резистентны, чем взрослые; сирийский хомяк более чувствителен, чем кролик. Неповрежденные кожные покровы теплокровных животных непроницаемы для вируса бешенства. По-видимому, естественный барьер представляет также желудок и кишечник с их кислотностью и ферментами.

Все эти факторы необходимо рассматривать как проявление естественного неспецифического иммунитета. Как известно, люди, укушенные бешеными животными и не привитые аптирабической вакциной, заболевают бешенством в среднем в 11 —12% случаев (H. Мари) и при укусах заведомо бешеными животными в 56,6% случаев (Veeraraghavan).

Этот факт можно объяснить, с одной стороны, отсутствием вируса в слюне больного животного или механическим удалением вируса во время кровотечения и другими причинами, с другой стороны — наличием естественной невосприимчивости к вирусу бешенства, хотя в практических условиях полагаться на естественную защиту организма не приходится. В отличие от многих вирусных болезней вопрос о естественно приобретенном антирабическом иммунитете в такой же степени неясен и недостаточно изучен, как сама проблема естественного выздоровления или успешного лечения развивающейся гидрофобии. Истинная иммунология бешенства — это искусственно приобретенный активный, вакцинальный и пассивный иммунитет, передаваемый иммуноглобулинами.

На заре рабиологии природу прививочного иммунитета объясняли ролью антител. Еще в 1889 г. Babes, Lepp в крови вакцинированных животных обнаружили вируснейтрализующие антитела. Дальнейшими наблюдениями был установлен параллелизм между титром антител, интенсивностью курса прививок и напряженностью иммунитета (Е. И. Миролюбова, Stuart, Krikonan, Dodero). В указанный период гуморальная теория иммунитета имела всеобщее признание. Однако эта теория имела и уязвимые стороны.

Используемая в то время неконцентрированная антирабическая сыворотка была активной in vitro и недостаточно или совсем неэффективной in vivo. Е. И. Туревич с соавт. в опытах на мышах не смогли подтвердить корреляции между уровнем антител и состоянием резистентности. Применяемая в тот период недостаточно совершенная методика титрования антител позволяла выявить вируснейтрализующие антитела в крови привитых люден в 41—80% случаев, а оказывались защищенными все. Отсюда делали заключение, что иммунитет не всегда сопровождается появлением в крови вируснейтрализующих антител (иммунитет без антител).

Из-за несовершенства методики реакции нейтрализации у привитых людей антитела обнаруживались только до 6 мес, в то время как практически иммунитет сохранялся до года. Д. В. Саблин сообщил о высоком содержании антител в крови больных гидрофобией, привитых интенсивно. Таким образом, исследователи приходили к выводу, что, несмотря на высокое содержание антител, у человека заболевание гидрофобией не предупреждается.

Некоторые из упомянутых выше критических возражений на современном уровне наших знаний оказываются несостоятельными. Так, современный концентрированный и очищенный гамма-глобулин высокоэффективен при использовании как в практике здравоохранения, так и в эксперименте на животных. Это, пожалуй, самый убедительный аргумент для объяснения роли вируснейтрализующих антител в природе анти-рабического иммунитета. Современные высокоэффективные вакцины и особенно концентрированная и очищенная культуральная антирабическая вакцина стимулируют продукцию антител практически в 100% случаев, хотя уровень антител зависит от индивидуальных иммунобиологических особенностей макроорганизма. Показано, что вируснейтрализующие антитела сохраняются в крови привитых людей до 36 лет (М. А. Селимов и др.).

В опытах Е. И. Туревича с соавт. не наблюдалось корреляции между титром антител в крови и резистентностью мышей к заражению в мозг, вероятно, потому, что встреча вируса с антителами происходит не в крови. Наконец, у больных гидрофобией, привитых интенсивно, действительно могут быть обнаружены высокие титры антител в крови. Это можно объяснить неэффективностью антител, продуцированных во второй половине инкубационного периода, т. е. уже после проникновения вируса в ЦНС. Антитела, продуцированные до заражения животного, несомненно, оказывают защитный эффект. Убедительно доказано, что если иммунизированное животное содержит в своей крови достаточное количество вируснейтрализующих антител, то оно резистентно к последующему заражению вирусом бешенства (Wld. Halh. Org. Techn. Rep. Ser.).

источник

Это высококонтагиозное при попадании напрямую в кровь заболевание вызывает один из представителей семейства рабдовирусов, поражающий нервные клетки. С момента появления клинических симптомов инфекция летальна на 99,7% (зафиксированы единичные исключения) и лечению не поддается.

Подобно большинству размножающихся в нервной ткани возбудителей, бешенство иммунитет почти не вырабатывает. Клетки ЦНС обладают значительной, хотя и неполной иммунной привилегией – недоступностью для проникновения защитных тел.

Возбудитель бешенства более типичен для животного царства. У инфицированных животных/людей он присутствует в слюне и передается при глубоком укусе. И среди животных он распространяется быстрее просто из-за очевидных различий в образе жизни (они чаще дерутся, используя клыки как оружие). Из инфицированной раны он добирается с током крови до ближайшего нервного ствола и заражает нейрон.

Нервные клетки защищены от активности многих иммунных тел (ее результаты могут нарушать работу периферических и центральных отделов ЦНС сильнее причинной инфекции). За мембраной нейрона вирус бешенства чувствует себя в безопасности. В зависимости от штамма, он может размножаться с образованием разных структур:

• уличный штамм размножается внутри задетого нейрона с минимальными повреждениями его морфологии, образуя т.н. тельца Бабеша-Негри;
• фиксированный штамм разрушает нервную клетку, оставляя одну наружную мембрану и образуя т.н. тельца Лентца.

Далее вирионы распространяются по дендритам и аксонам захваченного нейрона в соседние. Возбудитель «поднимается» из первичного очага вверх, в спинной и головной мозг со скоростью около 3 мм в час. Не самый быстрый способ распространения, зато один из самых эффективных благодаря закрытости процесса от системы защиты.

Промежуток между инфицированием и появлением первых симптомов – последнее «окно», чтобы успеть ввести вакцину и экстренно выработать у зараженного больного иммунитет против бешенства по принципу «чем раньше, тем лучше». А после заражения магистральных отделов ЦНС наступают критические сбои в их работе, которые проявляются:

• гидрофобией (страх воды);
• арофобией (боязнь малейших колебаний воздуха);
• фотофобией (боязнь света);
• нервным возбуждением;
• параличом челюстных мышц («пена у рта» – неконтролируемое слюноотделение из-за невозможности закрыть рот или сглотнуть слюну);
• судорогами;
• общим параличом, включая дыхательный центр и сердечную мышцу (причина смерти).

Вирус бешенства у человека может долго «добираться» до коры головного мозга (от 2-3 недель до года), но определяемая симптоматически стадия заболевания развивается стремительно. От момента появления первых его признаков до летального исхода проходит примерно 7-10 суток. В этот период врачи могут обеспечить только ряд паллиативных мер, не влияющих на финал.

Описанная выше скрытность персистенции и размножения возбудителя сводит его контакт с иммунной защитой к минимуму – на то она и рассчитана. Но иммунитет после прививки бешенства лабораторным животным обычно просто не успевает развиться – смерть наступает раньше. В 1885 г это явление натолкнуло Л. Пастера на мысль, что вероятность его выработки не исключена.

Просто ему для этого требуется время, а молниеносное развитие патологии его не оставляет. Ему удалось обойти данную закономерность за счет последовательного заражения нескольких лабораторных животных одним и тем же штаммом (его перевиванием от одного животного следующему).

Результат эксперимента оказался положительным, и открытый им метод изготовления вакцин применяется по сей день. Привнесенная сильно развившимися с тех пор технологиями «новинка» заключается лишь в появлении возможности выделить из крови зараженных животных специфические иммуноглобулины к вирусу бешенства – в дополнение к вакцине.

Чем быстрее будет вакцинирован укушенный животным или человеком при подозрительных обстоятельствах пациент, тем больше шансов блокировать заражение ЦНС рабдовирусом. После первичной санации рану обкалывают «по периметру» препаратом с антирабическими (выработанными специально к возбудителю бешенства) иммуноглобулинами, одну порцию обязательно вводят в ее полость.

