Прижизненный метод диагностики бешенства

Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

источник

Бешенство — острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с леталь­ным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие жи­вотные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфек­ции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от ме­ста и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1—3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основ­ном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у со­бак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (па­ралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бе­шенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения мо­жет не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Про­никая с периферии (место укуса) по нервным стволам в централь­ную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae,родуLyssavirus. Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион виру­са — РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5—10 мин, солнечный свет — за 5—7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5—10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наруж­ный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих анти­тел, а нуклеокапсидный — комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в централь­ной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культи­вируется на мышах, кроликах, морских свинках и других живот­ных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предваритель­ной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуци­рует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они переда­ют вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основ­ным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, име­ющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным мате­риалом необходимо строго соблюдать меры личной безопаснос­ти: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, ре­зиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защит­ные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством жи­вотных в полевых условиях запрещено.

Получение пат.материала. Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных — голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектици­дами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые меш­ки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика. Она включает: обнаружение вирус­ного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуо­ресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ. На обезжиренных предметных стек­лах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов голов­ного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воз­духе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влаж­ную камеру при 37 °С на 25—30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, спо­ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, нано­сят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуорес­цирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицатель­ным считают результат при отсутствии специфической флуоресцен­ции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, име­ющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве ан­тител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспери­ментальной инфекции (биопроба).

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

источник

Бешенство (Б) – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением ЦНС. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных регионах земного шара. Не отмечено случаев распространения болезни в Австралии, Великобритании, Японии. Заболевание почти всегда заканчивается смертью. Имеются фактически документированные случаи выздоровления от бешенства человека и собак после экспериментальной инфекции.

Вирус бешенства (ВБ) относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В настоящее время установлено, что ВБ имеет 4 серотипа, что обусловлено, видимо, различием в составе мембранных белков. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности. ВБ обладает ГА и ГАД свойствами. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА, антиГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) АТ.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений (они имеют меньшее значение) и, главным образом, результа­тов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного АГ в ИФ, РДП, обнаружении те­лец Бабеша — Негри и биопробе на белых мышах.

В Российской Федерации в настоящее время организовано производство наборов для диагностики Б в ИФ и РДП в ВНИТИБП и КазНИВИ.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мел­ких животных, от крупных животных — голову или головной мозг. В некоторых случаях до­пускается консервирование головного мозга в 50%-ном глицерине. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в полиэтиленовый мешок, мозг — в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитой парафином. Материал упаковывается во влагонепроницае­мую тару. Для вирусологических исследований пригоден только не консервированный мозг. Необходимо помнить, что вскрытие трупа, извлечение мозга и другие операции с патологи­ческим материалом следует проводить в условиях стерильности и строгого соблюдения мер личной профилактики: прочно фиксируют голову животного, защищают руки 2-мя парами перчаток (хирургические и анатомические), для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот-6-слойную марлевую повязку.

Лабораторные исследования материала на бешенство проводят вне всякой очереди; результаты немедленно сообщают врачу хозяйства и главному врачу района (города).

Индикация и идентификация вируса. Порядок проведения исследований: из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого) готовят по 4 мазка-отпечатки для ИФ и обнаружения телец Бабеша — Негри; с мозговой тканью ставят РДП; при отрицательных результатах ставят биопробу.

Обнаружение специфических телец-включений. Мазки-отпечатки окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматрива­ют в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша — Негри (при окраске по Селлерсу — четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплаз­ме, при окраске по Муромцеву — светло-фиолетовые с темно-синими включениями тельца Бабеша — Негри, чаще они расположены вне нервных клеток.

Наиболее характерная особенность телец Бабеша — Негри — их внутренняя структура, по­зволяющая абсолютно точно дифференцировать их. Внутри видны маленькие зернышки — базофильные зернистости темно-голубого, даже черного цвета величиной 0,2-0,5 мкм.

Диагностическая ценность обнаружения телец-включений для доказательства заражения ВБ общепризнана. Однако и у здоровых животных, в особенности у кошек и белых мышей, имеются образования, присутствие которых может вызвать диагностические затруднения. В отдельных случаях в мозге кошки можно с уверенностью дифференцировать подобные включения от телец Бабеша — Негри, и здесь рекомендуется воспользоваться методами иден­тификации, в особенности ИФ. Равным образом и у собак, погибших в результате отравле­ния змеиным ядом или поражения электрическим током, можно найти тельца-включения, напоминающие тельца Бабеша – Негри. Тельца Бабеша — Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом, и материал исследу­ется в других тестах (ИФ, РДП, биопроба).

