Об актуальных изменениях в КС узнаете, став участником программы, разработанной совместно с ЗАО «Сбербанк-АСТ». Слушателям, успешно освоившим программу выдаются удостоверения установленного образца.
Программа, разработана совместно с ЗАО «Сбербанк-АСТ». Слушателям, успешно освоившим программу, выдаются удостоверения установленного образца.
Обзор документа
Проект Приказа Министерства сельского хозяйства РФ «Об утверждении Ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, лечебных, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены на территории Российской Федерации карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов бешенства.» (подготовлен Минсельхозом России 23.03.2016)
В целях повышения эффективности борьбы с бешенством животных и в соответствии со статьей 2.2 Закона Российской Федерации от 14 мая 1993 г. N 4979-1 «О ветеринарии» (Ведомости Съезда народных депутатов Российской Федерации и Верховного Совета Российской Федерации, 1993, N 24, ст. 857; Собрание законодательства Российской Федерации, 2002, N 1, ст. 2; 2004, N 27, ст. 2711; N 35, ст. 3607; 2005, N 19, ст. 1752; 2006, N 1, ст. 10; N 52, ст. 5498; 2007, N 1, ст. 29; N 30, ст. 3805; 2008, N 24, ст. 2801; 2009, N 1, ст. 17, ст. 21; 2010, N 50, ст. 6614; 2011, N 1, ст. 6; N 30, ст. 4590; 2015, N 29, ст.4339, ст. 4359, ст. 4369) и пунктом 5.2.9 Положения о Министерстве сельского хозяйства Российской Федерации, утвержденного постановлением Правительства Российской Федерации от 12 июня 2008 г. N 450 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2008, N 25, ст. 2983; N 32, ст. 3791; N 42, ст. 4825; N 46, ст. 5337; 2009, N 1, ст. 150; N 3, ст. 378; N 6, ст. 738; N 9, ст. 1119, ст. 1121; N 27, ст. 3364; N 33, ст. 4088; 2010, N 4, ст. 394; N 5, ст. 538; N 16, ст. 1917; N 23, ст. 2833; N 26, ст. 3350; N 31, ст. 4251, 4262; N 32, ст. 4330; N 40, ст. 5068; 2011, N 6, ст. 888; N 7, ст. 983; N 12, ст. 1652; N 14, ст. 1935; N 18, ст. 2649; N 22, ст. 3179; N 36, ст. 5154; 2012, N 28, ст. 3900; N 32, ст. 4561; N 37, ст. 5001; 2013, N 10, ст. 1038; N 29, ст. 3969; N 33, ст. 4386; N 45, ст. 5822; 2014, N 4, ст. 382; N 10, ст. 1035; N 12, ст. 1297; N 28, ст. 4068; 2015, N 2, ст. 491; N 11, ст. 1611, N 26, ст. 3900; N 35, ст. 4981; N 38, ст. 5297; N 47, ст. 6603) приказываю:
Утвердить прилагаемые Ветеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов бешенства животных.
Приложение
к приказу Минсельхоза России
от N
Ветеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов бешенства животных
1.1. Настоящие Ветеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина, и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов бешенства (далее — Правила) устанавливают обязательные для исполнения требования к осуществлению профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установлению и отмене на территории Российской Федерации карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов бешенства животных, организации и проведению мероприятий по ликвидации бешенства, предотвращению его возникновения и распространения на территории Российской Федерации, определению границ территории, на которую должен распространяться режим ограничительных мероприятий и (или) карантина, в том числе в части определения очага болезни животных, осуществления эпизоотологического зонирования, включая определение видов зон в целях дифференциации ограничений, установленных решением о введении режима ограничительных мероприятий и (или) карантина, ограничений производства, перемещения, хранения и реализации товаров, подлежащих ветеринарному контролю (надзору), из перечня, утвержденного актом, составляющим право Евразийского экономического союза, и требования к особенностям применения таких ограничений, в том числе проведению мероприятий в отношении производственных объектов, находящихся в карантинной зоне.
2.1. Бешенство — Бешенство (гидрофобия) — острая вирусная зоонозная инфекция, характеризующаяся симптомами полиэнцефалита. Вирус передается главным образом со слюной при укусах.
Заболевание характеризуется длительным скрытым (бессимптомным) периодом и сопровождается тяжелым поражением центральной нервной системы (головного и спинного мозга, твердых оболочек мозга, менингеальных оболочек).
Бешенством болеют все теплокровные животные. Установлено, что повышенной чувствительностью к возбудителю бешенства отличаются дикие хищники семейства собачьих (лисица, енотовидная собака, волк, шакал, песец) и семейства куньих, а также летучие мыши, мангусты и другие виверровые, грызуны некоторых видов и домашняя кошка. Чувствительность человека, собаки, крупного рогатого скота, овец и коз, лошадей определяется как умеренная, средняя. Чувствительность птиц характеризуется как пониженная. Кошки более восприимчивы к бешенству, чем собаки, и выделяют в несколько раз большее количество вируса, чем остальные животные и собаки.
2.2. Возбудитель бешенства животных и человека — рабдовирус рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae.
Вирус отличается значительной лабильностью биологических свойств. Известно несколько биологических вариантов. Вирус неустойчив во внешней среде, быстро инактивируется подавляющим большинством дезинфицирующих средств, Вирус термолабилен: при 60° С инактивируется через 10 мин, а при 100° С — мгновенно. К низким температурам он устойчив и в течение всей зимы сохраняется в мозге зарытых в землю трупов животных. В гниющем материале остается жизнеспособным в течение 2-3 недель. При 4°С в кусочках мозга вирус сохраняет инфекционность несколько месяцев, после лиофилизации — несколько лет.
2.3 Резервуаром и главными источниками возбудителя бешенства являются дикие хищники, собаки и кошки. С учетом характера резервуара возбудителя различают природный, антропургический (городской) и ассоциированный типы энзоотий бешенства.
Природный очаг — очаг в котором циркуляция вируса осуществляется в популяциях диких плотоядных животных, кровососущих насекомых и насекомоядных летучих мышей.