Затем пациент получает серию инъекций непосредственно вакцины. Обязательной вакцинации раз в 3 года подлежат домашние, сельскохозяйственные животные и представители зоны высокого риска:

• охотники;
• врачи-ветеринары;
• кинологи и собаколовы;
• егеря и другие сотрудники лесных хозяйств.

Современная вакцина вводится внутримышечно, шестикратно. Первое введение проводят максимально быстро после подозрительного укуса, последующие – на 3, 7-е, 14-е, 30-е и 90-е сутки. Иммунитет она дает нестойкий, и его необходимо периодически «обновлять». Повторную прививку делают спустя год, потом – каждые 3 года.

Раз есть прививка от бешенства, иммунитет человека и животных способен подавлять рабдовирус. Но это касается только клеток других типов и слюны. А на скорость его распространения по нейронам ЦНС сила иммунного ответа не влияет (внутри нервной ткани система резистентности не работает).

При этом с 2005 г. в США используется метод погружения пациента с признаками бешенства в искусственную кому. Его результативность составляет около 5 выживших и полностью излечившихся за период пребывания в коме из 35-40 подвергнутых процедуре больных. Данный факт также свидетельствует, что иммунитет после бешенства существует, и со временем способен уничтожить возбудителя даже в плохо доступной ему нервной ткани.

Просто, судя по низкой эффективности американского метода, срабатывает он так же, как и иммунитет от рака – в единичных случаях. А в подавляющем их большинстве единственный шанс инфицированного пациента выжить – это блокировать рабдовирус в тканях и местном кровотоке с помощью иммуноглобулинов до того, как он «доберется» до ближайшего нервного ствола.

источник

Внимание! На форуме есть ветки, касающиеся сугубо профессиональных вопросов (на сегодня это форум «Коллегиально») и доступные только зарегистрированным пользователям, имеющим статус «Врача», и «Закрытая для Гостей тема», доступная «Пользователям» (см. п. 1.3 «Правил»)

Сообщения незарегистрированных гостей форума недоступны с 08.10.2015. Для того, чтобы писать сообщения, задавать вопросы — пожалуйста, зарегистрируйтесь.

• Автор: Ijunya
• Участник
• Зарегистрирован: 2017-08-19
• Приглашений: 0
• Сообщений: 6
• Уважение: [+0/-0]
• Позитив: [+0/-0]
• Провел на форуме:
  1 час 19 минут
• Последний визит:
  2017-08-27 00:22:15

Прошу проконсультировать в моей ситуации:
Вчера меня укусил уличный котенок, пыталась его взять и перенести с дороги. Укус был в палец руки, совсем небольшой, но кровь была. Минут через 15 я обработала рану перекисью и йодом и поехала в травмпункт. Там мне поставили прививку от столбняка и кокав и отпустили домой. Сейчас сижу, внутри всю трясёт, как поняла, в связи с такой локализацией укуса, он считает одним из самых опасных, и помимо кокав мне в моей ситуации должны были поставить ещё и имуноглобулин, но не поставили. Почему так могли сделать? Что мне делать теперь в такой ситуации, куда бежать. Просто только надеяться, что пронесёт. Но как я понимаю, иммунитет вырабатывается недели через 2, в то время как, симптомы болезни могут появиться уже на 7 день..
Очень переживаю, места себе не нахожу..

• Автор: TraumaX
• Администратор форума
• Зарегистрирован: 2016-07-27
• Приглашений: 0
• Сообщений: 1257
• Уважение: [+109/-3]
• Позитив: [+5/-7]
• Провел на форуме:
  14 дней 7 часов
• Последний визит:
  Сегодня 00:04:17

Доброго времени суток.
Да, Вы совершенно правильно прочитали, что согласно приказам и нормативам по бешенству, Вам показана «полная вакцинация»: АРИГ (иммуноглобулин) + КоКАВ (антирабическая вакцина) + противостолбнячная вакцинация. Нюанс в том, что после введения КоКАВ (вакцины), АРИГ (иммуноглобулин) вводить нельзя. Это прописано и в инструкциях, и в аннотации к препарату.

Конечно, судя по Вашему описанию, вероятность того, что у котенка было бешенство — довольно малая (т.к.котенок не проявлял признаков самостоятельной агрессии, укус был спровоцирован и т.д.). Но если потенциально предположить такую возможность, то проведенная вакцинация не даст защиты, близкой к 100% (т.к.не был введен АРИГ).

К вопросу о том, что же сейчас с этим делать? Мне видится только два варианта:
1) Вы «заморачиваетесь» на тему того, что бешенство возможно было. Тогда Вам придется дойти до рабиолога/иммунолога (зависит от района), который распишет Вам возможную дальнейшую схему введения АРИГ после введенного КоКАВ. Обычно, введение АРИГ эффективно в первые 3-4 суток после укуса. Иногда — до 7 суток, в зависимости от препарата, который используется для инъекций.
2) Вы «не заморачиваетесь» на тему возможного бешенства и продолжаете начатый курс КоКАВ по схеме (до 90 суток с момента первой инъекции). Вероятность заразиться бешенством в этом случае все-равно довольно маленькая.

Надеюсь, это поможет разобраться.

P.S. возможно, Ваша ситуация имеет более сложную структуру — просто не знаю всей мед.истории, возможной истории предыдущих вакцинаций, аллергических реакций на препараты и прочих вещей.

• Автор: Ijunya
• Участник
• Зарегистрирован: 2017-08-19
• Приглашений: 0
• Сообщений: 6
• Уважение: [+0/-0]
• Позитив: [+0/-0]
• Провел на форуме:
  1 час 19 минут
• Последний визит:
  2017-08-27 00:22:15

Доброго времени суток.
Да, Вы совершенно правильно прочитали, что согласно приказам и нормативам по бешенству, Вам показана «полная вакцинация»: АРИГ (иммуноглобулин) + КоКАВ (антирабическая вакцина) + противостолбнячная вакцинация. Нюанс в том, что после введения КоКАВ (вакцины), АРИГ (иммуноглобулин) вводить нельзя. Это прописано и в инструкциях, и в аннотации к препарату.

Конечно, судя по Вашему описанию, вероятность того, что у котенка было бешенство — довольно малая (т.к.котенок не проявлял признаков самостоятельной агрессии, укус был спровоцирован и т.д.). Но если потенциально предположить такую возможность, то проведенная вакцинация не даст защиты, близкой к 100% (т.к.не был введен АРИГ).

К вопросу о том, что же сейчас с этим делать? Мне видится только два варианта:
1) Вы «заморачиваетесь» на тему того, что бешенство возможно было. Тогда Вам придется дойти до рабиолога/иммунолога (зависит от района), который распишет Вам возможную дальнейшую схему введения АРИГ после введенного КоКАВ. Обычно, введение АРИГ эффективно в первые 3-4 суток после укуса. Иногда — до 7 суток, в зависимости от препарата, который используется для инъекций.
2) Вы «не заморачиваетесь» на тему возможного бешенства и продолжаете начатый курс КоКАВ по схеме (до 90 суток с момента первой инъекции). Вероятность заразиться бешенством в этом случае все-равно довольно маленькая.

Надеюсь, это поможет разобраться.

P.S. возможно, Ваша ситуация имеет более сложную структуру — просто не знаю всей мед.истории, возможной истории предыдущих вакцинаций, аллергических реакций на препараты и прочих вещей.

Спасибо Вам большое за ответ!
Предыдущих вакцинаций и реакций не было. Не могу найти объяснения, почему врач так поступил, кроме того, что просто не хотел заморачиваться, тк был не очень доволен «моим визитом»..Даже не сказал про ариг, не предложил..
А где искать такого врача?? Речь идёт о Москве! Вы случайно не знаете, какой считается ситуация в Москве в плане бешенства, благоприятной или неблагоприятной?
Мне уже в другой больнице отказались колоть ариг, сославшись на то, что уже ранее укололи кокав..??и на то, «что кокав-это основной препарат, а Ариг- не особо мне и нужен, тк не по лесу я шла, и кошкане Сама на меня бросилась». ??
Вчера скачала себе Могилевского, он пишет, что допускается введение ариг после кокав, если кокав были введены не более 1-3 уколов кокав..
Какая все-таки Ваша точка зрения в данном вопросе? Что бы делали Вы, если так можно поставить вопрос?? Спасибо!

