Определение вируснейтрализующих антител при бешенстве

Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

источник

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, касается определения антирабических вируснейтрализующих антител методом ингибиции фокусов флуоресценции. Исследуемую сыворотку смешивают с равным объемом аттенуированного штамма вируса бешенства ТС-80. Инкубируют в течение 90 мин при 37 o С. После этого реакционную смесь вносят в перевиваемую культуру клеток почки сайги. Затем культуру клеток фиксируют и наносят антирабические иммуноглобулины, меченные ФИТЦ. Реакцию оценивают по ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток. Технический результат изобретения заключается в разработке безопасного, чувствительного, быстрого и экономически выгодного способа определения антирабических вируснейтрализующих антител in vitro, имеющего корреляцию с результатами титрования на белых мышах. 1 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу определения антирабических вируснейтрализующих антител методом ингибиции фокусов флуоресценции и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и в ветеринарных лабораториях.

Известны, более 15 методов in vivo и in vitro для определения антирабических вируснейтрализующих антител (Blancou J.J., Sureau P., 1985; Ботвинкин А. Д., 1988; Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., 1991; Сологуб Т.В., Никишин И.В., 1992; и др.). Наиболее распространенными до сих пор являются различные модификации реакции нейтрализации in vivo — на мышах, разработанной Webster & Dawson (1935 г.). Однако, несмотря на доказанные временем и практикой преимущества данного теста, он имеет некоторые недостатки: использование инфекционного вируса «CVS», проведение опыта в виварных помещениях в течение 15-21 суток, относительно дорогая стоимость животных. В связи с этим комитет экспертов ВОЗ по бешенству с 1973 г., в своих докладах подчеркивает важность разработки тестов in vitro (СТД ВОЗ: 523, 709, 824). Для относительной оценки уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке животных применяется иммуносорбентный метод — ELISA (Guillemin P., Tixier G. (1981), Nicholson Karl G. (1982), Smith J. S. (1984), Karamany R.M. (1988), Ботвинкин А.Д. (1988), Lyng Jorn; Bentzon M. Weis; Fitzgerald E.A. (1989), Сазанова Э.Я. (1991)). Этот тест может выполняться в практических условиях, и результаты могут быть получены в течение нескольких часов. Однако, кроме вируснейтрализующих антител, этот метод определяет также различные антитела других типов, при этом отсутствует их корреляция с тестом нейтрализации in vivo на мышах. Прототипом настоящего изобретения являются методы ингибиции фокусов флуоресценции, выполненные на различных культурах клеток с разными штаммами вируса бешенства J. G. Debbie et al., (1972) — использовали штамм ERA в культуре клеток ВНК-21; Smith J. S., Yager P. A., Baer G.M., (1973) — использовали штамм «CVS-11», культивируемый в культуре клеток BHK-21/S13; Louie R. E. et al., (1975), Zalan E., Wilson С., Pukitis D., (1979) — штамм «CVS-27» в ВНК. Аналогичные штаммы и культуры клеток применяли при постановке реакции Seroka D. Labunska E. (1981); Kurz J. et al. (1986); Lyng J., Bentzon M. , Fitzgerald E.A. (1989) и др. Zavadova J., Svrcek S., Madar M., Durove A. (1996) использовали штамм Внуково 32/107, культивируемый в ВНК-21/с13. Принцип постановки реакций у перечисленных авторов идентичен и заключается в том, что разведения образцов сывороток смешивают с равным объемом вируса и инкубируют при 37 o C в течение 90 минут, после этого реакционную смесь вносят в соответствующую культуру клеток и инкубируют 72 часа при 37 o C, затем культуру клеток фиксируют, наносят антирабические иммуноглобулины конъюгированные с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ-конъюгат) и проводят учет реакции. Однако авторы оценивают полученные результаты как не полностью коррелирующие с результатами реакции нейтрализации на мышах. В отечественной литературе материалов и результатов подобных исследований нет. Целью предполагаемого изобретения является разработка способа определения антирабических вируснейтрализующих антител in vitro, имеющего корреляцию с результатами титрования на белых мышах.

Поставленная цель достигается тем, что используют вакцинный штамм ТС-80, адаптированный к культуре клеток почки сайги (ПС), на которой проводят инкубирование реакционной смеси вирус-сыворотка в течение 72 часов, с последующим определением титра вируснейтрализующих антител по ингибиции фокусов флуоресценции Примеры конкретного выполнения Пример 1 Испытуемые сыворотки, полученные от вакцинированных животных, подвергали инактивации в условиях водяной бани при 56 o C в течение 30 мин. Затем готовили двухкратные разведения сывороток на среде Игла MEM в объеме 100 мкл. Разведенные сыворотки смешивали с равными объемами культурального вируса бешенства шт. ТС-80, содержащим 100 — 1000 БОЕ₅₀. Приготовленную таким образом смесь вирус-сыворотка инкубировали в течение 90 мин при 37 o C в CO₂-инкубаторе с содержанием 5% углекислого газа и вносили в односуточную интактную культуру клеток ПС, выращенную на полистироловых пластинах, предварительно удалив из лунок культуральную среду.

Пластины помещали в CO₂-инкубатор на 72 часа. Контролями служили: лунки с используемой дозой вируса, смесью вируса с заведомо положительной (специфической) сывороткой и отрицательной (нормальной), а также интакной культурой клеток.

По окончании срока инкубации монослой клеток подвергали фиксации 12,5% раствором формалина в течение 15 минут при -4 o C.

После фиксации панели отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) с 0,05% содержанием Твина-20 и наносили конъюгат антирабических иммуноглобулинов с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ). Пластины с ФИТЦ-конъюгатом инкубировали в течение 30 мин, после чего панели трижды подвергались отмывке от несвязавшегося конъюгата в ЗФР с 0,05% содержанием Твина-20.

Тест-препараты просматривали на инвертированном люминесцентном микроскопе Olympus IMT-2. Отсутствие флуоресцирующих фокусов (при условии наличия последних в препаратах с контролем вируса и нормальной сывороткой) указывает на наличие в тест-материале специфических антирабических вируснейтрализующих антител. Титром антител в испытуемом материале является предельное разведение сыворотки, при котором наблюдается полное подавление флуоресцирующих фокусов, т.е. нейтрализация вируса.

Пример 2 Подготовку испытуемых сывороток с последующим приготовлением смеси вирус-сыворотка проводили аналогично методике, описанной выше. По истечении срока инкубирования образцы сывороток вносили в лунки полистироловых панелей. После этого в каждую лунку панелей вносили 100 мкл суспензии культуры клеток ПС в концентрации 500 тыс. клеток/см 3 с расчетом по 50 тыс. клеток на лунку, после чего пластины помещают в CO₂-инкубатор на 72 часа. Последующие этапы реакции проводились согласно предыдущей методике. При проведении работы результаты обоих примеров были аналогичны.

Результаты исследования сыворотки крови реакцией нейтрализации на мышах и предлагаемым нами способом в культуре клеток ПС были идентичны. В таблице 1 приведены результаты, полученные в комиссионном опыте при определении вируснейтрализующих антител в сыворотках крови КРС, лошадей и собак.

Тест ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток ПС прост в исполнении, безопасен в виду использования вакцинного штамма ТС-80, обладает большей производительностью, экономически эффективен и может быть использован при определении напряженности иммунитета у вакцинированных животных.

Полученные результаты исследования сывороток крови показывают, что предлагаемый способ позволяет определять титр вируснейтрализующих антител in vitro (в культуре клеток ПС), соответствующий результатам реакции нейтрализации на мышах. Данный способ прост в исполнении, экспрессен, безопасен, высокочувствителен и в силу полного соответствия с результатами реакции нейтрализации in vivo может полностью заменить тест нейтрализации на мышах.

Способ определения антирабических вируснейтрализующих антител, включающий взаимодействие компонентов реакционной смеси вируса со специфической сывороткой, оцениваемое по ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток, отличающийся тем, что используют аттенуированный штамм ТС-80 вируса бешенства, адаптированный к высокочувствительной к этому штамму культуре перевиваемых клеток почки сайги.