Антропургический очаг (городской) — очаг в котором самостоятельная циркуляция вируса осуществляется в популяции одомашненных животных в искусственно созданной человеком экологической среде
Ассоциированный очаг (природно-антропургический) — очаг в котором осуществляется обмен вирусом между популяциями диких и одомашненных животных.
2.4. Преимущественно вирус проникает в организм через поврежденную кожу или слизистую оболочку, неповрежденная кожа непроницаема для вируса. Дальнейшее распространение и размножение возбудителя зависит от характера поражения ткани и места его внедрения, особенно большую роль играет иннервация пораженного участка. Чем богаче нервными окончаниями ткань в области ворот инфекции, тем больше возможность развития болезни.
Заражение человека и животных происходит при непосредственном контакте с источниками возбудителя бешенства в результате укуса или ослюнения поврежденных кожных покровов или наружных слизистых оболочек.
3.1. В целях предотвращения возникновения и распространения бешенства организации и граждане владельцы животных:
— соблюдать установленные правила содержания и регистрации собак, кошек, пушных зверей и хищных животных;
— доставлять принадлежащих им собак и кошек в региональные государственные учреждения ветеринарии для осмотра, диагностических исследований и вакцинации антирабической вакциной;
— не допускать собак, не вакцинированных против бешенства, в личные подворья, на фермы, в стада, отары и табуны;
— принимать меры к недопущению диких животных к стадам, отарам, табунам, животноводческим помещениям;
— перемещение животных (продажа, покупка и вывоз) собак, кошек и пушных зверей за пределы области (края, республики) разрешается при наличии оформленного ветеринарного сопроводительного документа с отметкой о вакцинации против бешенства. Допускается перемещение собак и кошек, перевозимых для личного пользования, в количестве не более 2 голов без карантинирования в сопровождении ветеринарного паспорта животного. В паспорте должны быть отметки, свидетельствующие, что животное вакцинировано в соответствии с настоящими Правилами и при этом любая последующая вакцинация против бешенства проводилась в период действия предшествующей вакцинации. В течение 5 дней до начала перемещения должен быть проведен клинический осмотр животного и в паспорте сделана соответствующая отметка ветеринарным врачом, дающая право на перемещение животного в течение 120 дней при условии, что за этот период не истекает срок действия вакцинации (ревакцинации) против бешенства.
3.2. В целях своевременного выявления и профилактики распространения бешенства диких животных юридические лица, индивидуальные предприниматели, граждане, заключившие охотхозяйственные соглашения, и федеральные органы исполнительной власти при наличии подведомственных им охотхозяйств (заказников), особо охраняемых природных территорий федерального значения:
— направляют в лабораторию (испытательный центр), входящую в систему органов и учреждений государственной ветеринарной службы Российской Федерации, или иную лабораторию (испытательный центр), научно-исследовательское учреждение аккредитованные в национальной системе аккредитации, для исследования на бешенство трупы диких хищников (лисиц, енотовидных собак, песцов, волков, корсаков, шакалов), обнаруженные в охотничьих угодьях, на территориях заповедников, заказников, в зеленых зонах крупных населенных пунктов;
— регулируют численность диких хищных животных, проводят отстрел бродячих собак и кошек в охотничьих угодьях;
3.3 Собаки, находящиеся на улицах и в иных общественных местах без сопровождающего лица, и безнадзорные кошки подлежат отлову. Порядок отлова этих животных, их содержания и использования относится к полномочиям органов государственной власти субъектов Российской Федерации.
3.4. Органы коммунального хозяйства, жилищно-эксплуатационные организации, администрация рынков, мясо- и молокоперерабатывающих предприятий, магазинов, столовых, ресторанов, домовладельцы обязаны содержать в надлежащем санитарном состоянии территории предприятий, рынки, свалки, площадки для мусора и других отходов, не допускать скопление безнадзорных собак и кошек в таких местах, принимать меры, исключающие возможность проникновения собак и кошек в подвалы, на чердаки и в другие нежилые помещения.
3.5. Во всех населенных пунктах Российской Федерации все собаки, независимо от их принадлежности, а в необходимых случаях и кошки подлежат обязательной профилактической иммунизации против бешенства с использованием зарегистрированных в соответствии с законодательством Российской Федерации антирабических вакцин, в порядке и в сроки, предусмотренные наставлениями по их применению.
3.6. Для профилактики бешенства среди диких плотоядных животных применяются вирусвакцины для оральной иммунизации, зарегистрированные в соответствии с законодательством Российской Федерации, используемые в соответствии с наставлениями по их применению.
3.7. В зонах стационарного неблагополучия по бешенству диких хищников регулярно проводят в соответствии с утвержденным планом противоэпизоотических мероприятий:
— плановую профилактическую вакцинацию сельскохозяйственных животных (прежде всего — крупного рогатого скота), подвергающихся риску заражения;
— обязательную оральную иммунизацию диких хищников против бешенства.
3.8. В целях предотвращения заноса вируса бешенства на территорию Российской Федерации запрещается ввозить на территорию Российской Федерации пушных зверей, кроликов, собак, кошек и диких плотоядных из неблагополучных хозяйств и территорий, из благополучных менее 6 месяцев, не вакцинированных против бешенства ранее, чем за 20 дней до ввоза, при этом любая последующая вакцинация против бешенства проводилась в период действия предшествующей вакцинации.
4.1. При возникновении подозрения на заболевание бешенством организации и граждане — собственники животных, юридические лица, индивидуальные предприниматели, граждане, заключившие охотхозяйственные соглашения и федеральные органы исполнительной власти при наличии подведомственных им охотхозяйств (заказников), особо охраняемых природных территорий федерального значения немедленно (в течение 24 часов) сообщают (устно или письменно) должностному лицу органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации, осуществляющего переданные полномочия в сфере ветеринарии, или подведомственного ему учреждения о подозрении на заболевание животных бешенством, о случаях заболевания или необычном поведении диких животных (отсутствие страха перед человеком, неспровоцированное нападение на людей или животных) и случаях покуса сельскохозяйственных и домашних животных дикими хищниками, собаками или кошками, принимают необходимые меры к надежной изоляции подозрительных по заболеванию или покусанных животных.
Покусавшие людей или животных собаки, кошки и другие животные (кроме явно больных бешенством) подлежат немедленной доставке владельцем или специальной бригадой по отлову безнадзорных собак и кошек в ближайшее государственное ветеринарное учреждение для осмотра и карантинирования под наблюдением специалистов в течение 10 дней.