• Автор: TraumaX
• Администратор форума
• Зарегистрирован: 2016-07-27
• Приглашений: 0
• Сообщений: 1257
• Уважение: [+109/-3]
• Позитив: [+5/-7]
• Провел на форуме:
  14 дней 7 часов
• Последний визит:
  Сегодня 00:04:17

Сочувствую Вашим скитаниям. Москва считается неопасным по бешенству регионом (т.е.за последние лет 10 в Москве не было зафиксировано ни одного носителя бешенства).

Если настроились проводить полную вакцинацию и Вы находитесь в Москве, то Ваш врач — инфекционист по месту жительства (в Вашей поликлинике или районной). К травматологам обращаться бессмысленно, т.к.они в этом вопросе люди подневольные и ничего принципиального менять/решать не могут. Травматологов (врачи хирургического профиля) заставили заниматься «не своим делом» (бешенство — инфекционное заболевание, которым занимаются инфекционисты= терапевтический профиль), поэтому Вы можете встретить много недовольства на приеме, и отсутствие решающего голоса в отношении любых «нестандартных вариантов».

• Автор: Ijunya
• Участник
• Зарегистрирован: 2017-08-19
• Приглашений: 0
• Сообщений: 6
• Уважение: [+0/-0]
• Позитив: [+0/-0]
• Провел на форуме:
  1 час 19 минут
• Последний визит:
  2017-08-27 00:22:15

Сочувствую Вашим скитаниям. Москва считается неопасным по бешенству регионом (т.е.за последние лет 10 в Москве не было зафиксировано ни одного носителя бешенства).

Если настроились проводить полную вакцинацию и Вы находитесь в Москве, то Ваш врач — инфекционист по месту жительства (в Вашей поликлинике или районной). К травматологам обращаться бессмысленно, т.к.они в этом вопросе люди подневольные и ничего принципиального менять/решать не могут. Травматологов (врачи хирургического профиля) заставили заниматься «не своим делом» (бешенство — инфекционное заболевание, которым занимаются инфекционисты= терапевтический профиль), поэтому Вы можете встретить много недовольства на приеме, и отсутствие решающего голоса в отношении любых «нестандартных вариантов».

Спасибо Вам большое за оперативные ответы и отношение! Не могли бы Вы ещё ответить на несколько моих вопросов? Правильно ли я поняла, что вероятность самого заражения даже при наличии реальной инф-ции далеко не 100%? Влияют ли на это размер раны, насколько быстро была обработана рана и тп?? И ещё:можно ли где-то сдать анализ на антитела к инфекции и понять, как реагирует иммунитет ? И как называется и где искать такой анализ? Для животных такие анализы есть, а вот для людей не нашла ?

• Автор: TraumaX
• Администратор форума
• Зарегистрирован: 2016-07-27
• Приглашений: 0
• Сообщений: 1257
• Уважение: [+109/-3]
• Позитив: [+5/-7]
• Провел на форуме:
  14 дней 7 часов
• Последний визит:
  Сегодня 00:04:17

Спасибо Вам большое за оперативные ответы и отношение!

Пожалуйста

Не могли бы Вы ещё ответить на несколько моих вопросов?

Правильно ли я поняла, что вероятность самого заражения даже при наличии реальной инф-ции далеко не 100%?

Да, совершенно верно. Это касается любого инфекционного заболевания.

Влияют ли на это размер раны, насколько быстро была обработана рана и тп??

Размеры раны не влияют. Но если рана(раны) обширные, глубокие, загрязненные, то вероятность заражения много выше и поэтому инструкции рекомендуют вводить АРИГ даже при «неопасных» локализациях. Если же рана небольшая/неглубокая и удалось быстро провести первичную ее обработку — это снижает риск потенциального заражения. Точное время, в течение которого должна быть проведена обработка, — не установлено. Соответственно, невозможно и рассуждать на тему типа если, вот, я например обработал рану в течение 5 минут, то вероятность заразиться будет почти нулевая . а вот если, например, через 20 минут — тогда вероятность уже 60%. Никаких подобных «нормативов» не существует.

И ещё:можно ли где-то сдать анализ на антитела к инфекции и понять, как реагирует иммунитет ? И как называется и где искать такой анализ? Для животных такие анализы есть, а вот для людей не нашла ?

Прижизненного анализа (который делается, когда пациент живой), который позволил бы определить наличие активного вируса бешенства в Вашем организме (т.е.заражение бешенством) — не существует. Это возможно сделать только после смерти — берется головной мозг на анализ и там выявляются определенные структуры. Сложности выявления заражения связаны с тем, что вирус бешенства перемещается по организму внутриклеточно (из одной клетки в другую) и это происходит в клетках нервной системы.

Соответственно, единственное, что можно сформировать и измерить — это так называемую «напряженность иммунитета» к вирусу бешенства. Собственно, после окончания полного курса вакцинации Вы можете этот анализ сделать и измерить эту напряженность. Она будет отражать текущую готовность Вашего организма распознать и уничтожить вирус бешенства, если он окажется в Вашем организме. Если по ряду причин с определенной периодичностью сталкиваетесь с возможностью быть зараженным бешенством, имеет смысл делать профилактическую вакцинацию и поддерживать эту напряженности на требуемом уровне.

В отношении «свежего случая», подобная вакцинация (КоКАВ) — это игра на опережение. Вирус бешенства, даже если он и попал в организм, со временем начинает постепенно двигаться в сторону головного мозга. Это может происходить бессимптомно. Но движение это ОЧЕНЬ медленное, т.к. перемещаться внутриклеточно крайне сложно. Поэтому это может занимать несколько недель. Быстро начиная вакцинацию от бешенства (КоКАВ), мы пытаемся сформировать у организма иммунитет к бешенству. И обычно на это требуется от 2 недель времени. Как показывают все исследования и практика последних 20 лет во всем Мире — это довольно эффективная стратегия. Почти в 100% дающая защиту пациенту. Именно поэтому все приказы и инструкции продолжают действовать и пока не нуждаются в пересмотре/изменении тактики.

Надеюсь, это поможет разобраться.

• Автор: Ijunya
• Участник
• Зарегистрирован: 2017-08-19
• Приглашений: 0
• Сообщений: 6
• Уважение: [+0/-0]
• Позитив: [+0/-0]
• Провел на форуме:
  1 час 19 минут
• Последний визит:
  2017-08-27 00:22:15

Да, совершенно верно. Это касается любого инфекционного заболевания.

Размеры раны не влияют. Но если рана(раны) обширные, глубокие, загрязненные, то вероятность заражения много выше и поэтому инструкции рекомендуют вводить АРИГ даже при «неопасных» локализациях. Если же рана небольшая/неглубокая и удалось быстро провести первичную ее обработку — это снижает риск потенциального заражения. Точное время, в течение которого должна быть проведена обработка, — не установлено. Соответственно, невозможно и рассуждать на тему типа если, вот, я например обработал рану в течение 5 минут, то вероятность заразиться будет почти нулевая . а вот если, например, через 20 минут — тогда вероятность уже 60%. Никаких подобных «нормативов» не существует.

Прижизненного анализа (который делается, когда пациент живой), который позволил бы определить наличие активного вируса бешенства в Вашем организме (т.е.заражение бешенством) — не существует. Это возможно сделать только после смерти — берется головной мозг на анализ и там выявляются определенные структуры. Сложности выявления заражения связаны с тем, что вирус бешенства перемещается по организму внутриклеточно (из одной клетки в другую) и это происходит в клетках нервной системы.