источник

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, конкретно к способу титрования вируснейтрализующих антител против бешенства в сыворотке крови вакцинированных животных. Сущность способа состоит в том, что проводят взаимодействие вакцинного вируса бешенства штамма 71 БелНИИЭВ-ВГНКИ с исследуемыми сыворотками, реакционную смесь вирус-сыворотка инкубируют 60 мин при 37°С, вносят суточную интактную культуру клеток почки сайги и помещают в СО₂ инкубатор с последующим определением на 5-7 сутки титра вирус-нейтрализующих антител по предельному разведению сыворотки, при котором наблюдалось 50% подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток. Техническим результатом является разработка чувствительного, более технологичного и экономически обоснованного способа титрования антирабических вируснейтрализующих антител. 2 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу титрования вируснейтрализующих антител против бешенства в сыворотке крови вакцинированных животных, основанному на ингибиции цитопатического действия (ЦПД) вируса бешенства в культуре клеток, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Наиболее распространенным тестом определения антирабических вируснейтрализующих антител в крови животных является реакция нейтрализации на мышах, разработанная еще в 1935 г. (Webster L., Dawson J. Diagnosis of rabies by mouse inoculation. Measurement of humoral immunity to rabies by mouse protection test // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. — 1935. — Vol.32. — P.570-573). Однако несмотря на доказанные временем и практикой преимущества данного теста, он имеет некоторые недостатки: проведение исследования в течение 15-21 суток, относительно дорогая стоимость животных и использование живого вируса, что связано с опасностью для исследователя.

В настоящее время для титрования антирабических антител in vitro разработаны и применяются различные методы.

Для мониторинга уровня специфических антител в сыворотке крови привитых животных, в частности, применяется твердофазный иммуноферментный анализ (ТФ ИФА) (Nicholson K.G., Prestage H. Enzyme-linked immunosorbent assay: A rapid reproducible test for the measurement of rabies antibody // J.Med.Virol. — 1982. — Vol.9, №1. — P.43-49; Smith J.S., Karamany R.M., Kazar J., Malik S.A., Badriya M. Rapid quantitative assay of rabies post-vaccination antibody by ELISA //APMIS. — 1988. — Vol.96, №3. — P.40-43.; Ботвинкин А.Д. Обнаружение антител к вирусу бешенства с помощью ИФА в пробах крови собранных на бумажные диски// Лабораторное дело. — 1988. — №3. — С.73-75; Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., Маслов Е.В., Боцко А.А. Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определение уровня антител // Ветеринария. — 1991. — №8. — С.62-64). Данный тест может выполняться в практических условиях, и результаты могут быть получены в течение нескольких часов. Однако, кроме вируснейтрализующих антител, этот метод определяет также различные антитела других типов, при этом отсутствует корреляция результатов с данными реакции нейтрализации на мышах.

Для определения вируснейтрализующих антирабических антител применяется реакция ингибиции фокусов флуоресценции, выполненная на перевиваемых культурах клеток ВНК-21, почки сайги (ПС) с использованием вируса бешенства, штаммы ERA, CVS, Внуково-32/107, ТС-80 (Zaian E. et. al. A microtest for the quantitation of rabies virus neutralising antibodies // J. Biol. Stand. — 1979. — №7. — P.213-220; Lyng J. Potency assay of antibodies agains rabies. A report on a collaborative study// J.Biol. Stand. — 1989. — Vol.17, №3. — P.267-280; Сологуб Т.В. Разработка и совершенствование средств и методов диагностики бешенства// дисс. канд. биол. наук. — Покров, 1993; Zavadova J. et. al. Titration of antibodies by rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT)// Veter. Med. (Praha). — 1996. — Vol. 41, №.7. — P.225-230; Недосеков В.В. с соавт. Титрование антирабических антител с помощью теста ингибиции фокусов флуоресценции //Ветеринария. — 1998. — N. 7. — 28-30 и др.).

Принцип постановки реакции в приведенных источниках практически идентичен и заключается в том, что разведения сывороток смешивают с равным объемом вируса и инкубируют при 37°С в течение 90 минут, после чего реакционную смесь вносят в соответствующую культуру клеток и инкубируют 72 часа при 37°С. Затем культуру клеток фиксируют, обрабатывают антирабическими иммуноглобулинами конъюгированными с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ-конъюгат) и посредством люминесцентной микроскопии проводят учет реакции.

Предложенные методы предполагают фиксацию клеток формалином или ацетоном, которые представляют собой токсичные препараты, и использование высокоспецифичных антирабических иммуноглобулинов, конъюгированных с флуоресцеинизотиоционатом, что несколько усложняет технологию тестирования сывороток крови животных и повышает себестоимость анализа.

Прототипом настоящего изобретения является разработанный нами ранее тест ингибиции фокусов флуоресценции, включающий взаимодействие компонентов реакционной смеси (вируса бешенства, штамм ТС-80, со специфической сывороткой) в течение 90 мин, оцениваемое по ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток ПС (Недосеков В.В. с сотр. Титрование антирабических антител с помощью теста ингибиции фокусов флуоресценции // Ветеринария. — 1998. — №7. — С.28-30. Пат. №2130187 RU).

Целью предлагаемого изобретения является разработка чувствительного, более технологичного и экономически обоснованного способа титрования антирабических вируснейтрализующих антител, имеющего корреляцию с результатами титрования антител в тесте ингибиции фокусов флуоресценции.

Поставленная цель достигается тем, что используется вакцинный штамм 71БелНИИЭВ-ВГНКИ (РБ-71), адаптированный к культуре клеток ПС, в которой проводится инкубирование реакционной смеси вирус-сыворотка в течение 60 мин, с последующим определением, на 5-7 сутки, титра вируснейтрализующих антител по ингибиции цитопатического действия вируса в культуре клеток ПС.

В отечественной литературе материалов и результатов подобных исследований нет.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Испытуемые сыворотки, полученные от вакцинированных животных, инактивировали при 56°С в течение 30 мин, затем в 96-луночных панелях для микрокультивирования готовили двукратные разведения на среде Игла (MEM) в объеме 50 мкл. Разведенные сыворотки смешивали с равным объемом культурального вируса бешенства, шт. РБ-71, содержащим 50-100 ККИД₅₀ (рабочее разведение). Приготовленные таким образом реакционные смеси инкубировали в течение 60 мин при 37°С, после чего вносили в односуточную интактную культуру клеток ПС, выращенную в 96-луночных панелях, предварительно удалив из лунок культуральную среду.

Панели помещали в СО₂-инкубатор (при 37°С с содержанием 5% углекислого газа и 95% влажности). Контролями служили лунки с используемой дозой вируса, смесью вируса с заведомо положительной (специфической) и отрицательной (нормальной) сыворотками, а также интакной культурой клеток.

Начиная с 4 суток культуру клеток в панелях просматривали при помощи инвертированного светового микроскопа Olympus, увеличение х40-80. В лунках с контролем вируса и нормальной сывороткой наблюдалось ярко выраженное ЦПД, которое характеризовалось набуханием пораженных клеток ПС, их округлением с появлением зернистости в цитоплазме, последующим разрушением и отделением от стекла, в то же время в лунках со специфической сывороткой ЦПД не проявлялось (нейтрализация вируса), что указывает на наличие в испытуемых сыворотках антирабических вируснейтрализующих антител.

Подготовку испытуемых сывороток с последующим приготовлением смеси вирус-сыворотка проводили аналогично схеме, описанной в примере 1. По истечении срока инкубирования реакционных смесей (60 мин при 37°С) в каждую лунку панелей вносили 100 мкл суспензии культуры клеток ПС в концентрации 300-500 тыс. клеток/см 3 , после чего планшеты помещали в СO ₂-инкубатор (при 37°С с содержанием 5% углекислого газа и 95% влажности). Последующие этапы осуществляли согласно предыдущей методике.

Учет результатов реакции проводили на 5-7 сутки. Титром антирабических антител в испытуемом материале являлось предельное разведение сыворотки, при котором наблюдалось 50%-ное подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток, т.е. нейтрализация вируса. При проведении исследований результаты определения антител в обоих примерах были аналогичны.

Результаты исследования сывороток крови тестом ингибиции фокусов флуоресценции и предлагаемой нами реакцией нейтрализации в культуре клеток ПС приведены ниже (табл. 1).

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, результаты тестирования сывороток двумя методами были идентичны.

С целью сокращения времени и оптимизации условий постановки реакции нами проведены исследования по влиянию времени инкубирования смеси вирус-сыворотка на результаты реакции (табл. 2).

По данным табл. 2 видно, что оптимальным временем инкубирования смеси вирус-сыворотка является 60 мин (в отличие от традиционных 90 мин).

Таким образом, результаты титрования антирабических антител предложенным нами способом соответствуют результатам теста ингибиции фокусов флуоресценции. Предложенный способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител прост в исполнении, высокочувствителен и является технологичным и экономически обоснованным, в связи с отсутствием необходимости использования токсичных фиксаторов и ФИТЦ-конъюгата и может быть использован при оценке иммунного статуса у животных, вакцинированных против бешенства.

Способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител, включающий взаимодействие вакцинного вируса бешенства с исследуемыми сыворотками, отличающийся тем, что используют штамм 71 БелНИИЭВВГНКИ, реакционную смесь вирус — сыворотка инкубируют 60 мин при 37°С, вносят суточную интактную культуру клеток почки сайги и помещают в СО₂-инкубатор с последующим определением на 5-7 сутки титра вируснейтрализующих антител по предельному разведению сыворотки, при котором наблюдалось 50%-ное подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.07.2005

Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007

источник

РАХМАНИН Петр Владимирович

ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ПРИВИТЫХ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА КОШЕК И СОБАК

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РАХМАНИН Петр Владимирович

ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ПРИВИТЫХ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА КОШЕК И СОБАК

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИТИБП))

Научный руководитель: доктор биологических наук

Клюкина Валентина Ивановна,

Официальные оппоненты: профессор, доктор ветеринарных наук

Белоусов Василий Иванович,

кандидат биологических наук Красуткин Сергей Николаевич

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им ЯР Коваленко»

Защита диссертации состоится 27 июня 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006 069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан 27 мая 2008г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов

1.Общая характеристика работы

Актуальность темы. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенств вом среди животных и возникновения случаев заболевания людей Несмотря на то, что основными резервентами и распространителями ра-бического вируса остаются дикие хищники семейства псовых, все чаще вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные (Селимов М А, 1998; Макаров В.В. и др , 2002)

В 2005году, по сравнению с 2000 годом, число заболевших бешенством животных увеличилось в 3,7 раза с 1406 до 5253 случаев Бешенство среди различных видов животных в 2007 году распространилось на территории 49 субъектов РФ.

Интенсивность распространения бешенства домашних животных находится в прямой зависимости от численности безнадзорных собак и кошек. В Российской Федерации с 2000-2005гг увеличилось количество неблагополучных пунктов по бешенству собак и кошек до 39,4%.

Основными средствами контроля бешенства среди домашних и диких животных являются специфическая профилактика, обеспечивающая устойчивость животных к заражению бешенством, и лабораторная диагностика Однако применение антирабических вакцин и эффективных схем иммунизации животных, часто недостаточно из-за гетерогенности популя-ционной и индивидуальной защиты животных (Недосеков В В.2001, Иванов В С ,2002).

Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейт-рализующих антител является индикатором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции (В1е1зс1гоШ В.,1990: Ьа&п М ,1990)

В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ по бешенству содержание в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных вируснейтрализующих антител 0,5 МЕ/мл считается минимальным уровнем антирабических антител, соотносимого с возможностью защиты от бешенства (Manual of standards Diagnostic Tests and Vac-cines,2004).

С 2003 года обязательными условиями, подлежащими исполнению при ввозе домашних животных (кошек, собак, домашних хорьков) из стран, не входящих в Европейский Союз, являются наличие имплантированных микрочипов и уровня протективного антирабического иммунитета не менее 0,5МЕ/мл. (Регламент Совета и Европейского парламен-та,2003).

Общепринятым методом оценки рабического иммунитета у привитых против бешенства людей и животных является реакция нейтрализации (РН) на мышах, к недостаткам которой можно отнести трудоемкость, использование большого количества животных и длительного срока (14-21 день) наблюдения.

Среди новых, рекомендуемых МЭБ методов in vitro на культуре клеток, можно выделить тест ингибиции фокусов флюоресценции (fluorescent focus inhibition test (RFFIT) и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN), которые позволяют по определенному в тестируемых сыворотках количеству антирабических антител определять уровень протективного иммунитета. Постановка тестов in vitro требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса.

На основании этого, комитет экспертов ВОЗ по бешенству рекомендует в качестве быстрого, пробный тест на основе непрямого иммунофер-

ментного анализа для количественного определения в сыворотках крови вакцинированных животных антител к вирусу бешенства.

К преимуществам ИФА относится высокая чувствительность, автоматизация, использование инактивированного вируса и возможность в короткие сроки (3-4 ч) количественно определять в сыворотках привитых против бешенства животных уровень антирабических антител (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004).

С учетом этого, разработка тест-системы на основе непрямого им-муноферментного анализа для количественного определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак является актуальной задачей для практической ветеринарии.

Цель и задачи исследований

Основной целью данной работы являлась разработка тест-системы непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «CVS» и гликопротеина (111) для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе.

2 Синтезировать протеин А- пероксидазный коньюгат для иммуноферментной тест-системы.

3 Получить контрольные сыворотки для иммуноферментной тест-системы

4. Разработать тест-систему на основе непрямого ИФА для количественного определения к вирусу бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак

5 Исследовать эффективность применения разработанной иммунофер-ментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в сравнении с РН в культуре клеток

Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем:

Впервые в РФ разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого ИФА с применением кулыурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и референс-препарата для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

Отработаны условия очистки и концентрирования кулыурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и гликопротеина вируса бешенства, пригодных в качестве антигенов иммуноферментной тест-системы.

Подобрана схема иммунизации баранов и собак для получения ан-тирабической сыворотки, используемой в качестве контрольной при постановке непрямого ИФА.

Исследована возможность применения протеин А- пероксидазного коньюгата в иммуноферментной тест-системе для определения антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Установлена согласованность между результатами определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак с помощью разработанной иммуноферментной тест-системой и РН в культуре клеток.

Практическая значимость работы.

Впервые в РФ разработан набор компонентов и иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак, внедрение которой в практику ветлабораторий позволит в короткие сроки провести исследования сывороток крови на наличие антирабических антител и оценить эффективность вакцинации кошек и собак.

Разработанная тест система может быть использована для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак при перевозе их через границу Российской Федерации.

Основные положения, выпосимые на защиту.

Иммуноферментная тест-система для количественного определения антител в сыворотках крови кошек и собак, привитых против бешенства.

Результаты определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток.

Оценка эффективности применения разработанной иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак.

1.6.Апробация и публикация результатов.

Основные материалы диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ВНИИТБП по плану НИР ОКР на 2005-2008гг задания 08 06. 0¡.«Разработать новые диагностические системы и комплексные лечебно-профилактические препараты экономически значимых инфекционных болезней животных», на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии и иммунологии животных» к 100-летию Я С. Коваленко, 16-17 мая 2006г, Международной юбилейной научно-практической конференции, поев 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленно-

ста (Курск, 2006г), Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» 20-21 декабря 2007 (Щелково, 2007), на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково,2008).

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных

Структура объем и диссертации.

Диссертация изложена на 104 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 3 рисунками. Список используемой литературы включает 121 источников, из которых 61 отечественных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.Материалы и методы

Работа выполнена в 2005-2008гг в отделе иммунологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП).

Вирус бешенства В работе использовали культуральную суспензию фиксированного вируса бешенства штамм «CVS», адаптированного к культуре клеток ВНК-21, с титром инфекционности 5,0 lgLD50/cM.

Антигены для ИФА Очищенный вирус бешенства получали путем ступенчатого центрифугирования вируссодержащей суспензии при 1 тыс-g и 50 тыс g с последующей очисткой вируса гель-хроматографией на сефарозе 4В.

Гликопротен (ГП) вируса бешенства получали обработкой очищенного вируса тритоном Х-100 в 2% концентрации и отделением ультрацентрифугированием при 50 Tbic.g.

Электронно-микроскопическое изучение препаратов вируса бешенства проводили с помощью негативного контрастирования Плавучую плотность вируса бешенства определяли дифференциальным центрифугированием в градиенте 10-60% сахарозы.

Титрование инфекционности вируса бешенства проводили путем ин-трацеребрального заражения мышей, согласно ГОСТ 26075-84

Сыворотки Исследовали сыворотки от вакцинированных против бешенства баранов (34 пробы), КРС (26 проб), кошек (26 проб), собак (24 проб) из приютов, ветлечебниц и хозяйств Московской области в период 2006-2008гг.

Антирабические сыворотки получали иммунизацией баранов и собак препаратом концентрированного очищенного вируса бешенства штамм «CVS» по разработанной в отделе иммунологии схеме совместно с аспирантом Проничевым А Б

Схема иммунизации включала подкожное введение животным инакти-вированного вируса бешенства штамм «CVS» и внутримышечные инъекции вируса с адьювантом

Пул нормальных сывороток от клинически здоровых не вакцинированных собак, отрицательно реагирующих в ИФА и РН, использовали в качестве отрицательного контроля для ИФА

Методы определена антител Антитела к вирусу бешенства выявляли исследованием сывороток крови методами РН, РДП, РСК, РНИФ как описано в «Методах лабораторных исследований по бешенству» (1975).