В отдельных случаях, по разрешению руководителя государственного ветеринарного учреждения, животное, покусавшее людей или животных, может быть оставлено у владельца, выдавшего письменное обязательство содержать это животное в изолированном помещении в течение 10 дней и представлять его для осмотра в сроки, указанные ветеринарным специалистом данного учреждения, осуществляющим наблюдение.
Результаты наблюдения за карантинированным животным регистрируют в специальном журнале и в письменном виде сообщают учреждению, где прививают пострадавшего человека, и в территориальное управление Роспотребнадзора по месту жительства пострадавшего.
По окончании срока карантинирования клинически здоровые животные после предварительной вакцинации могут быть возвращены владельцам — при условии их изолированного содержания в течение 30 дней. Животных, заболевших бешенством, уничтожают.
4.2. При возникновении подозрения на заболевание бешенством животных на объектах, подведомственных федеральным органам исполнительной власти в области обороны, в сфере внутренних дел, в сфере исполнения наказаний, в сфере государственной охраны и в области обеспечения безопасности, руководители ветеринарных (ветеринарно-санитарных) служб указанных органов немедленно (в течение 24 часов) сообщают (устно или письменно) о подозрении на заболевание бешенством животных должностному лицу органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации (на территории которого расположен соответствующий объект), осуществляющего переданные полномочия в сфере ветеринарии, или подведомственного ему учреждения (подразделения); организуют и осуществляют отбор проб биологического материала и направляют эти пробы в лабораторию (испытательный центр), входящую в систему органов и учреждений государственной ветеринарной службы Российской Федерации, или иную лабораторию (испытательный центр), научно-исследовательские учреждения аккредитованные в национальной системе аккредитации для исследования на бешенство.
В случае невозможности осуществления отбора проб патологического материала руководители ветеринарных (ветеринарно-санитарных) служб органов, указанных в настоящем подпункте, оказывают содействие специалистам госветслужбы в проведении отбора и направления проб биологического материала.
4.3. Должностное лицо органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации, осуществляющего переданные полномочия в сфере ветеринарии, или подведомственного ему учреждения (подразделения) в течение 24 часов после получения информации о подозрении на возникновение очага бешенства:
— выезжает на место предполагаемого эпизоотического очага, совместно со специалистами органов, уполномоченных осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор определяет границы предполагаемого эпизоотического очага (квартиры, жилые дома, личные подворья граждан, животноводческие помещения, скотобазы, летние лагеря, участки пастбищ, охотничьи хозяйства, пастбища, часть лесного массива, урочища, другие территории и другие объекты, где обнаружены больные бешенством животные). Границы эпизоотического очага определяются с учетом эпизоотической ситуации, хозяйственных и ландшафтно-географических особенностей местности;
— проводит эпизоотологическое расследование с составлением акта;
— осуществляет отбор проб биологического материала и направляет указанные пробы в лабораторию (испытательный центр), входящую в систему органов и учреждений государственной ветеринарной службы Российской Федерации, или иную лабораторию (испытательный центр), аккредитованную в национальной системе аккредитации, для исследования на бешенство.
4.4. Должностное лицо учреждения (подразделения), подведомственного органу исполнительной власти субъекта Российской Федерации, осуществляющему переданные полномочия в сфере ветеринарии, в течение 24 часов после получения информации о подозрении на возникновение очага бешенства, информирует о подозрении на заболевание бешенством руководителя органа местного самоуправления, на территории которого располагается предполагаемый эпизоотический очаг.
4.5. Должностное лицо органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации, осуществляющего переданные полномочия в сфере ветеринарии, или подведомственного ему учреждения (подразделения):
— любым доступным способом информирует население муниципального образования, на территории которого возник предполагаемый очаг бешенства и владельцев животных о требованиях настоящих Правил по предотвращению распространения бешенства
— уточняет количество имеющегося на учете поголовья кошек, собак, пушных зверей на территории муниципального образования, восприимчивых продуктивных животных в хозяйствах в зоне предполагаемого очага бешенства, наличие и необходимость дополнительной потребности в биопрепаратах для вынужденной специфической профилактики (вакцинации) бешенства
4.6. Руководитель органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии при получении им информации (уведомления) о возникновении подозрения на бешенство, немедленно (в течение 24 часов) обеспечивает направление в населенный пункт (местность), где расположен предполагаемый очаг бешенства, специалистов госветслужбы для:
— клинического осмотра животных и проведения эпизоотологического обследования предполагаемого эпизоотического очага;
— уточнения вероятных источников, путей заноса возбудителя болезни;
— уточнения границ предполагаемого эпизоотического очага и возможных путей распространения болезни,
— организации проведения комплекса мероприятий по предупреждению распространения и ликвидации болезни в случае подтверждения подозрения на бешенство (установления диагноза на бешенство).
5.1. Лабораторные исследования материала от больных бешенством животных проводят учреждения, имеющие лицензию на работу с микроорганизмами I-II групп патогенности.
5.2. Работа по сбору, хранению, транспортировке и вирусологическому обследованию материалов от больных бешенством проводится в соответствие с действующими нормативными методическими документами.
5.3. Для исследования на бешенство в лабораторию направляют свежий труп или голову мелких животных, а от крупных — голову или головной мозг.
5.4. Лабораторные исследования на бешенство проводят немедленно. О результатах исследования сообщают в региональное государственное ветеринарное учреждение (ветеринарному специалисту, направившему биоматериал в лабораторию), и руководителю органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии — главному государственному ветеринарному инспектору субъекта Российской Федерации.
5.5. Для диагностики бешенства применяются методы микроскопического, серологического и молекулярно-генетического анализов, а также метод биологической пробы на мышах (является одним из обязательных при постановке диагноза).
5.6. Прижизненная диагностика бешенства практического применения не имеет в связи с ограниченной чувствительностью.
5.7. Положительный ответ, полученный каким-либо одним методом, аннулирует отрицательные результаты всех других тестов.