Соответственно, единственное, что можно сформировать и измерить — это так называемую «напряженность иммунитета» к вирусу бешенства. Собственно, после окончания полного курса вакцинации Вы можете этот анализ сделать и измерить эту напряженность. Она будет отражать текущую готовность Вашего организма распознать и уничтожить вирус бешенства, если он окажется в Вашем организме. Если по ряду причин с определенной периодичностью сталкиваетесь с возможностью быть зараженным бешенством, имеет смысл делать профилактическую вакцинацию и поддерживать эту напряженности на требуемом уровне.

В отношении «свежего случая», подобная вакцинация (КоКАВ) — это игра на опережение. Вирус бешенства, даже если он и попал в организм, со временем начинает постепенно двигаться в сторону головного мозга. Это может происходить бессимптомно. Но движение это ОЧЕНЬ медленное, т.к. перемещаться внутриклеточно крайне сложно. Поэтому это может занимать несколько недель. Быстро начиная вакцинацию от бешенства (КоКАВ), мы пытаемся сформировать у организма иммунитет к бешенству. И обычно на это требуется от 2 недель времени. Как показывают все исследования и практика последних 20 лет во всем Мире — это довольно эффективная стратегия. Почти в 100% дающая защиту пациенту. Именно поэтому все приказы и инструкции продолжают действовать и пока не нуждаются в пересмотре/изменении тактики.

Надеюсь, это поможет разобраться.

Да, я как раз анализ напряженности иммунитета и имела ввиду. Как он называется в лабораториях, как и где его искать??

источник

Анализ на бешенство у собак подразумевает проведение специальных экспресс-тестов на наличие в крови специфических антирабических антител. Иногда его применяют в комплексной диагностике при подозрении на заражение домашних питомцев вирусом бешенства. Данное заболевание представляет угрозу для жизни животных, человека, поэтому заводчики собак должны иметь понятие о том, как проявляется данный недуг. Если есть подозрение на заражение, если питомец имел контакт с возможным бактерионосителем, нужно сразу отвезти питомца в ветлечебницу, для проведения лабораторной диагностики, без которой невозможно установить точный диагноз.

Бешенство (rabies) – остропротекающее заболевание теплокровных животных инфекционной этиологии, вызываемое вирусом, который поражает ЦНС, провоцируя серьезные нарушения в организме. К сожалению, эффективного лечения на данный момент не разработано, поэтому инфекция всегда заканчивается летальным исходом.

Возбудитель инфекционного недуга – РНК-содержащий вирус (рабдовирус). Поражает домашних и диких животных. Существует так называемый «природный» вирус и «лабораторный».

ВАЖНО! БЕШЕНСТВО ОТНОСЯТ К ЗООАНТРОПОЗООНОЗНЫМ БОЛЕЗНЯМ, ТО ЕСТЬ ИНФЕКЦИЯ ПЕРЕДАЕТСЯ ЧЕЛОВЕКУ. ВСПЫШКИ ИНФЕКЦИИ ОТМЕЧАЮТ ВЕЗДЕ. БОЛЕЗНЬ ИМЕЕТ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЙ ХАРАКТЕР.

Природным резервуаром рабдовируса являются инфицированные плотоядные хищники. Смертельно опасный вирус содержится в слюне инфицированных особей. Инфицирование происходит контактным путем, при укусах, проникновении слюны в ссадины, ранки на дерме.

Проникнув в организм, вирус по нервным путям мгновенно перемещается в головной, спинной мозг, слюнные железы, где в дальнейшем он размножается.

В слюне инфицированных животных рабдовирус появляется примерно за три-семь дней до момента проявления первых симптомов. При этом инфицированная особь уже является вирусуносителем, представляя реальную угрозу для человека, других домашних животных. Поэтому заражение бешенством может произойти даже в том случае, если вас или вашего питомца укусило внешне здоровое животное.

Инкубационный период длиться от 2-7-ми суток до нескольких недель. Интенсивность проявления симптоматики зависит от возраста, резистентности, иммунной защиты, вирулентности, концентрации рабдовируса в организме. Смертельно опасный недуг у животных протекает в тихой, буйной, реже в атипической формах.

У собак отмечают преимущественно буйную форму инфекции, продолжительность которой составляет от шести до десяти суток. Имеет три стадии проявлении:

• Продромальную. Срок протекания меланхолической стадии — не более двух суток. На этом этапе развития инфекции отмечают изменение поведенческих манер собаки. Животные сильно угнетены, выглядят подавленными, прячутся в темных укромных местах, неохотно идут на контакт, неадекватно реагируют на раздражители.
• Маниакальную (стадия возбуждения). Продолжительность течения не более трех-четырех суток. Больные животные проявляют беспричинную агрессию к своим собратьям, другим домашним питомцам, человеку, включая хозяина. Агрессия сменяется ласковым поведением. Питомец требует внимания, лижет руки, лицо человека. Больные питомцы поедают несъедобные предметы. Нередко собаки убегают из дома и могут пробежать без устали 20-30 км.
• Паралитическую (депрессивную). Для данной стадии, продолжительность которой составляет не более шести суток, характерны тяжелые сбои в функционировании ЦНС. Отмечают паралич глотки, гортани, мышечные судороги, спазмы. Нижняя челюсть отвисает. Отсутствует глотательный рефлекс. Из пасти постоянно течет слюна. Громкие звуки, шум воды вызывает сильнейшую панику. Координация движения нарушена. Питомец впадает в кому, погибает от истощения, нарушения дыхательной, сердечной функции.

Стоит отметить, что бешеная собака, независимо от формы и стадии заболевания кусает человека, животных не предупреждая о нападении лаем.

Для тихой формы болезни характерно отсутствие стадии возбуждения. Продолжительность — от двух до пяти суток. Характеризуется общим угнетением, меланхоличностью, отсутствием реакции на внешние раздражители. Животные гибнут из-за паралича мышечных структур тела, глотки. Болезнь всегда заканчивается летальным исходом.

Реже у собак отмечают атипичную форму болезни, которая проявляется нетипичными, нехарактерными для данной инфекции проявлениями. Протекает остро, подостро, реже хронически (два-три месяца). У животных отмечают изменение поведения, сбои в работе ЦНС, ЖКТ.

Заметив нехарактерное поведение своего домашнего любимца, изменение повадок, проявление агрессии, а также если собака имела контакт или была укушена бездомными, дикими животными, обязательно нужно отвезти питомца в ветлечебницу, проверить собаку на бешенство. Не стоит забывать, что симптоматика нарастает спонтанно в определенной последовательности.

При постановке предварительного диагноза должны быть учтены данные анамнеза, паталагоанатомические результаты, эпизоотологическая ситуация, симптомы. Проводится серия лабораторных, гистологических, микроскопических, бактрериологических исследований, экспресс-тесты.

Учитывая схожесть симптоматики с другими инфекциями, проводится дифференциальная диагностика (ИФА, ПЦР). Необходимо исключить болезнь Ауески, чуму плотоядных, энцефаломиелит.

Важно! Если есть подозрение на инфекцию, животное покусало человека, собаку помещают в специальные изолированные боксы и в течение десяти дней, пока не будут готовы результаты анализов, наблюдают за ее состоянием. Если диагноз подтвердился, к сожалению, проводится эвтаназия. Животных усыпляют, поскольку лечения от данной инфекции нет.

Точный диагноз удается установить только после смерти животных. Полученный патматериал исследуют различными методами.

Наиболее достоверный метод, который всегда подтверждает болезнь – микроскопические исследования биоматериала на наличие специфических включений в мозге – телец Бабеша-Негри. Расположеные в аммоновых рогах.

Для обнаружения специфического антигена в мозге применяют реакцию диффузной преципитации, иммунофлуоресцентный анализ отпечатка роговицы.

Иммунофлуоресцентный метод позволяет максимально быстро диагностировать наличие вируса в организме собак. Метод определяет вирусный антиген в 93-97% случаях.

Учитывая то, что вирус перемещается по нервным стволам, его крайне редко удается определить в кровеносном русле. Как правило, при подозрении на заражение для анализов исследуют спинномозговую жидкость.