Синтез протеин А- пероксидазного конъюгата Конъюгат готовили меткой протеина A St. aureus с ферментом пе-роксидазы хрена (ПХ марка A, RZ = 2,8 -3,0 («Sigma») периодатным методом по В Wilson, Р Nakane (1978 г) Иммунологическую и знзиматиче-скую активность протеин А-ПХ коньюгата определяли титрованием его в ИФА с сыворотками собаки, кошки

При постановке ИФА использовали также коммерческие антивидовые анти-IgG барана (производства ИЭМ Н Ф Гамалеи,РАМН), анти-IgG кошки и анти-IgG собаки («Sigma») коньюгаты.

Определение белка Общий белок определяли по Лоури и др (1956) и спектрофотометрически на СФ-46 при длине волны 280 нм.

Непрямой иммуноферментный анализ для количественного определения антител в сыворотках крови привитых против бешенства животных Для разработки иммуноферментной тест-системы был проведен ряд модельных экспериментов с сыворотками баранов

Антитела в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных определяли методом непрямого твердофазного иммунофер-ментного анализа (ИФА), используя 96-луночные панели или 16 луночные стрипы. Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра «Sigma»npH длине волны 490 нм.

Сенсибилизацию панелей проводили очищенным культуральным вирусом бешенства штамм «CVS» из расчета 10 мкг/0,1мл (гликопротеин 4 мкг/0,1мл) в ЮмМ фосфатном буфере рН 7,8 с содержанием 0,3% обезжиренного молока и 0,05% детергента в течение 18 ч при 4° С. Центры неспецифической сорбции блокировали 2% раствором обезжиренного сухого молока и выдерживали 12 ч при температуре 4°С

После каждого этапа проводили промывку лунок 4-х кратно трис-солевым буферным раствором рН 7,5 , содержащим 1% твин-20 (ТСБ-Т)

Исследуемые сыворотки в разведении 1 100, контрольные сыворотки в разведении 1.10 и стандартный препарат в разведениях 1100-1 30 000 на ЮмМ ФБР с 0,5% сухого обезжиренного молока и 1% сыворотки КРС, инкубировали в лунках одной панели в двух повторностях в течение 1 ч при 37° С

После 4-х кратной промывки в лунках инкубировали протеин А- пе-роксидазный (или антивидовой) коньюгат 1 ч при 37° С Субстратно-индикаторный раствором для пероксидазных коньюгатов служил 0,04%-

ный раствор орто-фенилендиамина (ОФД) в 0,1 $ М цитратно-фосфатном буфере pH — 5,0 с 2,4 мМ Н202.

Реакцию ИФА останавливали через 30 мин добавлением в лунки 50мкл 4Н раствора H2SO4 и определяли оптическую плотность при 490 нм (ОП490). Титром антигена или сыворотки считали конечное разведение, в котором ОП490 в 2 раза превышало ОЩю отрицательного контроля.

Количественное содержание антител в исследуемой сыворотке определяли по уравнению линейной регрессии, выведенному по результатам титрования стандартного препарата (зависимость ОП490 от концентрации антител (ME/мл) в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO Laboratory Techniques m Rabies, 2004,p.2.2.5).

В качестве стандартного препарата использовали коммерческий ан-тирабический у-глобулин человека с содержанием вируснейтрализующих антител 9 ME/мл (производства НПР «Вектор»).

Результаты ИФА сравнивали с результатами исследования сывороток в РН в культуре клеток. Относительную чувствительность и специфичность разработанной тест-системы определяли согласно рекомендациям ВОЗ (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004).

Статистическая обработка результатов. Определение среднего арифметического (х) при количестве опытов (п), среднего квадратичного отклонения (а) средней арифметической проводили согласно руководству И.В .Полякова (1975).

При определении согласованности результатов, полученных с помощью разработанной тест-системы и РН, использовали метод каппа-статистики (Shoukri М N. 1996, С А Дудников, 2005).

Обработка данных, полученных непрямым ИФА и оценка их достоверности включала регрессионный анализ, который позволил рассчитать значения параметров уравнения А,В, значение коэффициента корреляции R,

стандартную ошибху и построить линию регрессии (Методика статистической оценки экспериментальных данных в биологии Е.А.Рубан 1972).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Отработка условий очистки и концентрирования вируса бешенства.

Для постановки непрямого ИФА по определению уровня иммунитета, необходимо использовать антигены, обладающие высокой иммуно-генной активностью и имеющие в своем составе спектр антигенных детерминант, вызывающих при введении животным выработку вируснейтрали-зующих антител.

Для получения очищенного и концентрированного культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» были испытаны ряд методов, позволяющих максимально освободиться от белков клеточной культуры с сохранением целостности вирусных частиц, такие как последовательное центрифугирование и гель-хроматография.

После центрифугирования вируссодержащей суспензии с титром инфек-ционности 5,0 lg LDjo/cm при 1тыс g и концентрирования при 50 тыс g на центрифуге VAC-60 был получен препарат вируса бешенства с титром инфекционности 5,4 lg LDjo/cm. и очищенный на 90%, по сравнению с исходным содержанием белка

Хроматографический профиль очистки вируса бешенства на сефарозе 4В был представлен 2 пиками, причем комплементсвязывакицая активность была обнаружена в 1-2 пиках, инфекционность в первом пике. Результаты очистки вируса бешенства представлены в таблице 1

Результаты очистки культурального вируса бешенства

Материал и этапы Очистки Кол-во мл Белок мг/мл Инфек-ть Lg LDso/iui Очистка в%

Исходная суспензия 4500 22 5,0

Центрифугирование 50 тыс g 55 9,2 5,7 60

Хроматография на сефадексе 0-200 68 2,4 5,8 90

Антиген для ИФА 30 0,57 6,2 97,4

По данным электронной микроскопии, концентрированный материал первого пика содержал большое количество целых вирусных частиц с характерными выступами на наружной оболочке, типичной для вируса бешенства Дифференциальным центрифугированием очищенного вируса бешенства на градиенте 10-60% сахарозы был выявлен один пик инфекционное™ в зоне 1,16 г/см, что также свидетельствовало о наличии высоко-очищенного препарата Таким образом, оптимизация условий очистки позволила получить цельновирионный препарат вируса бешенства штамм «CVS» очищенный на 97,4%, с титром инфекционности на 1,2 Lg LD5iyCM выше, чем в исходной вируссодержащей суспензии.

Активность очищенного вируса бешенства оценивали в прямом ИФА с положительной антирабической сывороткой барана и анти -IgG барана пероксидазным коньюгатом в стандартных условиях Установлено, что активность очищенного вируса бешенства составила 1:800 и была в 200 раз выше исходной.

Антигенную активность и специфичность очищенного вируса бешенства определяли иммунизацией баранов, которым 2-кратно вводили вирус внутримышечно и подкожно Через 7,14, 30 дней брали кровь и исследовали на наличие вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в РН.

Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках иммунизированных баранов составили 1 64.

Препарат цельновирионного вируса бешенства штамм «СУБ» был использован для получения антирабической сыворотки для ИФА и в качестве антигена в разработке иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител у вакцинированных против бешенства животных

Получение гликопротеина вируса бешенства Из большого выбора реагентов, пригодных для солюбилизации мембранных белков, нами был выбран неионный детергент тритон Х-100, обладающий способностью дезинтегрировать мембраны и удерживать белки в растворенном состоянии, не нарушая их антигенной структуры и не препятствуя взаимодействию с антителами.

Исследована возможность использования тритона Х-100 в 1%-2% концентрации для растворения мембран очищенного вируса бешенства и разделения гликопротеина

Установлено, что при обработке очищенного вируса тритоном Х-100 в 2% концентрации солюбилизируется 80% белка, против 48% при применении 1% -концентрации Гликопротеин вируса бешенства отделяли улырацентрифугированием при 50 тыс ё в течение 90 мин и диализовали надосадок против 1% лизина

Надосадок после ультрацентрифугирования содержал гликопротеин вируса бешенства, осадок содержал нуклеопротеид и небольшое количество цельного вируса, от которого освобождались хроматографией на сефадексе — 1,0 ОП490 с сывороткой кошки / БСА ОП490 с сывороткой собаки / БСА Рабочая концентрация по ПХ, мкг/0,1мл

Протеин А-ПХ р-р 14000 1,290/0,120 1,140/0,170 240

Протеин А-ПХ сух 1 3200 1,220 / 0,110 1,120/0,190 200

Анти-^в кошки 1 6000 1, 180/0,060 — 160

Антикв собаки 1 5000 1,210 /0,070 180

Включение сахарозо-желатиновой смеси позволило стабилизировать активность протин А- конъюгата и сохранить в лиофилизированном состоянии энзиматическую и иммунологическую активность в течение 2 лет (срок наблюдения).

2.3. Получение контрольных сывороток для иммунофермент-ной тест-системы.