6. Установление карантина, ограничительные и иные мероприятия, направленные на ликвидацию очагов бешенства, а также на предотвращение распространения бешенства
6.1. Руководитель органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии при получении от специалистов госветслужбы и иных лиц информации об установлении диагноза на бешенство немедленно (в течение 24 часов):
— направляет в письменной форме информацию о возникновении бешенства на подведомственной территории руководителю высшего исполнительного органа государственной власти субъекта Российской Федерации, в федеральный орган исполнительной власти в области нормативно-правового регулирования в ветеринарии и федеральный орган исполнительной власти в области ветеринарного надзора, федеральный орган исполнительной власти в области санитарно-эпидемиологического надзора;
— направляет на рассмотрение высшему должностному лицу субъекта Российской Федерации представление об установлении ограничительных мероприятий (карантина);
— разрабатывает проект нормативного правового акта об установлении ограничительных мероприятий (карантина) с соответствующим перечнем ограничений к нему и направляет их на рассмотрение высшему должностному лицу субъекта Российской Федерации;
— разрабатывает и утверждает план мероприятий по ликвидации очага бешенства животных и предотвращения распространения возбудителя болезни, направляет проекты указанных документов на рассмотрение высшему должностному лицу субъекта Российской Федерации;
— направляет копию представления в федеральный орган исполнительной власти в области нормативно-правового регулирования в ветеринарии и федеральный орган исполнительной власти в области ветеринарного надзора.
— инициирует проведение заседания специальной (противоэпизоотической) комиссии соответствующего муниципального образования субъекта Российской Федерации;
6.2. Руководитель высшего исполнительного органа государственной власти субъекта Российской Федерации на основании представления руководителя органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии принимает решение об установлении ограничительных мероприятий (карантина) на территории субъекта Российской Федерации.
В случаях, когда территория, подлежащая к наложению ограничений, охватывает территории двух и более субъектов РФ, руководители высших исполнительных органов государственной власти этих субъектов или специальные (противоэпизоотические) комиссии осуществляют совместную координацию действий по определению границ и проводимых мероприятий.
В решении об установлении ограничительных мероприятий (карантина) должны быть определены эпизоотический очаг (очаги), инфицированный объект (объекты), иные объекты в зависимости от места, где установлено заболевание
6.3. Решением об установлении ограничительных мероприятий (карантин) вводятся следующие ограничительные мероприятия:
устанавливают постоянное наблюдение за группой животных (ферма, стадо, гурт, отара, табун), из которой выделены больные или подозрительные по заболеванию бешенством. Этих животных осматривают не реже трех раз в день и подвергают вынужденной вакцинации антирабической вакциной в соответствии с наставлением по ее применению. После вакцинации обязательна 60-дневная изоляция животных.
Клинически здоровых животных, покусанных дикими хищниками или собаками, разрешается, независимо от вакцинации против бешенства, убивать на мясо.
Убой производится на месте, в хозяйстве, полученная продукция используется на общих основаниях.
Молоко клинически здоровых животных неблагополучной по бешенству фермы (гурта, стада, отары, табуна) разрешается, независимо от проведенных прививок против бешенства, использовать в пищу людям или в корм животным после пастеризации при 80-85°С в течение 30 минут или кипячения в течение 5 минут.
Шерсть, полученную от клинически здоровых животных неблагополучной по бешенству группы возможно использовать только после дезинфекции паром при температуре 109-111°С в течении 30 минут.
Места, где находились животные, больные и подозрительные по заболеванию бешенством, предметы ухода за животными, одежду и другие вещи, загрязненные слюной и другими выделениями больных бешенством животных, подвергают дезинфекции.
— в неблагополучных по бешенству населенных пунктах не допускается проведение выставок собак и кошек, выводок и натаски собак. Прекращается торговля домашними животными, запрещается вывоз собак и кошек за пределы неблагополучного пункта и отлов (для вывоза в зоопарки, с целью расселения в других районах и т.д.) диких животных на карантинированной территории и в угрожаемой зоне.
6.4. Специалисты учреждения государственной ветеринарной службы подведомственного органу исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии (далее — ветеринарные специалисты подведомственного учреждения) и территориального органа уполномоченные осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор в неблагополучных по бешенству пунктах:
— проводят среди населения разъяснительную работу об опасности заболевания бешенством и мерах его предупреждения;
— организуют подворный (поквартирный) обход неблагополучного населенного пункта для выявления лиц, нуждающихся в прививках против бешенства, проверки условий содержания собак, кошек и других животных, выявления больных бешенством, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении животных;
6.5. Ветеринарные специалисты подведомственного учреждения организуют в неблагополучных по бешенству пунктах следующие мероприятия
— проводят умерщвление всех выявленных больных бешенством животных, а также собак и кошек, подозрительных по заболеванию, кроме покусавших людей или животных, которых изолируют и оставляют под наблюдением в течении 10 дней;
— трупы умерщвленных и павших от бешенства животных сжигают или утилизируют на предприятиях по производству мясокостной муки. Допускается захоронение на скотомогильниках.
— снятие шкур с трупов запрещается;
— при выявлении случаев бешенства диких животных совместно с органами охраны природы и охотничьего хозяйства принимают все доступные меры (отстрел, отлов, затравка в норах) к снижению численности диких хищников, независимо от сроков охоты, установленных в данной местности.
6.6. В случае установления карантина по бешенству на территории субъекта Российской Федерации на основании решения высшего должностного лица субъекта Российской Федерации (руководителя высшего исполнительного органа государственной власти субъекта Российской Федерации) копия указанного решения в течение дня, следующего за днем его принятия, направляется в федеральный орган исполнительной власти в области нормативно-правового регулирования в ветеринарии и федеральный орган исполнительной власти в области ветеринарного надзора.
В решении об установлении карантина должен быть указан перечень ограничений на оборот животных, продуктов животноводства, кормов и кормовых добавок, а также срок, на который устанавливается карантин.
6.7. Федеральный орган исполнительной власти в области нормативно-правового регулирования в ветеринарии принимает решение об установлении на территории субъекта Российской Федерации карантина по бешенству в случае непринятия высшим должностным лицом субъекта Российской Федерации (руководителем высшего исполнительного органа государственной власти субъекта Российской Федерации) решения об установлении карантина.