Серологические исследования заключаются в проведении общего, биохимического анализа крови. Отмечают изменение лейкоцитарной формулы (лейкоцитоз), олигурию, альбуминурию, глюкозурию, увеличение концентрации моноцитов.

Протестировать своего питомца на бешенство, определить напряженность поствакцинального иммунитета позволит тест на наличие специфических антирабических антител в крови. Проводится данная процедура только в аккредитованных лабораториях, некоторых ветклиниках. Стоит отметить, что стоимость данного анализа довольно высока. Результаты после проведения процедуры будут готовы через 10-20 суток.

Сегодня проводится два вида тестов на антирабические антитела – RFFIT (тест быстрого торможения фокуса флюоресценции) и FAVN – тест флуоресцентных вируснейтрализующих антител, который определяет титр антител в МЕ/мл. Данные методики выполняют на живых культурах клеточных структур с добавлением в реакцию возбудителя инфекции. У собак берется 0.5- 1 мл сыворотки крови.

Тест проводят преимущественно в том случае, если вы хотите вывезти своего питомца заграницу. Многие страны ЕС запрещают ввозить на свою территорию не привитых от бешенства животных, а также собак, котов, у которых нет результатов по данному анализу.

Сдавать тест на антитела нужно тогда, когда в крови собаки выработаются антитела к данной инфекции. Специфический иммунитет после иммунизации формируется через месяц после прививки. С этого момента можно везти питомца в лабораторию для прохождения теста на антитела к бешенству. При этом после иммунизации, если возникает потребность в проведении данного теста, от даты прививки не должно пройти более года. Тест нужно сдать не позднее месяца до срока проведения ревакцинации.

Если титр антирабических антител составляет менее 0,50 МЕ/мл – собаку ревакцинируют. Через месяц сдается повторный анализ. На продуцирование защитных антител после иммунизации влияют некоторые факторы: порода, возраст, индивидуальные особенности организма, кратность антирабической иммунизации. Ветврачи рекомендуют проводить мониторинг титра антител у собак, кошек после вакцинации, даже в том случае, если не планируется выезд за границу.

Многие владельцы вывозят своих питомцев на дачу, на природу, в лес, на охоту. Не стоит забывать, что собаку могут покусать дикие звери, которые могут быть инфицированы или являются вирусоносителями.

Единственный способ защитить собаку от смертельно опасной инфекции – своевременно проведенная вакцинация.

В дальнейшем, в зависимости от выбранного препарата, раз год проводится ревакцинация. Некоторые вакцины формируют иммунную защиту сроком на три года. Оптимальную схему вакцинаций, ревакцинаций подберет ветврач.

источник

Бешенство – широко распространенная в мире острая зоонозная нейроинфекция, возбудителем которой является РНК-содержащий вирус, относящийся к отряду Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus и являющийся единственным из царства Virae, поражающим всех теплокровных животных, в т.ч. человека со 100 % летальностью.

Основной путь заражения бешенством – через укус или при попадании слюны больного животного на повреждённую поверхность кожи.

Зафиксированы случаи заражения бешенством людей при трансплантации органов и тканей, а также аэрогенным путём.

Инкубационный период может длиться от нескольких дней до нескольких лет.

Городское бешенство – чаще всего обнаруживается у собак и кошек и элиминируется в ходе программ вакцинации;

Бешенство в дикой природе – имеет широчайшее распространение среди разных видов животных (рыжие и бурые лисы, песцы, еноты, енотовидные собаки, волки, барсуки, скунсы и летучие мыши). Этот цикл может быть значительно уменьшен при помощи вакцинации с использованием приманок, содержащих вакцину, которые разбрасываются в местах обитаниях животных.

Согласно МКТВ (Международный комитет по таксономии вирусов), в настоящее время существует 14 видов лиссавирусов. Классический вирус бешенства (ВБ) относится к первому генотипу.

В последнее время остро стоит проблема передачи лиссавирусов через летучих мышей. Это новая значимая для человека угроза, требующая более тщательного анализа, так как в антигенном отношении вирус полностью отличается от классического вируса бешенства, но также относится к лиссавирусам.

Использование комплекса лабораторных диагностических методов, предписанных Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (OIE)

Выявление антигена

Исследование мазков-отпечатков с использованием флюоресцирующих антител — реакция иммунофлюоресценции (РИФ), англ. fluorescent antibody test, (FAT) — «золотой стандарт» диагностики.

Выделение вируса в культуре клеток (RTCIT)

Биопроба на мышах (MIT)

До недавнего времени основным способом накопления вируса бешенства считался метод биопробы на беспородных белых мышах (MIT). Это высокочувствительный метод, однако, его недостатками являются высокая стоимость исследования, длительное содержание заражённых животных (30 суток), и необходимость подтверждения результатов в РИФ. В настоящее время для выделения ВБ используют метод накопления вируса в культуре клеток мышиной нейробластомы (RTCIT), который, согласно рекомендациям ВОЗ, должен полностью заменить MIT (WHO 2005, OIE, 2010, EFSA 2010).

Выявление вирусного генома методом полимеразной цепной реакции ПЦР (PCR)

Многие лаборатории используют для диагностики бешенства ПЦР-метод. Обладая несомненными преимуществами по ряду параметров ПЦР- метод, тем не менее не рекомендован ВОЗ для рутинной диагностики бешенства вследствие высокого риска контаминации и получения ложноположительных результатов (WHO 2005).

Серологические методы выявления антител к вирусу бешенства:

RFFIT (rapid fluorescent focus inhibition test) — тест быстрого торможения фокуса флюоресценции

FAVN (fluorescent antibody virus neutralisation test) — флюоресцентный вируснейтрализующий тест (реакция нейтрализации вируса). Позволяет количественно определить уровень антирабических антител в МЕ/мл.

ELISA (ИФА) – иммуноферментный метод. Данный метод менее чувствительный, чем FAVN, и применяется для определения уровня антирабических антител после применения оральной вакцинации у диких животных.

Метод RFFIT и метод FAVN выполняются на живой культуре клеток с добавлением вируса бешенства в реакцию. Сами тесты трудоёмки и требуют дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов

Кроме вышеперечисленных утвержденных методик существуют такие методы диагностики бешенства как: иммуноцитохический (ICC), гибридизации in-situ (ISH), иммунохроматографический.

Основой специфической профилактики бешенства является использование эффективных антирабических вакцин, способных вызывать формирование напряженного и длительного антирабического иммунитета.

Для вакцинации домашних животных используют зарегистрированные в РФ отечественные и зарубежные инактивированные антирабические вакцины, которые различаются по безопасности и эффективности.

Наши многолетние исследования позволили разработать эффективные вакцины против вируса бешенства как поливалентные так и моновалентные:

Антирабические вакцины готовят из штамма ERA-CB20M вируса бешенства, полученного путем адаптации вакцинного штамма ERA к культуре клеток ВНК-21.

Одним из авторов и разработчиков штамма был известный в нашей стране и за рубежом рабиолог, доктор медицинских наук Сергей Васильевич Грибенча (18.10.1937 – 30.04.2016).
Он внёс существенный вклад в изучение биологических вариаций лиссавирусов, патогенеза, современных методов диагностики и профилактики бешенства.

Штамм ERA-CB20M характеризуется высокой иммуногенностью, обладает высокой степенью гомологии по нуклеопротеидному и гликопротеидному белкам к штаммам уличного вируса бешенства, циркулирующих на территории РФ и стран СНГ.

В опытах на восприимчивых животных было установлено, что поствакцинальный иммуногенез индуцированный вакцинами «Рабикс» и «Рабифел» по сравнению с имеющимися аналогами характеризуется более эффективной стимуляцией не только гуморального, но и клеточного звена иммунного ответа, а также большей его специфичностью. Количественно это выражалось в повышенном содержании не только IgG1-, но и IgG2а- антител, а также уровня ИФН-γ и ИЛ-2, являющихся активаторами ЦТЛ. Так после второй вакцинации уровень вирус-нейтрализующих антител в сыворотке крови восприимчивых животных достигал 14,58±1,15 МЕ/см 3 (песцы), 6,83±1,32 МЕ/см 3 (собаки) и 7,24±2,32 МЕ/см 3 (кошки) что существенно превышало установленный OIE минимальный протективный показатель – 0,5 МЕ/см 3 .