Для постановки иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител необходимо располагать контрольными сыворотками: положительной -антирабической сывороткой с содержанием вируснейтра-лизующих антител и отрицательной — сывороткой, не содержащей антитела к вирусу бешенства.

Антирабические сыворотки, получаенные иммунизацией баранов и собак препаратом очищенного и инактивированного (3-пропиолактоном 1.4000 вируса бешенства, и сыворотки от невакцинированных собак исследовали на наличие антител к вирусу бешенства. Результаты серологического исследования сывороток представлены в таблице 3.

Результаты серологического исследования контрольных сывороток

Барана 1 64 1 40 1 12S 1 160

Собаки (1введ ) 1 16 1 10 1 2 1 20

Собаки (2 введ ) 1-32 1 10 1-8 1 40

Комплексное исследование антивирусной активности антирабических сывороток показало, что содержание специфических антител в них зависело от способа введения вируса бешенства и сроков взятия сыворотки Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках баранов в титрах Г64 выявлялись в РН на 30-45 дни от начала иммунизации, комплементсвязы-вающих 1:160 — на 45-60 дни, преципитирующих в титре 1: 128 на 70-105 день от начала иммунизации.

Антирабическая сыворотка собаки с максимальные титром вируснейтрализующих антител 1.32 была получена на 45 день после двукратного введения очищенного вируса бешенства.

Исследование антирабической сыворотки барана в реакции непрямой иммунофлюоресценции показало, что она способна подавляю специфическую флюоресценцию в мазках мозга от мышей зараженных вирусом бешенства штамм «CVS», в разведении 1:160. Сыворотка вошла в диагностический набор «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» методом флюоресцирующих антител (Регистрационный № 1.2.-9/00080, утверждена 20.02 2006 г)

Антирабическая сыворотка барана с титром вируснейтрализующих антител 1:64 и собаки с титром 1:32 и пул сывороток, отрицательно

реагирующих в РН, были использованы в качестве контрольных в разработке иммуноферментной тест-системы

2.4. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения в сыворотках крови антител к вирусу бешенства.

Для разработки иммуноферментной тест-системы непрямого ИФА использовали рекомендации, указанные в руководстве ВОЗ ( Manual of standarts Diagnostic Test and Vaccines,2004 часть 2 2 5) Оптимизация условий постановки непрямого ИФА для количественного определения антител включала определение оптимальной дозы, времени и температуры сорбции компонентов в лунки микроплат, состава сенсибилизирующего и блокирующего буфера, режима и времени инкубации сывороток, регистрации и интерпретации результатов ИФА

Постановку непрямого иммуноферментного анализа проводили с использованием следующих компонентов

— антиген — препарат цельновирионного вируса бешенства с концентрацией 0,57 мг/мл, гликопротеин с концентрацией 0,12 мкг/мл, -контрольные сыворотки- положительная- антирабическая сыворотки барана с титром вируснейтрализующих антител1.64 и собаки с титром в РН 1 32, отрицательная сыворотка -пул сывороток не содержащих антител к вирусу бешенства,

— стандартный препарат антирабический у-глобулин человека с содержанием вируснейтрализующих антител 9 МЕ/мл,

— протеин А -пероксидазный коньюгат в рабочем разведении 1 ‘4000

Отработка оптимальных условий постановки непрямого иммуноферментного анализа для определения антител Методом шахматного титрования препарата вируса бешенства и гликопротеина ( 0,12-10 мкг/мл) и

антирабического у-глобулина (1’50-1:6400) определена оптимальная концентрация вируса и ГП для сенсибилизации поверхности микроплат Оптимальная концентрация очищенного вируса бешенства составила 10мкг/0,1мл, гликопротеина 4 мкг/мл при времени экспозиции 1 ч при 37° С или 18 ч при температуре 4° С и использовании 10 мМ ФБР рН 7,8 с содержанием 0,3% обезжиренного молока и 0,05% тритона Х-100

Исследования активности сорбированного на микроплаты вируса бешенства и ГП, показали сохранность этих свойств при хранении микроплат при 4° С в течение 6 мес (срок наблюдения) плотно закрытыми.

Для определения оптимальных условий сорбции контрольных и исследуемых сывороток исследовали величину ОП490 от времени и условий инкубации с вирусом, адсорбированным на микроплаты Результатами опытов установлено, что инкубация предварительно инактивированных при 37° С в течение 30 мин контрольных , исследуемых сывороток и стандартного препарата в течение 1ч при 37°С, является оптимальным при включении в ЮмМ ФБР 0,5% обезжиренного молока и 1% сыворотки КРС Отмывка лунок микроплат на всех этапах сорбции трис-солевым буферным раствором рН 7,5 , содержащим 1% твин-20 и блокировка свободных сайтов связывания 2% раствором обезжиренного молока, позволила получить стабильные достоверные результаты ИФА

Аналитическую чувствительность тест-системы непрямого ИФА исследовали титрованием стандартного препарата антирабического у-глобулина человека в диапазоне концентраций 0,018-9,0 МЕ/мл Установлено, что в оптимизированных условиях иммуноферментная тест-система непрямого ИФА обеспечивала обнаружение до 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител Тестированием в непрямом ИФА антирабиче-ских сывороток баранов установлено, что в сыворотках были обнаружены антитела к вирусу бешенства на 7 день после иммунизации.

Аналитическую специфичность тест-системы непрямого ИФА исследовали титрованием гетерологичной сыворотки, содержащей антитела к энтеровирусу и отрицательной (не содержащей вируснейтрализующих антител) сыворотки собаки

Полученные результаты свидетельствуют, что разработанная тест-система ИФА является специфичной, так как позволяет достоверно дифференцировать антитела, специфические к вирусу бешенства (ОП4900,93610,014), от гетерологичных антител (ОП490 0,220±0,002) и антител отрицательной сыворотки (ОП490 0,120±0,001).

Определение допустимых значений оптических плотностей контрольных сывороток

Для определения допустимых значений ОП490 контрольных сывороток, проанализировали ОП490, полученные титрованием 12 повторностей положительной и отрицательной сывороток собаки в разведении 1.10.

Установлено, что результаты определений антител в разработанной им-муноферментной тест-системе считаются достоверными, если допустимые значения для положительной сыворотки ОП^о S0,300 и для отрицательной сыворотки ОП490 0,5МЕ/мл РН 0,5МЕ/мл 23 в 21А 2

0,5МЕ/мл РН 0,5МЕ/мл27в 24А 3

0,5МЕ/мл) в разработанной тест-системе, совпадающих с количеством проб (> 0,5МЕ/мл) в РН, В- количество проб (> 0,5МЕ/мл) в РН, Относительная специфичность С/ОхЮО%,где

С-количество проб ( 0,5МЕ/мл 0,5МЕ/мл 15А 2 17й (15+2)/22=0,77

ix против бешенства кошек и собак в разработанной иммуноферментной ¿ест-системе и РН в культуре клеток. Чувствительность разработанной

тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88%, специфичность 80%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Клюкина В И, Гринь С А. Рахманин П.В., Востряков К В Современная эпизоотическая ситуация бешенства в республике Карелия. Материалы международной юбилейной научно-практической конференции поев. 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России. Курск, 2006, — С 131-132

2. Клюкина В.И, Рахманин П.В.. Серологическое обнаружение антира-бических антител Материалы Международной научно-практической конференции к 100-летию рождения Я С.Коваленко «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных 16-17 мая 2006 г -Щелково-2007, — С 251.

3. Клюкина В.И, Гринь С.А., Рахманин П.В., Проничев А Б. Получение и изучение иммунохимических свойств компонентов вируса бешенства.. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 20-21 декабря 2007 г. -Щелково-2007, — С 95-99.

4. Рахманин П.В. Клюкина В.И, Проничев А Б, Востряков К.В.

Определение антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»,20-21 декабря, 2007г,-Щелково-2007, — С 99-103.

5 Клюкина В.И, Востряков К В., Рахманин П.В., Проничев А.Б. Ситуация по бешенству в Ненецком Автономном округе Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 2021 декабря 2007 г. — Щелково-2007, — С103-106 6. Рахманин П.В., Клюкина В.И, Проничев А.Б. Иммуноферментная тест-система определения уровня иммунитета у вакцинированных против бешенства кошек и собак. Ветеринария и кормление.№ 3, 2008,-С 12-14

Отпечатано в ООО «Мещера», г Щелково, М О , ул Свирская, д 8 а, зак N8 315, тираж 100 экз

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1.1.1. Эпизоотическая обстановка по бешенству в РФ.

1.1.2. Эпидемиологическая ситуация бешенства (гидрофобии) в Российской Федерации.*;.

1.2.1. ‘ Характеристика возбудителя.

1.2.2. ‘Морфология и химический состав.

1.2.4. Культивирование вируса.