В случае принятия решения об установлении карантина указанное решение действует до его отмены федеральным органом исполнительной власти в области нормативно-правового регулирования в ветеринарии.
6.8. В случае появления угрозы возникновения и распространения бешенства на территориях двух и более субъектов Российской Федерации решением федерального органа исполнительной власти в области нормативно-правового регулирования в ветеринарии может быть установлен карантин на территориях двух и более субъектов Российской Федерации.
7.1 Карантин с неблагополучного по бешенству хозяйства, пункта, района (области, края, республики) снимают после, проведения всего комплекса ветеринарно-санитарных и противоэпизоотических мероприятий в соответствии с требованиями настоящих Ветеринарных правил, в срок, установленный решением об установлении ограничительных мероприятий (карантина).
Перед снятием карантина государственный ветеринарный инспектор органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии совместно с ветеринарным специалистом подведомственного учреждения и представителем органа исполнительной власти уполномоченного на проведение санитарно-эпидемиологического надзора проверяют полноту выполнения плана мероприятий по ликвидации очага бешенства животных и предотвращения распространения возбудителя болезни и вносят по данному вопросу конкретные предложения с составлением акта. Акт направляют руководителю органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии для оформления и подготовки материалов на снятие карантина бешенству животных. В случае выявления невыполнения утвержденного плана мероприятий по ликвидации очага бешенства животных и предотвращения распространения возбудителя болезни инициируется проведение заседания специальной (противоэпизоотической) комиссии соответствующего муниципального образования субъекта Российской Федерации.
7.2. Руководитель органа исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии при получении от должностного лица учреждения, подведомственного органу исполнительной власти субъекта Российской Федерации в области ветеринарии, заключения о выполнении предусмотренных ветеринарным законодательством Российской Федерации специальных мероприятий по ликвидации очагов бешенства, направляет в течение дня представление руководителю высшего исполнительного органа государственной власти субъекта Российской Федерации об отмене ограничительных мероприятий (карантина) на подведомственной территории, где был зарегистрирован очаг бешенства.
7.3. Руководитель высшего исполнительного органа государственной власти субъекта Российской Федерации в течение дня принимает решение об отмене (или продлении) ограничительных мероприятий (карантина) на территории, где был зарегистрирован очаг бешенства.
7.4. Карантин по бешенству отменяет руководитель высшего исполнительного органа государственной власти субъекта Российской Федерации на основе представления руководителя органа исполнительной власти в области ветеринарии — главного государственного ветеринарного инспектора субъекта Российской Федерации, по истечении двух месяцев со дня последнего случая заболевания животных бешенством при условии выполнения запланированных противоэпизоотических и профилактических мероприятий.
Представлен проект Ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов бешенства животных.
Так, закрепляются положения о профилактике бешенства, о реализации мероприятий при подозрении на инфекцию, о лабораторной диагностике.
источник
Для вирусологических исследований желательно направлять пробы от животных в трех стадиях болезни:
от свежих трупов (кровь, кость, лимфоузел и пораженные органы);
от убитых в агонии животных (кровь, кость, лимфоузлы и пораженные органы);
от выздоравливающих животных (кровь).
Пробы необходимо брать асептически, не допуская их загрязнения, в стерильные флаконы (обычно из-под антибиотиков). Каждую пробу необходимо брать в отдельный флакон. Масса каждой пробы должна быть достаточной для исследования — не менее 5—10 мл, или грамм. Все флаконы должны герметически закрываться пробками (обычно резиновыми), продезинфицированы снаружи, высушены и маркированы. Надписи необходимо делать простым карандашом с указанием вида и номера животного, названия органа и даты взятия материала. Дополнительные данные, относящиеся к анамнезу, заболеваемости, размеру очага или вспышки, симптоматике, применявшимся вакцинам, препаратам и т. п., отражают в специальной карте или сопроводительном письме. Лучшие условия для сохранения проб материалов — замораживание. Для пересылки образцы должны быть помещены в термосы со льдом или изотермические ящики, приспособленные для пересылки. Если образцы можно доставить в лабораторию в течение суток после отбора, то их не замораживают и не консервируют. Образцы, которые не могут быть доставлена в лабораторию в течение суток или в замороженном виде, необходимо консервировать глицерином. Он должен полностью покрывать кусочки взятых органов. Даже консервированные образцы желательно хранить в холодильнике. Успешная и точная диагностика зависит от быстроты доставки материалов в лабораторию. При вспышках заболеваний со значительной массовостью или смертностью из близко расположенных к лаборатории районов кроме образцов материала желательно присылать больных животных или свежие трупы. Их также необходимо доставлять с предосторожностями (упаковывать в ящики или коробки) во избежание разноса инфекции. Образцы материалов от трупов должны быть отобраны в возможно короткие сроки после смерти животного, чтобы сохранить возможности для выделения возбудителя, вызывающего заболевание. В тропическом и субтропическом климате при повышенных температуре и относительной влажности воздуха время от гибели до отбора проб не должно быть более 12 ч.
Взятие проб крови от переболевших животных.
Пробы крови берут из яремной вены у крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, из хвостовой артерии у свиней и из подкрыльцовой вены у птиц. Кровь можно брать из ушной вены. Перед взятием крови необходимо очистить и продезинфицировать кожу в месте укола или разреза. Каждую иглу или лезвие можно использовать только для одного взятия пробы.
От мелкого животного можно отрезать небольшой кусочек ребра или трубчатой кости, предварительно освободив их от мышечной и хрящевой тканей от крупных животных можно наскоблить ножом или скальпелем ткань красного мозга из любой трубчатой кости, лопатки, позвонков, грудных концов ребер. Для этого нужно обнажить суставную поверхность, срезать хрящ и концом ножа или скальпеля, вращая их, наскрести и поместить во флакон необходимое количество (5—10 г) костно-мозговой ткани. Целую кость, освобожденную от мышц, посылают в герметически заклеенном пластиковом мешке.