Кроме того, наблюдалось количественное уменьшение уровня ИЛ-4 и ИЛ-5 – цитокинов, индуцируемых иммунной системой при возникновении воспалительных процессов, и в данном случае это отражает большую безопасность данных вакцин для организма собак и кошек.

Вакцины «Рабикс» и «Рабифел» обеспечивали защиту белых мышей после их интрацеребрального заражения референтным штаммом вируса; индекс иммуногенности вакцин составлял 1,25 – 1,64 МЕ/ см 3 , оставаясь при этом на сопоставимом уровне в течение 18 месяцев после их изготовления.

Ретроспективный пятилетний анализ антирабической истории привитых собак и кошек показал отсутствие каких-либо отклонений в состоянии здоровья (поведенческие реакции, аппетит, угнетенность и т.д.) и побочных эффектов от применения данных вакцин.

Результат исследований по оценке напряженности антирабического иммунитета позволяет ответить на основной вопрос: заболеет ли человек или животное после инфицирования вирусом бешенства?

Оценка напряженности антирабического иммунитета осуществляется методом количественного определения уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке крови восприимчивых животных (FAVN). Защитным уровнем считается титр антител ≥ 0,50 МЕ/мл.

С 2006 года лаборатория АНО «НИИ ДПБ» ежегодно успешно проходит аккредитацию в референтном центре по бешенству OIE Nancy Laboratory for Rabies and Wildlife ANSES (Франция) и имеет право проводить серологические исследования и выдавать Международные антирабические сертификаты.

В нашей лаборатории за период 2006 – 2016 гг. методом FAVN было исследовано более 900 проб сывороток крови собак и более 400 проб сывороток крови кошек, различного пола, возраста и породы и показано, что такие факторы, как вид животного, порода, кратность вакцинации, а также индивидуальные особенности иммунной системы оказывают существенное влияние на его формирование иммунитета. Так у 19% собак и у 5 % кошек после однократной вакцинации независимо от типа антирабических вакцин, в т.ч. известных зарубежных производителей, титр вируснейтрализующих антител был менее 0,5 МЕ/ см 3 , т.е. ниже протективного уровня (за рубежом процент таких животных составляет 7 и 2 соответственно). При этом наибольшее число таких случаев отмечено у собак декоративных пород.

Приведенные факторы, оказывающие влияние на формирование антирабического иммунитета, должны учитываться при вакцинации собак и кошек, для чего рекомендуется проводить оценку содержания вируснейтрализующих антител, особенно у животных из неблагополучных по бешенству территорий.

Президент АНО «НИИ ДПБ»,
профессор, д.б.н.
Верховский О.А.

Зав. отделом диагностики, терапии и профилактики инфекционных болезней,
к.в.н.,
Непоклонова И.В.

Все серологические исследования по определению титра антирабических антител у всех видов млекопитающих можно сделать в нашей лаборатории и получить международный антирабический сертификат . С точки зрения безопасности животных и их хозяев такие исследования очень важны, даже если вы не уезжаете за границу, а просто едете со своим питомцем в деревню или на дачу.

Всю необходимую информацию вы можете получить

источник

Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях Акиньшина Татьяна Викторовна

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Акиньшина Татьяна Викторовна. Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях : Дис. . канд. биол. наук : 03.00.23 : Щёлково, 2005 141 c. РГБ ОД, 61:05-3/1315

2.1. Морфология вируса бешенства 11

2.2. Химический состав вируса бешенства 15

2.3. Очистка и концентрирование вируса бешенства 21

2.4. Диагностика бешенства 25

2.5. Выделение антивидовых иммуноглобулинов и получение конъюгатов с пероксидазой хрена для иммунофериментного анализа 29

2.5.1 Выделение имуноглобулинов 30

2.6. Анти-идиотипические (анти-ИД) антитела 31

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 36

3.2. Результаты исследований 41

3.2.1. Очистка и концентрирование вируса бешенства 41

3.2.2.Биологические и физико-химических свойства очищенного и концентрированного культурного вируса бешенства 52

3.2.3. Выделение гликопротеина и нуклеопротеида вируса бешенства 58

3.2.4. Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных препаратов кулътурального вируса бешенства 63

3.2.4.1. Серологические методы диагностики бешенства 63

3.2.4.2. Иммуноферментный анализ для определения уровня антирабических антител.

3.2.4.2.1. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки крови крупного рогатого скота 67

3.2.4.2.2. Получение анти-IgG-KPC из гипериммунной сыворотки и выделение из нее антивидовых иммуноглобулинов 69

3.2.4.2.3. Меченые антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG-KPC) ферментом пероксодазой 70

3.2.5.Гуморальный иммунитет при вакцинации культуральной антирабической вакциной 71

3.2.6. Поликлональные антиидиотипические антитела к вирусу бешенства. 74

3.2.7. Тест-система для индикации вируса бешенства и антирабических антител методом ИФА 82

3.2.7.1.Конъюгат с пероксидазой хрена (ПО) в титровании методом ИФА антирабических антител 83

3.2.7.2.Протеин A (Staphylococcus Aureus) в титровании методом ИФА антирабических антител 88

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 108

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109

К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека — бешенства. Борьба с бешенством была и остается проблемой медицины и ветеринарии. Эту проблему значительно осложнило отмеченное в последние десятилетия возрастание роли диких животных в распространении болезни. По данным ВОЗ (Expert committee on rabies, 1992) в мире ежегодно регистрируют более 50 тысяч случаев гибели людей и более 1 миллиона животных от бешенства. Сложная эпидемическая и эпизоотологическая ситуации по бешенству в последние годы наблюдаются более чем в 110 странах мира (20, 21, 89).

По оперативным данным ФГУ «Центрветеринарии» (лаборатории эпизоотологии ВИЭВ) в течение первой половины 2005г. на охваченной эпизоотией территории РФ были выявлены 386 неблагополучных пунктов по бешенству. В Московской области были выявлены 6 эпизоотических очагов. Этот процесс в мире не имеет тенденции к затуханию, напротив, поражаются все новые, ранее благополучные районы (12, 21).

Вирус бешенства, несмотря на то, что методика получения антирабической вакцины была разработана Л.Пастером более 100 лет назад и с тех пор достигнуто многое в изучении этого заболевания, остается предметом изучения многих исследователей. В основном, это практические аспекты: изготовление и применение вакцин, разработка методов репродукции вируса бешенства в тканевых культурах и создание диагностикумов.

Вирус бешенства, репродуцированный в культуре ткани, используется в качестве исходного материала при изготовлении антирабических вакцин и диагностикумов. Вакцины и диагностикумы, изготавливаемые из культуральных вируссодержащих суспензий, содержат небольшое количество специфического антигена в сравнений с множеством сопутствующих балластных белков, так как при промышленном изготовлении обычно используют неочищенный вируссодержащий материал. Поэтому внимание исследователей привлекает разработка методов получения очищенного и концентрированного вируса. Такой препарат представляет собой материал для изготовления надежной и эффективной вакцины против бешенства, обладающей высокой иммуногенностью, и более чувствительных диагностикумов, не дающих побочных неспецифических реакций (24, 25,27,44).

Исследование структурных компонентов, нуклеопротеида и гемагглютинина, вируса бешенства представляет не только теоретический, но и практический интерес. В связи с этим важным представляется вопрос выделения и изучения их биологических свойств. На основании данных молекулярной структуры вируса бешенства установлено, что основным протективным белком является гликопротеин, содержание которого коррелирует с иммуногенностью антирабических вакцин. Поэтому перспективным является разработка теста in vitro, основанного на определении содержания протективного антигена — гликопротеина, коррелирующего с иммуногенностью (51). Изучение этого вопроса может создать предпосылки для практического применения компонентов вируса в составе вакцин и диагностикумов, чистых и высокоэффективных.