1.4. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА.

1.4.1. Методы обнаружения антигенов вируса бешенства.

1.4.2. Методы выделения вируса бешенства.

1.4.3. -Методы обнаружения генома вируса.

1.4.4. Обнаружение антирабических антител.

1.5. ИММУНИТЕТ, МЕРЫ БОРЬБЫ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА.

Введение Диссертация по биологии, на тему «Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак»

— Актуальность темы. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Несмотря на то, что основными резервентами и распространителями рабического вируса остаются дикие хищники семейства псовых, все чаще вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные (собаки и кошки) [1,2,8,15,34].

В 2005году, по сравнению с 2000 годом, число заболевших бешенством животных увеличилось в 3,7 раза с 1406 до 5253 случаев. Интенсивность распространения» бешенства домашних животных находится’в прямой зависимости от; численности безнадзорных собак и кошек [8,28,31,36,57,61].

В 2000-2005гг в Российской Федерации увеличилось количество неблагополучных пунктов по бешенству собак и кошек до 39,4%. Бешенство среди различных видов животных регистрировалось в 2007 году на территории 49 субъектов РФ.

Основными средствами контроля бешенства среди домашних и диких животных являются специфическая профилактика, обеспечивающая устойчивость животных к заражению бешенством, и лабораторная диагностика. Однако применение антирабических вакцин и эффективных схем иммунизации животных, часто недостаточно из-за гетерогенности популяционной и индивидуальной защиты животных [14,32].

Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейт-рализующих антител является фактором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции [15,119].

В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ по бешенству, содержание в сыворотках крови привитых против бешенства животных вируснейтрализующих антител 0,5 МЕ/мл, считается минимальным уровнем протективного антирабического иммунитета (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines,2004) [120].

С 2003 года обязательными условиями, подлежащими исполнению при ввозе домашних животных (кошек, собак, домашних хорьков) из стран, не входящих в Европейский Союз, являются наличие имплантированных микрочипов и содержание вируснейтрализующих антител в сыворотке крови не менее 0,5МЕ/мл (Регламент Совета и Европейского парламента,2003). 44

Для определения антител в сыворотках крови к вирусу бешенства, ВОЗ рекомендует использовать реакцию нейтрализации in vivo РН на мышах и тесты in vitro на культуре клеток: тест ингибиции фокусов флюоресценции (fluorescent focus inhibition test (RFFIT) и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN)[ 17,24,95,96,119,120].

Постановка тестов in vitro требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса. Постановка РН на мышах трудоемка, длительна во времени (14-21 день), требует живого вируса и значительного количества мышей, что увеличивает • стоимость анализа.

В практике применяются традиционные методы определения антира-бических антител, такие как РНГА, РСК, РНИФ, РДП [24,26].

Для решения аналогичных задач предложены методы иммунофер-ментного анализа, основанные на использовании целого вируса бешенства, или и его оболочечного белка-гликопротеина (белок G), однако, эти методы пригодны для качественного определения антител, но не позволяют количественно определять наличие антител против бешенства в сыворотках крови животных после вакцинации [3,10,26,35,45,66,79,113].

На основании этого, комитет экспертов ВОЗ по бешенству, в качестве альтернативного, рекомендует метод непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения в сыворотке крови привитых кошек и собак антител к вирусу бешенства [96].

К преимуществам непрямого ИФА относится высокая чувствительность, автоматизация, использование инактивированного вируса бешенства штамм «CVS», референс-сыворотки с известным содержанием вирус-нейтрализующих антител и возможность в короткие сроки (3-4ч) по количественному содержанию антител в сыворотках крови вакцинированных животных определить уровень антирабического иммунитета.

С учетом этого, разработка тест-системы непрямого ИФА для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак, является актуальной задачей для практической ветеринарии. 7 Цель и задачи исследования Основной целью данной работы являлась разработка тест-системы, на основе непрямого иммуноферментного анализа, для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «CVS» и его компонента-гликопротеина для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе.

2. Синтезировать протеин А- пероксидазный коньюгат для иммуноферментной тест-системы.

3. Получить контрольные сыворотки для иммуноферментной тест-системы.

4. Разработать тест-систему на основе непрямого ИФА для количественного определения к вирусу бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак.

5. Исследовать эффективность применения разработанной иммунофер-ментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в сравнении с РН в культуре клеток.

Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем:

Впервые в РФ разработана иммуноферментная /гест-система на основе непрямого ИФА с применением культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и референс-препарата для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

Отработаны условия очистки и концентрирования культурального фиксированного вируса бешенства’ штамм «CVS» и гликопротеина вируса бешенства, пригодных в качестве антигенов иммуноферментной тест-системы.

Подобрана схема иммунизации продуцентов для получения антира-бической сыворотки, используемой в качестве контрольной при постановке непрямого ИФА.

Исследована возможность применения протеин А- пероксидазного коньюгата в иммуноферментной тест-системе для определения антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Установлена согласованность между результатами определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства ко г Практическая значимость работы.

Впервые в РФ разработан набор компонентов и иммунофермент-ная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак, внедрение которой в практику ветлабораторий, позволит в короткие сроки провести исследования сывороток крови на наличие антирабических антител, и оценить эффективность вакцинации кошек и собак.

Разработанная тест система может быть использована для определения антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак, при перевозе их через границу Российской Федерации. з Практические предложения

Для практического использования предлагаются: Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2.-9/00080, утверждена 22.02.06. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных» утверждена директором ВНИТИБП 01.2006г.

Методические указания по определению уровня антител у привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотренные и одобренные на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак».

Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак».

НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008г).

Основные положения, выносимые на защиту.

Иммуноферментная тест-система для количественного определения антител в сыворотках крови кошек и собак, привитых против бешенства.

Результаты определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в иммуноферментной’тест-системе и РН в культуре клеток. :

Оценка эффективности применения разработанной иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак.

Апробация работы и публикация результатов

Материалы исследований были доложены на заседаниях научного совета ГНУ ВНИТИБП. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария и кормление».

Представленные в диссертационной работе материалы получены, проанализированы и обработаны автором самостоятельно. Практическую и консультативную помощь при исследовании сывороток крови кошек и собак в РН на культуре клеток оказал д.б.н., профессор Кузнецов Д.П., ведущий научный сотрудник ФГУ ВГНКИ к. б.н. Елаков A.JI.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ I. Бешенство животных.

Бешенство — особо опасная инфекционная болезнь, характеризующаяся поражением центральной нервной системы, к которой восприимчивы домашние и дикие животные, а также человек [2,5]. Бешенство, по оценкам ВОЗ, входит в пятерку зоонозов, наносящих наибольших социально-экономический ущерб и является постоянной угрозой для жизни человека и животных [15,17,89].

Бешенство распространено практически по всему миру, за исключением некоторых островных государств (Великобритания, Ирландия, Новая Зеландия, Япония) и Антарктиды. По данным экспертов’ВОЗ и МЭБ болезнь регистрируется более чем в 110 стран земного шара. Ежегодно погибает около 50 тысяч человек, из этого числа 35-45 тысяч (90%) приходится на Азиатский континент, в основном на Индию. Доля детской смертности составляет 30-50%, от числа заболевших [1,7,98].

В зависимости от резервуаров и особенностей течения, распространение t бешенства можно отнести к нескольким ареалам:

Полярный ареал, включающий РФ, Чукотку, Гренландию, Аляску, где в 60 — 90% случаев резервуаром вируса бешенства служат песцы.

Центральная и Западная Европа, азиатская часть РФ, США, Мексика входят в зону, характеризующуюся многочисленными носителями бешенства: куницы, красные лисы, барсук, волки, грызуны, скунсы, енотно-видная собака [75,117].

Южная и Центральная Америка, где резервуарами являются летучие мыши-вампиры [62,94,97].

Африканский ареал, где основными носителями вируса являются собаки, шакалы, мангусты.

Распространено бешенство, главным образом, среди плотоядных животных как диких, так и домашних.

Из всего многообразия животного мира только 4 отряда хладнокровных животных не подвержены этой инфекции, которая, помимо диких животных, поражает домашних и сельскохозяйственных животных, а также человека [25,36,48,50].

За период 2000-2005 гг. среди животных было отмечено более 82 тыс. случаев бешенства, подтвержденных лабораторным анализом; погибло свыше 30 млн человек и более 10 млн. человек получили различные повреждения от животных и более 5 млн. человек специфическое антираби-ческое лечение [15,22].