Отделить голову от туловища и хорошо зафиксировать. Снять кожу и мышцы с черепной коробки, сделав надрезы между глазными впадинами и от них в сторону затылка. С помощью пилы, топора, ножниц и пинцета снять черепную коробку. Отделить основные нервы, изъять мозг и поместить его на кювету или доску. Отобрать пробы коры больших полушарий и основания спинного мозга. Для исследования на бешенство необходимо брать пробы аммоновых рогов. Для этого нужно рассечь продольными разрезами каждое центральное полушарие на расстоянии 2 см (для собак) от средней линии мозга, удалить верхние части до щели (пространства), в котором находятся аммоновы рога, представляющие собой полуцилиндрические тела белого цвета. Нужно взять несколько кусочков аммоновых рогов и основания спинного мозга. Общий вес каждой пробы должен быть 5—10 г. Пробы мозга для исследования на бешенство обычно консервируют глицерином и маркируют с пометкой «Бешенство».
Отбор проб при заболеваниях с поражением эпителиальных покровов (везикулярные поражения).
При заболеваниях, которые вызывают поражение эпителиальных покровов, образование язв и абсцессов (ящур, везикулярный стоматит, оспа, бугорчатка и др.), от живых животных берут пробы крови и эпителий с участков поражения. От павших или убитых животных посылают образцы крови, лимфоузлов, кости и кусочков кожи на границе здоровых и пораженных участков. Правила отбора, консервирования, и пересылки образцов остаются такими же.
Отбор проб при подозрении на заболевания с признаками поражения нервной системы.
При заболеваниях, сопровождающихся признаками поражений нервной системы (болезнь Тешена, Ауески, отит, риккетсиоз, спорадический энцефаломиелит крупного рогатого окота, бешенство и др.), берут пробы мозга, кости, лимфоузлы, кровь и, при наличии поражений, другие органы. Следует высылать также кровь от переболевших животных для обнаружения антител в серологических реакциях. Для получения убедительных результатов желательно пересылать пробы крови от большого числа переболевших животных (до 10 проб). Правила отбора, консервирования и пересылки образцов, если нет подозрения на бешенство, остаются такими же, как было указано ранее. При подозрении на бешенство необходимо, когда это возможно, присылать целую голову, не прибегая к отбору проб мозга и других образцов. Если в лабораторию посылают целую голову, ее следует завернуть в бумагу, дополнительно упаковать в пластиковый мешок, поместить в не протекающее ведро или жестяную банку и доставить в более короткие сроки. Отбирать пробы мозга можно только при создании гарантированной безопасности специалистов, работающих с этим материалом, с последующей дезинфекцией рабочего места. Пробы мозга может отбирать только специалист, у которого нет никаких ранений на руках, обязательно резиновых перчатках. Персонал, не участвующий в этой операции, должен находиться на удалении от этого места работы.
В хозяйстве регулярно проводятся диагностические исследования на лейкоз КРС.
Взятие и подготовка материала для диагностического исследования на лейкоз. Для гематологического исследования кровь берут из яремной вены в пробирки с антикоагулянтом – 10%-ным раствором динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон В) из расчета 0,02 мл раствора на 1 мл крови. Не разрешается брать кровь от животных за 15 дней до отела и 15 дней после него. Для серологического исследования кровь берут от животных в возрасте 6 месяцев и старше. В лабораторию в термосе со льдом направляют 5-6 мл сыворотки. Для гистологического исследования кусочки пораженных органов (селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца и правого ушка сердечной мышцы, стенки сычуга, матки и скелетных мышц) посылают в свежем виде в термосе со льдом или в 10%-ном растворе формалина.
источник
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 — 92 «Межгосударственная система стандартизации. Основ* ныв положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки. принятия, применения, обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. № 57-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166)004-97
Код страны no МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 год
Информация об изменениях х настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Методы лабораторной диагностики бешенства
Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies
Дата введения — 2015 — 01 — 01
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:
• метод флуоресцирующих антител (МФА);
• метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1);
— метод иммукоферментного анализа (ИФА);
• реакция диффузионной преципитации (РДП).
1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavwus.
2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).
3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест- систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ ИСО/МЭК 17025 — 2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 12.0.004 — 90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.005-68 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.008 — 76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.4.011 — 89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 17.0.0.01 — 76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения
ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия ГОСТ 2603 — 79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 2768 — 84 Ацетон технический. Технические условия ГОСТ 4204 — 77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 6709 — 72 Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ ISO 7218 — 2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 8074 — 82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.
ГОСТ 9147 — 80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрелзратое. Технические условия ГОСТ 12026 — 76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 21241-69 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.
ГОСТ 22967 — 90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 24661 — 91 (ИСО 7866 84) Шприцы инъекционные однократного применения
ГОСТ 25046 — 81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 25336 — 82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29230 — 91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и ло выпускам ежемесячного информационного указателя «На-циональные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабДовирус), и приводящее к летальному исходу в 100 % случаев.
3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.
3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.
3.1.2 метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеиниэотиоциаиатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.
3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства. основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.
3.1.3 биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.
3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства. основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.
3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.
3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
ФАГ- флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин;
АнГ- антирабический глобулин;
КФГ — контрольный флуоресцирующий глобулин;
ФБР — фосфатно-буферный раствор;
НГУК-1-невринома Гассерова узла крысы;
РНК — рибонуклеиновая кислота:
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота:
ССЫ31 — культура клеток мышиной нейробластомы:
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами I — II групп патогенности — ло ГОСТ ISO 7218.
4.1.2 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.
4.1.3 Требования к персоналу — по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК 17025. (1).
К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами I — II групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ. вакцинированные против бешенства.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ согласно ГОСТ 12.1.008.
4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.
4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.5 Утилизацию полученного для исследования материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 15 мин при давлении (0.11 ± 0.20) МПа.