Ускоренные методы вирусологической диагностики, такие как иммуноферментный анализ, обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами серологической диагностики. Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность является действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Быстрота и простота постановки этого теста делают его удобным для исследования динамики инфекции в очагах заболевания, а полученная информация может служить ориентиром для принятия соответствующих мер по предупреждению и распространению инфекции.

При организации целенаправленных профилактических мероприятий необходим контроль за иммунным состоянием вакцинированных против бешенства животных. Уровень антител в сыворотках животных определяется несколькими методами. Трудность выбора состоит в том, что большинство методов не всегда достаточно стандартизировано.

Таким образом, создание тест-системы для ускоренной индикации вируса и определения уровня антирабических антител в сыворотке иммунизированных культуральной антирабической вакциной животных является на сегодняшний день важной и актуальной задачей.

1.2. Цель и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось создание реагентов на основе очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства для постановки серологических реакций, а также высокочувствительных и специфичных компонентов для иммуноферментного анализа при оценке эффективности поствакцинального иммунитета у животных, вакцинированных антирабической вакциной.

Решались следующие задачи:

1.2.1. Получить очищенные и концентрированные препараты вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, штамм Щелково-51.

1.2.2. Выделить структурные компоненты вируса бешенства нуклеопротеид и гемагглютинин

1.2.3. Испытать антигены вируса бешенства, полученные на базе очищенных и концентрированных препаратов, в качестве компонентов для постановки серологических реакций при определении уровня антител в сыворотках вакцинированных животных.

1.2.4. Получить антирабические сыворотки на лабораторных животных, выделить IgG различных животных, получить анти-IgG сыворотки на кроликах и выделить анти-IgG из них, получить конъюгат пероксидазы из хрена с анти- IgG и сравнить его с протеином А.

1.2.5. Изучить напряженность гуморального иммунитета и антиидиотипические поликлональные антитела к вирусу бешенства на лабораторных животных.

1.2.6. Разработать тест-систему для иммуноферментного анализа, оценку эффективности поствакцинального иммунитета у животных при бешенстве и провести сравнительную оценку определения уровня антирабических антител в традиционных серологических реакциях и ИФА.

В процессе работы были модифицированы и усовершенствованы методы очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, ранее разработанные в отделе молекулярной биологии ВНИТИБП. Выделены структурные компоненты вируса бешенства — гемагглютинин и . нуклеопротеид. Подтверждено, что гемагглютинин вызывает интенсивное образование вируснейтрализующих антител в крови иммунизированных животных и является компонентом, ответственным за иммуногенную активность вириона и может быть применен в качестве антигена при определении уровня вируснейтрализующих антител.

Показана возможность повышения чувствительности серологических реакций РДСК при применении концентрированного вируса ПЭГ М-3000, и РИГА, концентрированного на геле фосфата алюминия и ультрацентрифугированием.

Установлена корреляция между показаниями активности сывороток при постановке ИФА с добавлением коньюгата с пероксидазой и с протеином А. Изучен гуморальный иммунитет на уровне образования антирабических антител, относящихся к классам IgM и IgG и его подклассам.

Получены антиидиотипические антитела, содержащие внутренний образ антигена бешенства и способные индуцировать иммунный ответ у животных в отсутствии вирусного антигена.

1.4. Практическая значимость.

На основании модифицированных ранее разработанных во ВНИТИБП методов очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, созданы антигены для определения в серологических реакциях уровня антирабических антител в сыворотках животных в реакции связывания комплемента, непрямой гемагглютинации, а также применяемые в качестве компонентов для иммуноферментного анализа и показавшие высокую эффективность в реакциях. Методической комиссией ВНИТИБП утверждены 4 методики по получению антигенов для серологических реакций.

Разработаны компоненты и создан набор для иммуноферментного анализа репродукции антирабических антител в сыворотке крови животных. НТД на набор утверждается в общепринятом порядке.

Впервые морфологию вируса бешенства при помощи электронной микроскопии негативно окрашенных неочищенных препаратов, полученных из инфицированных клеток почки хомяка, изучал в 1962г. Almeida J. и др. (99).

Кроме того, в том же году Matsumoto S.(185) исследовал морфологию вируса в нервных клетках мышей, инфицированных уличным вирусом бешенства. Вирус бешенства имеет форму пули с одним округлым и другим плоским концом (37,123,151,161). На плоском конце, не прикрытым наружной оболочкой, как правило, имеется выемка. Общая схема строения рабдовирусов представлена на рис. 1.

Длина и диаметр вирусной частицы имеют размеры 170-200×70-90 нм (224). Поверхность вириона имеет небольшие выступы, диаметр которых 4,5-5,5 нм, длина 6-7нм. Какой-либо регулярной структуры на его поверхности обнаружить чаще всего не удается. Однако Hummeler К. и др. (151) отмечает, что на некоторых негативно окрашенных препаратах вируса поверхность его кажется составленной из правильных шестиугольников. Полная вирусная частица на продольном срезе, как и все рабдовирусы, похожа на пулю, имеющую две мембраны различной плотности. Более плотная наружная мембрана не закрывает плоский конец, что хорошо заметно на продольном срезе. На плоском конце вириона имеется осевая полость, которая может иметь глубину до 1/2 общей длины вириона. По данным ряда исследователей плотность вириона 1,16-1,20г/см3, константа седиментации 600 S, молекулярная масса (ММ) 475×106 дальтон (Д) (13,176,237).

Внутри вириона находится спиральный нуклеокапсид (нуклеопротеид), состоящий из РІЖ и внутреннего белка. Нуклеопротеид (НП) вируса бешенства представляет собой спирально свернутую вправо лентообразную нить, построенную из белковых субъединиц, скрепленных рибонуклеиновой кислотой (153,212) (рис.2).

В нуклеопротеиде содержится 4% РНК к 96% белка. По данным Sokol F. (238,240) плавучая плотность его 1,32 г/см3, константа седиментации 200S, молекулярная масса 1,5×10 Д (13).

Нуклеопротеид вируса бешенства активен только в реакции связывания комплемента и не обладает гемагглютинирующей активностью (238). В реакции нейтрализации нуклеопротеид вызывает образование очень небольшого количества вируснейтрализущих антител (266). Защитной активностью препарат нуклеопротеида практически не обладает. Таким образом, нуклеопротеид вируса бешенства при введении в организм животного способен индуцировать образование антител, активных только в реакции связывания комплемента и иммунофлуоресценции (153,176).

РНК вируса бешенства имеет молекулярный вес 4,6×106Д и константу седиментации 45S (96,238). До сих пор никому еще не удалось выделить РНК вируса бешенства, которая была бы инфекционна, поэтому принято считать, что она неинфекционна.

ВирионЫ бешенства могут быть представлены короткой формой в виде колокольчиков. По своей структуре они во всем сходны с полным вирусом и. похожи на усеченные Т-частицы вируса везикулярного стоматита (134,148,149,210).

Некоторые исследователи (97,136,179,211,268) считают, что частицы пулеобразной формы являются результатом рассечения бациллярных частиц при приготовлении тонких срезов культуры клеток, инфицированных вирусом или полностью отпочковавшимися от клеточной мембраны частицами (рис. 3).

Интересное предположение о механизме образования коротких частиц, одновременно объясняющее и происхождение пулеобразной формы вирионов, высказал Lee Р. (171). Он считает, что в определенном, легко уязвимом месте, бациллярная вирусная частица размером 260×80 нм разрывается и в результате образуются два фрагмента длиной 170 и 90 нм которые идентифицируются как полные и укороченные вирусные частицы.

Знание качества и количества компонентов вируса бешенства является необходимым условием понимания их взаимодействия, определяющего стабильность структуры вируса и его биологические свойства.

Элементарный химический состав вирусов в общих чертах не отличается от состава клеток животных, растений и микробов (82). В этом отношении у вирусов установлена только одна особенность: если у клеток животных, растений и микроорганизмов химический состав довольно постоянен, то у вирусов он вариабелен.