Несмотря на все усилия санитарных властей, случаи заболевания среди людей все еще регистрируются в районах, где дикие животные служат резервуаром вируса бешенства [29,34]. Спектр патогенности ВБ тесно связан с его экологией и имеются 2 формы эпизоотии Б: городская и лесная, при которой возбудитель циркулирует среди диких плотоядных по типу природно-очаговой инфекции. Периодичность эпизоотии — характерная особенность Б, а сезонные подъемы заболеваемости Б среди животных тесно связаны с географией региона и биологическими циклами активности животных [75,90,121].

Лисицы обусловливают 60 — 85% от’всех случаев заболевания бешенством среди диких животных. Их роль в эпизоотологии бешенства объясняется чрезвычайной восприимчивостью к ВБ, увеличением популяции этих животных, а также возможностью перорального заражения[ 19,29,47].

Увеличению численности лисиц способствует истребление их естественных врагов — волков, рысей, медведей, орлов и других хищников, а также увеличение количества грызунов — основного источника корма для лисиц[69,70]. У 40-89% лисиц болезнь часто протекает хронически и латентно, обеспечивая длительную персистенцию вируса в естественных условиях^ 6,65].

Имеются сообщения о выделении возбудителя.Б от грызунов — белок, сурков, крыс, зайцев, ондатр, хомяков, мышей. Однако роль этих животных в экологии Б окончательно не установлена [29,47].

Несмотря на то, что эпизоотии Б поддерживаются, главным образом, дикими животными, человеку угрожают, прежде всего, собаки и кошки [5,8,34,48]. Собаки, летучие мыши, обезьяны, волки, енотовидные собаки, койоты, кошки составляют не более 5% от общего числа иммунизированных животных и существенно влияют на распространение Б [15,47,52,112,115].

Собаки среди прочих восприимчивых животных представляют собой группу наивысшего риска в виду их абсолютной преобладающей роли в реализации связей между природными и антропургическими экотипами бешенства за счет контактов с лисицами — в свою очередь преобладающими резервуарами и источниками инфекции.

В городских эпизоотиях бешенство у собак, как правило, заканчивается их гибелью, поэтому механизм поддержания вируса сводится к коротким циклам репродукции в организме и быстрой передаче восприимчивому организму [30,31,82].

В настоящее время наблюдается увеличение популяции собак, в том числе бездомных, которые служат звеном в цепи передачи инфекций во многих развивающих странах, продолжают также сохраняться среди диких животных очаги бешенства, даже в условиях ежегодной вакцинации^,30,81].

Кошки, среди прочих восприимчивых животных, представляют собой по значению вторую после собак и прогрессирующую группу риска. Кошки вовлекаются в экологические циклы инфекции лишь спорадически, не участвуют в циркуляции возбудителя, остаются его биологическими тупиками и обладают низким эпидемическим потенциалом[29].

1. С использованием последовательного центрифугирования при 1 Tbic.g , 50 Tbic.g и гель-хроматографии на сефарозе 4В получен очищенный и концентрированный вирус бешенства штамм «CVS», 97,4% чистоты по- белку, инфекционностью на 1,2 IgLD 5о/сМ выше исходной и активностью в ИФА 1:800.

2. Обработкой вируса бешенства штамм «CVS» 2% тритоном Х-100 получен гликопротеин вируса с сохранением антигенной активности, определяемой в ИФА в титре 1:600.

3. При введении животным очищенный вирус бешенства и гликопротеин вызывали образование в сыворотках вируснейтрализующих антител в титрах 1:8 -1:64 и содержанием антирабических антител 2-12 МЕ/мл.

4. Иммунизацией баранов и собак инактивированным (З-пропиолактоном 1:4000 очищенным вирусом бешенства штамм «CVS» получены антирабические сыворотки с титром вируснейтрализующих антител, определенных в РН 1:16-1:64 и содержанием 4-24 МЕ/мл антител, пригодные в качестве контрольных, положительных сывороток и референс-препаратов для иммуноферментной тест-системы.

5. Показано, что протеин А- пероксидазный коньюгат в рабочем разведении 1:4000 и концентрации по ПХ — 240 мкг/ОДмл может быть использован в иммуноферментной тест-системе для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках привитых кошек и собак.

6. Разработана иммуноферментная тест-система непрямого ИФА для количественного определения в сыворотках крови антител к вирусу бешенства с чувствительностью 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител. Установлено, что относительно РН, чувствительность и специфичность тест-системы непрямого ИФА с использованием в «качестве антигена очищенного вируса была выше ( 91% и 94%), в сравнении с использованием гликопротеина вируса (88% и 86% соответственно).

6. Установлена пороговое значение ОП490 =0,620 о.е., по которой определен в сыворотках крови привитых кошек и собак минимальный уровень антирабических антител (менее 0,5 МЕ/мл).

7. Установлена согласованность (К=0,67) результатов, полученных при определении уровня’ антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в разработанной’ иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток. Чувствительность разработанной тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88%, специфичность 80%.

6. Практические предложения

Для практического использования- предлагаются:

Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2.-9/00080, утверждена 22.02.06. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» и утвержденная директором ВНИТИБП 01.2006г.

Методические указания по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».

Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в. сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».

НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рахманин, Петр Владимирович, Щёлково

1. Авилов В.М.,Седов В .А. и др. Необходим учет новых особенностей эпизоотологии бешенства. //Ветеринария.-1998,№6,-С.З-б

2. Авилов В.М., Гусев А.А., Савин А.В. Эпизоотическое состояние и эффективность производимых мероприятий против бешенства в России. //Ветеринария., №6.,2002,-С.З-6.

3. Акиныпина Т.В. Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях. Автореферат дисс., Щелково, 2005, С.-25

4. Березин В.Э., Артамонов А.Ф.// Вопросы вирусологии-1985,-№ 5,-С.568-571

5. Бакулов И.А., Книзе А.В., Котляров В.М. и др. Система эпизоотологиче-ского мониторинга и особо опасных, экзотических, малоизученных, в том числе зооантропонозных болезней животных. Покров, ВНИИВВиМ, 2001,72С.

6. Белоусов В.И.; Бирюков А.Г.; Кузнецова С.В.; Клюкина В.И.; Кочиш ИМ. Флюоресцирующий антирабический глобулин из сыворотки крови различных видов животных. Науч.основы технологии пром.пр-ва

7. Бешенство. Сюрин В.Н.,Самуйленко А.Я.,Соловьев Б.В.,Фомина Н.В. //Вирусные болезни животных.- МД998.-С.300-319

8. Березина Е.С. Особенности экологии собак.// Вет. консультант М.,2002,№5, -С.13-15

9. Бручнев К.Н.; Квасов И.Л.; Турсункулов Ш.Ж. Вируснейтрализующая и преципитирующая активность сывороток крови лошадей,привитых ра-бическими вирус-антигенами. Вестник с.-х. .науки Казахстана, 1985; T.2I -С. 71-75.

10. Ботвинкин А.Д., Наволокин В.В. Обнаружение антител к вирусу бешенства с помощью ELISA в пробах крови, собранных на бумажные диски. Лаб. Дело,1988, №3, -С. 73-77

11. Волкова Р.А.; Рунова В.Ф.; Романова Л.Н.; Храпова И.С.; Эльберт Л.Б.; Мальдов Д.Г. Применение ракетного иммунозлектрофореза для определения гликопротеина в концентрированных антирабических вакцинах. Вопр.вирусологии, 1994; Т.39, N2 -С. 68-71 ,

12. Вишняков И.Ф., Недосеков В.В. ,Груздев К.Н. и др. Способ определения антирабических вируснейтрализующих антитиел.// Патент № 97116427, 1997г

13. Гринь С.А., Сазанова Э.Я.,Акиньшина Т.В. и др. Клеточный иммунитет при культуральной антирабической вакцинации. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2006, №2,-С 76-78.

14. Груздев Л.К., Дешевых А.Е., Груздев К.Н., Изучение репродукции фиксированного штамма вируса бешенства в культуре клеток. Вопр. Приклад. Экологии (природопользования), охотоведения и звероводства.-Киров,1997,-С. 285-286.

15. Государственный стандарт СССР. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства. ГОСТ 26075-84 (СТ СЭВ 3452-81 ).-М. 1984.9с.

16. Дудников С.А., Кременчугская С.Р., Дудникова Е.К., Селютина И.Н. Получение гликопротеина GP-67 вируса бешенства. Проблемы инфек. па-тол, с-х животных.-Владимир,1997*.-С. 171-172

17. Дудников С.А. Лисы как маркеры при бешенстве. ч1-2., Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Материалы научно-прак. конфе-рен. Покров 2003.,-С 69-73

18. Идрисова Н.Т. Чувствительность некоторых культур клеток к вирусу бешенства. Бюл.ВИЭВ, 1991; Вып.75-76. -С. 119-121

19. Иванов B.C., Школьников Е.Э. Состояние и перспективы борьбы с бешенством. //Вестник РАСХН, 2000,№2,-С 63-65

20. КовалевА.Н.,ШашёнькоА.С.,Иммунофлюоресцентное исследование отпечатков роговицы глаза при бешенстве.//Ветеринария,1970,№9,-С.44-46.