5.1 Для проведения исследований используют:
• спектрофотометр сканирующий со спектральным диапазоном измерения длин волн от 190 до 1100 нм с погрешностью не более ± 0,5 нм и диапазоном измерения оптической плотности (ОП) от 0.1 до 3.0;
• планшеты для иммунологических реакций 96-луночные:
• термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 ‘-С до 50 °С:
• холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от О °С до 10 °С по ГОСТ 16317:
— микроскоп люминесцентный инвертированный по ГОСТ 8074:
— ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147 или гомогенизатор по ГОСТ ИСО/МЭК 17025;
• стекла предметные по ГОСТ 9284:
• пробирки стеклянные по ГОСТ 25336;
— чашки Петри по ГОСТ 25336;
• пипетки вместимостью 1.0; 2,0 и 10.0 см 3 по ГОСТ 29230;
• пипетки автоматические вместимостью от 0,05 до 0,20 см 3 с наконечниками:
• пинцеты медицинские по ГОСТ 21241:
— шприцы инсулиновые вместимостью 1,0 см 3 по ГОСТ 22967 или ГОСТ 24861;
• иглы инъекционные ло ГОСТ 25046:
• стекла культуральные на восемь лунок;
• клетки для содержания мышей;
• ацетон по ГОСТ 2603 или ГОСТ 2768;
• флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ);
— антирабический глобулин (АнГ);
— контрольный флуоресцирующий глобулин (КФГ);
• масло нефлуоресцирующее иммерсионное ло ГОСТ 13739;
— воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
• раствор фосфатно-буферный молярной концентрации 0.01моль/дм 3 (ФБР). pH 7,2 — 7.4;
• культуру клеток мышиной нейробластомы ССЫ31 или неериномы Гассерова узла крысы —
— среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (ДМЕМ), pH 7,2;
• сыворотку эмбриональную крови крупного рогатого скота для культур клеток 10 %-ную;
• перекись водорода 3 %-ную по ГОСТ 177;
• набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА;
• раствор серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 по ГОСТ 4204;
• бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
• штамп для приготовления лунок;
• агар «Дифко» или аналогичный;
• раствор метилового оранжевого 1 %-ный в 50 %-ном этиловом спирте:
— антигены положительный и отрицательный;
• сыворотку антирабическую или иммуноглобулин;
— мышей белых клинически здоровых массой 6 — 8 г.
5.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше. Допускается использование посуды одноразового применения.
6.1 Для проведения исследований на наличие вируса бешенства в лабораторию направляют патологический материал — свежий труп или голову мелких животных, голову или головной мозг крупных животных.
6.2 Отобранный для исследований патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в металлических контейнерах. Замороженный материал помещают в криоконтейнер.
6.3 Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные; наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-элиэоотологические данные.
6.4 Пабораторные исследования проводят сразу же при получении патологического материала.
6.5 Для исследования отбирают от крупных животных кусочки ткани из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кору больших полушарий, продолговатый мозг) размером 0.5 — 1.0 см. мозг мелких животных, например мышей, исследуют целиком.
Для исследования МФА и методом выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) пригодны только свежие или свежезамороженные пробы ткани головного мозга. Не допускаются для исследований пробы мозга животных, разлагающиеся (в стадии загнивания), консервированные глицерином, фиксированные метиловым спиртом, формалином или другими средствами, способствующими возникновению неслецифической флуоресценции.
Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30 % -50 %*ном растворе глицерина. Использование других консервантов не допускается. Для сохранности патологический материал может быть заморожен при температуре не выше минус 10 в С.
Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс «антиген-антитело», меченный ФИТЦ. обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.
7.2 Подготовка к исследованию
7.2.1.1 Из кусочков ткани, отобранных по 6.5, готовят не менее трех препаратов (отпечатков или мазков) из каждого отдела мозга на тщательно обезжиренных предметных стеклах. Если состояние патолсгического материала позволяет, то готовят отпечатки, в остальных случаях делают мазки.
7.2.1.2 Приготовление отпечатков
Кусочки ткани, отобранные по 6.5. кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре -шесть слоев. Мозг мелких животных разрезают поперек, захватывая все его отделы, и кладут его пиниетом срезом вверх на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре — шесть слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом, слегка надавливая его до получения на стекле тонкого отпечатка.
7.2.1.3 Приготовление мазков
Кусочек ткани из каждого отдела мозга (у мелких животных весь мозг целиком), отобранный по 6.5. растирают в фарфоровой ступке пестиком до образования гомогенной массы, из которой делают мазки на предметных стеклах.
7.2.1.4 Для контроля делают мазки или отпечатки из мозга здоровых, не болевших бешенством и не вакцинированных против бешенства, белых мышей, какописано в 7.3.1.2 и 7.3.1.3.
7.2.1.5 После приготовления мазки или отпечатки высушивают на воздухе в течение 20-30 мин. фиксируют в охлажденном ацетоне при температуре 4’Св течение 4 — 12 ч или при температуре минус 20 *С в течение 1 ч. после чего извлекают из ацетона и высушивают на воздухе в течение 10 — 15 мж.
ФАГ. АнГ и КФГ растворяют дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Срок хранения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ при температуре (5 ± 2) в С — не более двух недель.
Непосредственно для исследования необходимое количество растворенных ФАГ. АнГ и КФГ разводят ФБР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Рабочие разведения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ используют в день приготовления.
7.3 Проведение исследования
Предметные стекла с препаратами (мазками или отпечатками) по 7.2.1 помещают во влажную камеру (чашку Петри или кювету с увлажненным дном). Затем на один из трех приготовленных препаратов наносят ФАГ в рабочем разведении равномерно на всю поверхность мазка или отпечатка при помощи пипетки. На второй препарат наносят рабочее разведение КФГ. Закрывают камеру с препаратами. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30
мин. Параллельно окрашивают контрольные препараты. По окончании окрашивания препараты трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20 — 30 мин.
На третий препарат наносят рабочее разведение АнГ. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30 мин. Затем препарат трехкратно промывают, погружая каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе в течение 20 — 30 мин и окрашивают рабочим разведением ФАГ. как описано выше.
На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.
8 окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым. серовато-желтым цветом.
Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины — от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15 — 20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.
Диагноз бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желтовато-зеленые гранулы. При этом в контрольных препаратах (в мазках или отпечатках из мозга здоровых не болевших бешенством белых мышей, окрашенных ФАГ), а также в исследуемых препаратах, окрашенных КФГ и предварительно обработанных АнГ и окрашенных ФАГ. подобных образований быть не должно.
О результатах исследования сообщают компетентным органам в соответствии с порядком, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
8 случае отрицательного результата проводят исследования по 8 или 9.
8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1)
нейробластомы CCL-131 или НГУК-1 с последующей его идентификацией методом флуоресцирующих антител.
Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.