По химическому составу вирусы делят на две большие группы. Вирусы, содержащие белок, нуклеиновую кислоту и зольный остаток, относятся к простым и образуют группу так называемых минимальных вирусов (вирусы ящура, полиомиелита, реовирусы и др.). Вирусы, в состав которых входит белок, нуклеиновая кислота, зольный остаток, липиды и углеводы, составляют группу сложноустроенных (рабдовирусы, миксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и др.).

Вирус бешенства относится к группе сложноустроенных вирусов. Он содержит белок, РНК, липиды и углеводы (114). Общий химический состав штамма HEP Flury представляет собой следующее (в процентах сухого веса вируса): белка 67,0 ± 3,6%, РНК — 3,9 ± 0,6%, углеводов, связанных с белком, 2,9% липидов- 25,8 ± 1,5%, общая масса нерастворимого осадка 73,8 ± 3,6% (223).

В составе углеводов, связанных с белком, обнаружили (в процентах: сухого веса вируса): глюкозамин — 1,0%, галактозамин — 0,3%, гексозу — 0,7%, фукозу — 0,1%), сиаловую кислоту — 0,8%) (223).Высушенные препараты очищенного вируса содержат 5,5% нейтральных и 19,5% полярных липидов. Холестерол является мажорным нейтральным липидом. Фосфолипиды составляли 11,2%, а гликолипиды- 4,6% вирусной массы. Остальные 3,7% липидов идентифицировать не удалось.(124).

Гликолипиды оболочки вируса бешенства и клетки хозяина, как выяснилось, идентичны (223). Предполагают, что вирусные белки играют специфическую роль в избирательном включении липидов в процесс сборки вирусной частицы (135,163).

РНК вируса бешенства представлена единой нефрагментированной молекулой нуклеиновой кислоты (минус-нить), что и объясняет отсутствие биологической активности у РНК, выделенной из вируса бешенства, то есть такая РНК не способна инициировать инфекционный процесс и функционировать в качестве информационной РНК (31,96,186). Длина РНК вируса 460 нм, константа седиментации 45 S, плавучая плотность 1,66 г/см3, ММ=4,4-4,6х106 Д (96,107,150,237). Количественное соотношение нуклеотидов в РНК разных штаммов практически одинаково, в среднем в молекуле РНК содержится 25,5 — 26,3 (0,9%) адениловой кислоты, 28,1 — 29,7 (0,4%) уридиловой кислоты, 20,6 — 24,1 (1,2%) гуаниловой кислоты, 21,7 — 23,8 (1,5%) цитидиловой кислоты (Імоль на ЮОмоль нуклеотидов) (96,151,176,222,230,240,262). РНК вируса бешенства соединена с белками, которые позволяют ей свободно образовывать спиральные витки, то есть формировать структуру — комплекс, именуемый рибонуклеопротеидом (РНП), нуклеокапсидом (НК) или нуклеопротеидом (НП), составляющим 14% общей массы вириона (рис. 2).

Каждый виток спирали состоит из 12 белковых молекул размером 9 3 3 нм, что составляет примерно 1850 молекул белка на всю РНК. Субъединицы расположены радиально по отношению к длине рибонуклеопротеида, который представлен спиральной структурой, имеющей 34-35 витков, причем диаметр 4-5 витков уменьшен на закругленном пулевидном конце. Такая организация нуклеокапсида довольно нестабильна, так как даже длительное хранение вируса при +4 иногда вызывает разворачивание спирали нуклеокапсида в более рыхлую структуру (31).

Работа выполнена в 2002-2005 г.г. в лаборатории молекулярной биологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2000-2005г., в соответствии с плановой научно-исследовательской тематикой.

3.1.1.Вирус бешенства. В работе был использован фиксированный вирус бешенства, штамм Щелково-51,репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13. Титр инфекционности вируссодержащего материала, использованного в работе, был 5,5-6,51gLD5o/.M.T Суспензию вирусного материала хранили при температуре -50С.

3.1.2. Концентрирование вирусов методом ультрафильтрации проводили на УФ ячейках ФМО2-200 и ФМО2-1000 с использованием ядерных фильтров, полученных из лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна).

3.1.3. -г центрифугирование в работе использовали, линейный градиент CsCI, сахарозы и глицерина. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL (Польша) по составленным калибровочным кривым.

3.1 А.Контрольные антигены получали в тех же условиях, что и вирус, но без добавления последнего (с п.3.1.1 по 3.1.3.)

3.1.5.Инфекционную активность препаратов вируса бешенства определяли титрованием на 4-5-недельных мышах массой 10-12г, заражая их интрацеребрально по 0,03мл препарата. Число павших от специфических причин мышей (паралич, судороги, гибель) учитывали с 6 по 1 Ідень заражения.

Титр инфекционности вирусов рассчитывали по методу Ашмарина И.П. и др.

3.1.6.Белок определяли по методу Лоури и др. (177) и на спектрометре СФ-26. Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.

3.1.7.Комплементсвязывающую активность вируса бешенства определяли по микрометоду Soulebot J и др.(245), с оценкой реакции по общепринятой крестовой системе. За титр комплементсвязывающей активности принимали высшее разведение антигена или сыворотки, вызывающее частичный гемолиз эритроцитов (на 2+).

3.1.8.Преципитирующую активность определяли по методу Ouchterlony L. в 1,0% агаре «Дифісо» (206).

За титр преципитирующей активности принимали высшее разведение антигена или сыворотки, дающее выраженную полосу преципитации.

3.І.Я.Гемагглютинирующую активность вируса бешенства определяли по микрометоду Kuwer Е. (170) с эритроцитами гуся.

За титр гемагглютинирующей активности вируса бешенства принимали высшее разведение вируса, агглютинирующее эритроциты на 1+.

3.1.10. Титр вируснейтрализующих (ВН) антител в антирабических сыворотках определяли следующим образом: к двукратным разведениям сыворотки приливали равный объем определенного разведения вируса (для мышей количество вируса соответствовало 100LD50/W). Затем инкубировали 1ч при +37С и заражали этими разведением интрацеребрально мышей весом 10-12г. В качестве контроля брали десятикратные разведения вируса СVS, также прогретого 1ч при +37С. За титр ВН-антител принимали последнее разведение сывороток, предохраняют) 50% животных.

3.1.11 .Гемагглютинин вируса бешенства выделяли по методу Schneider L. и др. (189) из очищенного и концентрированного препарата. Для этого вирусную суспензию после высокоскоростного центрифугирования обрабатывали 5% сапонином, добавляя его до конечной концентрации 1мг/мл, и инкубировали 20мин при +37С. Затем проводили очистку концентрирование гемагглютинина при помощи равновесного центрифугирования на «подушке» хлористого цезия плотностью 1,29г/см , в течение 4,5ч при ЗООООоб/мин (90000g) и собирали нижний слой, содержащий гемагглютинин.

3.1.12.Нуклеопротеид вируса бешенства получали по методу Socol F. (240), которой заключается в разрушении вирионов бешенства при помощи дезоксихолата натрия (ДХН) и выделении нуклеопротеида. Согласно этому методу, обрабатывали очищенный и концентрированный вирус ДХН в концентрации 5мг/1000 ГАЕ (гемагглютинирующих единиц) в течение Юмин при +20С. Для отделения нуклеопротеида от белков оболочки и не полностью разрушенных вирионов обработанный вирус фракционировали при помощи высокоскоростного центрифугирования. Разрушенный вирус наслаивали на 10-28% линейный градиент сахарозы и центрифугировали 2ч при 22500об/мин (60000g) и собирали фракции. В нижней фракции содержались не разрушенные вирионы, в верхней — белки оболочки, а в средней — нуклеопротеид. Среднюю,, содержащую нуклеопротеид, фракцию диализовали 18ч против бурного ФР при +44С. Затем препарат концентрировали в 3 раза диализом против ПЭГ и центрифугировали на «подушке» хлористого цезия плотностью 1,32г/см , 24ч при 40000 o6/MHH(125000g). После центрифугирования собирали нижнюю фракцию и диализовали 18 ч против буферного ФР при +4С.

источник