21. Кунакаев Г.Г. Эпизоотическая обстановка по бешенству животных в

22. РБ. // Информ.бюл.МСХ и продовольствия Респ.Башкортостан,2000; N 11.-С. 26-27*

23. Кузнецова С.В. Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных вирусных антигенов (на примере вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита КРС). Авт. дис. док. биол. наук., ВИЭВ, 1991.

24. Кузнецова С.В.,Кузнецов П.П.,Иванов B.C. Субъединичная антираби-ческая вакцина.// Науч.основы технологии пром.пр-ва вет.биол.препаратов. -Щелково, 1996, -С. 54,

25. Литвинов О.Б., Яковлев С.С., Бессонов И.Е. и др. Информационный бюллютень «Бешенство».-М.2007

26. Макаров В.В. Бешенство, очерк мирового нозоареала и общие элементы контроля. /Ветеринарная патология. 2002,№1. -С. 13-20

27. Макаров В.В., Недосеков В.В.; Середа А.Д., Сошенко Л.П. Опыт серологического мониторинга популяции собак при бешенстве. Ветеринарная патология, 2002,№1,-С. 140-143

28. Макаров В.В., Джупина С.И., Ведерников В.А. и др. Бешенство животных разных видов в современных условиях-эпизоотологический образец и клиническая характеристика. Ветеринарная патология.-2002, №1.-С. 214-217

29. Макаров В.В.; Воробьев А.А. Актуальные проблемы бешенства: природная очаговость, методология исследований и контроля в центре России. Журн.микробиологии,эпидемиологии и иммунобиологии, 2005; N 1, С. 89-95

30. Мелимов М.А.; Татаров А.Т. Бешенство животных.// Ветеринария, 1984; № 12 . -С. 67-69

31. Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом. Владимир, 1998г.

32. Мовсесянц А.А. Современные проблемы бешенства. //Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Материалы научно-прак. конф. Покров 2003.,-С 26-31

33. Недосеков В .В., Вишняков И.Ф., Жестерев В.И.,Балышев В.М., Груздев К.Н Титрование антирабических антител с помощью теста фокусов флюоресценции. Ветеринария, 1998: №7,-С. 28-30

34. Пилявская Е.А. Изучение некоторых свойств антирабического имму-ноглобулина.Труды Томского НИИ вакцин и сывороток, 1983; Т. 7.-С. 103-109

35. Полюшкина Г.С. Изучение иммуномоделирующих свойств неотима при рабической инфекции.// Вирус.болезни с.-х.животных. -Владимира 1995 -С. 153,

36. Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., Маслов Е.В., Бойко А.А., Иванов B.C., Кузнецов П.П. Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определения уровня антител. Ветеринария, 1991,Т 8,-С. 62-64

37. Селимов М.А.; Фодор И.И.; Грабко В.И. К проблеме генно-инженерной антирабической вакцины.//Генно-инженерные и синтетические вакцины. Пущино, 1990-С. 64-70

38. Селимов М.А.Современная эпизоотическая ситуация и перспективы элиминации бешенства. Вопросы вирусологии. Т 43., №5, 1998,—С. 196-198

39. Седов В.А.; Коромыслов Г.Ф.; Куликовский А.В. Семинар всемирной организации здравоохранения по борьбе с бешенством диких животных (Женева, июль 1990 г.), Вестн. с.-х. науки. М, 1991; № 4 -С. 172-173

40. Сологуб Т.В.,Никишин И.В.,Вишняков И.Ф и др.Совершенствование МФА для обнаружения антигена вируса бешенства. Вопр.вет.вирус.,микробиологии и эпизоотологии, 1992;Т.Ч.2;-С.260-261.

41. Тургенбаев А.а. Суюбаева Б.П. перспективы и практические аспекты применения гибридомной технологии на модели вируса бешенства.// Вестник с-х науки Казахстана, 1990,Т 3,-с 69-72

42. Черкасский Б.Л. Типологическая классификация природных очагов иструктура мирового ареала природного бешенства. Журн. микробиологии,эпидемиологии и иммунобиологии, 1984; № 9 -С. 16-21• / *

43. Чернов С.М. и др. Результаты использования прямого твердофазного иммуноферментного анализа для оценки специфической активности антирабических вакцин. ЖМЭИ, «Медицина»,М 1991, №5-С. 30-33

44. Шафеева Р.С.,Фролова А.В. репродукция вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток Vero. //Цитология, 1994/Г.36,№6,-С. 587-588

45. Шашенько А.С. Распределение вируса бешенства и прижизненное обнаружение его с помощью исследования отпечатков роговицы. Автореферат дис. кан. вет. наук. Минск. 1971, 21с.

46. Шестопалов A.M. Дисурина М.И.; Груздев К.Н. Бешенство и его распространение в мире. //Вопр. вирусологии, 2001; T.46,N 2, -С. 7-12

47. Информационный бюллетень по бешенству. //ФГУ «Центр ветеринарии»., Лаборатория эпизоотологии ВИЭВ, 20005г, 41с.

48. Хисматуллина Н.А.; Разработка средств и методов иммунологического мониторинга и мер борьбы при бешенстве и лихорадке Ку животных. Автореферат дис. доктора биол. наук. -Казань, 2000, -С.48

49. Хисматуллина Н.А.; Савицкая Т.А. и др., Прижизненая диагностика гиброфобии. Междунар.науч.практ.конф.» Ветеринарные и медицинские91

50. Цыбанов Я.С. Разработка тест-системы для идентификации вируса арк- • тического бешенства на основе методов анализа генома: Автореферат дис. кан. биол. наук.-Покров, 2001. —24с.

51. Цвиль JI.А.,Родина JI.A. Эпидемическая ситуация и меры профилактики бешенства в г. Москве. Междунар.науч.практ.конф.» Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Покров ,2003,4.1.-С 146-151.

52. Alvarez Peralta Е. Rabia transmitida рог vamphos,distribution,frecuencia е importancia // Tecn.pec.en Mexico, 1997; Vol.35,N 2\ -P. 93-104

53. Aubert M. F. A. Practical significance of rabies antibodies in cats and dogs.//Rev. Sci. Tech. Off int. Epis ,1992, №11, -P 735-760

54. Arai Y.T.; YamadaK.; Kameoka Y.; Horimoto Т.; Yamamoto K.; Yabe S.; Nakayama M.; TashiroM. Nucleoprotein gene analysis of fixed and street rabies virus variants using RT-PCR //Arch.Virol., 1997; Vol. 142,N 9; -P. 17871796

55. Artois M:; Cliquet F.; Barrat J.; Schumacher C.L. Effectiveness of SAG1 oral vaccine for the long-term protection of red foxes (Vulpes vulpes) against rabies //Veter.Rec, 1997; Vol. 140,N 3 ,P. 57-59

56. Atanasiu P., Perrin P., Delegneau J. E., Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. // Proc. 3-d Gen. Meet. Eur. Soc. Anim. Cell Technol., 1979,-P 207-215

57. Albas A.; Pardo P.E.; Rinaldi P.L.F.; Tarumoto M.H. Avaliacao do metodo de contra-imunoeletroforese para titular soros de bovinos vacinados contra a raiva Veter.Zootecn., 1995; Vol.7, -P. 141-145

58. Artois M.; Charlton K.M.; Tolson N.D. Vaccinia recombinant virus expressing the rabies virus glycoprotein: safety and efficacy trials in Canadian

59. Временная инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для определения уровня антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в ИФА1. Щелково-2008г1. УТВЕРЖДАЮ:1. ВНЩИБП Я. Самуйленко2006г

60. Акт межлабораторных комиссионных испытаний метода определения антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в ИФА

61. Разработанная иммуноферментная тест-система пригодна для серологического мониторинга вакцинированных против бешенства кошек и собак.1. Заключение.

62. Комиссия рекомендует одобрить Ученым советом ВНИТИБП настоящий акт комиссионных испытаний и утвердить «Методические рекомендации по применению метода ИФА для

63. Председатель комиссии И,И.Кочиш /

64. Члены комиссии: Г.Л.Молчанова1. УфбГ П-В.Рахманинук),„^А-ЪЛРоничев

65. Акт рассмотрен на ученом совете ВНИТИБП, одобрен и рекомендован для утверждения директором института.

66. Протокол заседания ученого совета № /Г от 03. 2008г Ученый секретарь ^(^A&jT&ft Ю.Д.Фролов

источник