8.2 Подготовка к исследованию
Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого животного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5. измельчают ножницами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0.9 %-ный изотонический раствор натрия хлорида до получения 10 %-ной суспензии. В суспензию мозга добавляют пенициллин и стрептомицин по ЮС ЕД/см 3 и 1 мг/см 3 соответственно.
Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Над осадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при температуре не выше 4 °С до использования.
8.2.2 Подготовка культуральных стекол
Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культурального флакона при помощи 0,25 %-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10 %-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3 %-ным глютамином до концентрации 2 * 10 s клеток/см 3 . В лунки культурального стекла вносят по 0.1 см 3 полученной суспензии клеток, накрывают крышкой и помещают во влажный СОг-инкубатор с содержанием СОг 5 % при температуре (37±1)°С на 18-20ч
8.3 Проведение исследования
В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0.05 см 3 суспензии из каждого отдела головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом бешенства — штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный СОг-инкубатор с содержанием СОг 5 % при температуре (37 ± 1) *С на 42 — 48 ч.
По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0.2 см 3 раствора е каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 — 30 мин. Затем в каждую лунку вносят по 0.1 см 3 охлажденного до температуры минус 20 *С ацетона и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.
После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 — 30 мин. С помощью скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В каждую лунку добавляют по 0.05 — 0.10 см 3 ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем), приготовленном в ФБР. помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37 ± 1) в С в течение 30 мин.
По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.
На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.
В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым. серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).
Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.
Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.
Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.
Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител по 7.
9.2 Подготовка проб к исследованию — по 6.2.1.
9.3 Проведение исследования
Пять — шесть белых мышей заражают 10 %*ной суспензией патологического материала им-трацеребрально в объеме 0.02 — 0,03 см 3 . Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на ко* торую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30 дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.
При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взьерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.
Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включе* кия вируса бешенства.
Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми.
Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.
8 основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антиге* лом. иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго антирабического антитела, меченного пероксидазой. продукт реакции которой окрашивается при до* бавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количеству антигена.
10.2 Подготовка к исследованию
10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально зараженных вирусом бешенства животных.
10.2.2 Приготовление исследуемого антигена
Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят 10 %*ные суспензии в С.9 %-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной бане при температуре 60 *С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.
10.2.3 Подготовка реагентов
все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22 ± 1) *С.
Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.
10.3 Проведение исследования
10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.
Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.
Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет
10.3.2 Сенсибилизация планшета
6 лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 3 ч или при температуре 4 *С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхивают. а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.
8 ряды планшета А. 8 и С вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные положительный (лунка А1) и отрицательный (лунка А2) антигены, входящие в состав набора, а также исследуемые пробы (лунки АЗ. А4 и тщ.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1 : 2 до 1 : 8. При большом количестве проб заполняют и другие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в гермостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 1 ч. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как описано в 10.3.2.
10.3.4 Внесение антирабического лероксидазного конъюгата
В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, после чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) в С в течение 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.
10.3.5 Внесение субстратной смеси
Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию проявляют в течение 15 — 30 мин при температуре (22 ± 0.5) *С в темноте. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 .
10.4 Обработка результатов
Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с инструкцией по применению набора.
Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД. то измерение оптической плотности проводят при 490 нм. если используют ТМБ. то при 450 км.
Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным антигеном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контрольным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.
При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специфичности Ксп. который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП«) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОПг). Реакцию считают положительной. если коэффициент специфичности более 2.1 и отрицательной, если менее 2.1.
ОП1 * 0,641, ОПг а 0,120, Ксп = 5,34 — реакция положительная или ОП1 = 0,180, ОПг в 0,120 Кс„ * 1,5 — реакция отрицательная.
В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 — 9.
Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.
11.2 Подготовка к исследованию
Подготовка проб к исследованию — по 8.2.1.
Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бактериальной микрофлорой.
Для приготовления агара смешивают 1.5 г агара «Дифко». 1 см 3 1 %-ного раствора метилового оранжевого в 50 %-ном этиловом спирте. 0.01 г мертиолята. 100 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по пробиркам, автоклавируют при давлении 0.5 атм в течение 30 мин и хранят в холодильнике при температуре 4 в С.
11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)
Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стекло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при комнатной температуре на 20 — 30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2.5 см 3 расплавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм. и оставляют на 20 — 30 мин. 8 застывшем слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4 — 5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.
Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10 — 15 см 3 расплавленного агара для получения слоя толщиной 2-3 мм.
11.3 Проведение исследования
Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки (иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1.0 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 1.0 см 3 антирабической сыворотки, получая разведение 1 : 2.
перемешивают, и переносят 1.0 см 3 смеси во вторую пробирку и т. д. Таким образом, получают четыре пробирки с разведениями 1 : 2.1 :4.1 : 8 и 1 :16.
8 приготовленные лунки вносят по 0.05 — 0,07 см 3 пробы мозга (каждую пробу в отдельную лунку), полученной по 8.2.1. и разведения антирабической сыворотки или иммуноглобулина (1 : 2; 1 : 4; 1 : 8:1 :16) согласно рисунку 1.
Рисунок 1 — Схема внесения материала
Ар — эммонов рог; Пм — продолговатый мозг; А+ — положительный контрольный антиген; М -мозжечок; К — кора больших полушарий; А- — отрицательный контрольный антиген.
возможно применение других схем внесения материала, но при этом обязательно использование положительного и отрицательного антигенов.
Предметные стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри с увлажненным дном или влажный эксикатор, а затем в термостат при температуре (37 ± 1) *С на 48 ч (чашки Петри накрывают крышкой и помещают в термостат).
Реакцию учитывают через 6. 24 и 48 ч.
11.4 Обработка результатов
Реакцию считают положительной при появлении даже одной линии преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими исследуемый материал и антирабическую сыворотку (иммуноглобулин).
При этом между положительным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) должна наблюдаться заметная линия преципитации, а между отрицательным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) линии преципитации быть не должно.
8 случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 -10.
[1] ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary UseУДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220
Ключевые слова: бешенство, диагностика, метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ, биопроба, реакция диффузионной преципитации
Подписано в печать 01.04.2014. Формат 60x84V
Уел. пвч. л. 1,40. Тираж 31 экэ. Зак. 1363.
Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта
источник