ИФ. Один из основных тестов при диагностике Б. При высококвалифицированном вы­полнении получают в 99-100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюоресцирующего Ig. Фиксацию препаратов в охлажденном (8-10°С) ацетоне проводят не менее 4-х ч. В качестве отрицательного контроля используют мазки-отпечатки головного мозга здоровых белых мышей. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микро­скопе на основе оценки интенсивности свечения комплекса АГ-АТ. АГ ВБ выявляется в ви­де ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаружи­вают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек, В контроле подобного свечения не должно быть.

Для доказательства специфичности свечения комплекса АГ-АТ используют метод по­давления ИФ, который заключается в способности рабического АГ, связанного с нефлюоресцирующими AT, вторично не вступать в соединение с флюоресцирующими специфиче­скими AT. Для этого на фиксированные препараты, приготовленные из исследуемого голов­ного мозга, наносят 5%-ный антирабический нефлюоресцирующий Ig, выдерживают 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают физраствором, а затем окрашивают флюоресци­рующим антирабическим Ig общепринятым прямым методом. В обработанных таким обра­зом препаратах флюоресценции не должно быть.

Метод ИФ дает возможность обнаруживать ВБ в клетках роговицы глаз и предвари­тельно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического её проявления. Метод может быть использован для исследования по­дозреваемых в заболевании Б животных, а также клинически здоровых собак и кошек, по­кусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все прави­ла личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. Нужно следить, чтобы животное не моргало третьим ве­ком, так как со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Для кон­троля аналогичным образом готовят отпечатки роговицы от здоровых животных. Их можно приготовить в хозяйстве. Отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в тече­ние 4 ч при 4°С, упаковывают и отправляют в лабораторию. Окрашивают препараты, как при ИФ, по общепринятой методике.

В препаратах, полученных от больных животных или находящихся в конце инкубаци­онного периода болезни, в цитоплазме многих эпителиальных клеток наблюдаются разной формы ярко светящиеся гранулы разного размера — от пылевидных точек до 2 мкм и более. С целью получения достоверных результатов в каждом препарате просматривают по 50-100 клеток, а всего от животного — не менее 200-400 клеток. Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более кле­ток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здо­ровых животных (контроль), вследствие аутофлюоресценции, могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками.

Важно отметить, что ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постанов­ке диагноза путем биопробы, поскольку диагноз при Б может быть установлен только на 4-8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубационный период забо­левания мышей может достигать и 20 дн. ИФ может выявлять ВБ в тканях подчелюстной слюнной железы. Из подчелюстных слюнных желез готовят препараты-мазки, беря матери­ал не менее чем из 6 разных участков железы, так как распределение в ней вируса нерав­номерно. Часто, чтобы получить отпечаток, приходится делать сильный нажим, поскольку из-за обилия муцина на стекле остается мало материала.

Показана возможность идентификации ВБ в коже методом ИФ, С этой целью берут пробы кожи головы, а также фолликулы сенсорных и тактильных волос морды или лате­ральных сенсорных сосочков (на щеке собаки). Пробы хранят при -20 или -70°С. Из них де­лают криосрезы, которые обрабатывают флюоресцирующим глобулином. Результаты ИФ анализа, полученные при идентификации ВБ в коже, в высокой степени коррелируют с дан­ными, полученными при исследовании мозга того же животного. Показана близкая корре­ляция между обнаружением АГ вируса в пробах мозга и тканях губы методом ИФ.

РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге жи­вотных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микро­методом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой ме­тодике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А — аммонов рог (правая сторона); В — кора головного мозга (правая сторона); С — мозжечок (правая сторона);
Д — продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) — положительный контроль; — (минус) — отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 — лунки с разведе­нием специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно

Из каждого отдела головного мозга с помощью пинцета готовят гомогенную пастооб­разную массу, которую и помещают в соответствующие лунки. От мышей исследуют весь головной мозг. Из отделов головного мозга левой стороны готовят АГ аналогичным образом ( на каждую экспертизу в общей сложности требуется 4 предметных стекла с агаровьм ге­лем). Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии 1 или 2-3 линий преципитации между лунками, содержащими АГ и иммуноглобулин, реакцию считают положительной.

РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного АГ в ис­следуемом материале составляет 45-70. При исследовании головного мозга мышей, полу­ченного при положительной биопробе, РДП выявляет до 100% случаев. Отсутствие в иссле­дуемом материале телец Бабеша — Негри, специфической флюоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышах с последующей идентификацией вируса.

Биопроба. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша — Негри, ИФ и др. Однако и она в отдельных случаях оказыва­лась отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза Б путем обнаружения телец-включении и ИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался от 1,3 до 12.

Сведения о различной эффективности биопробы могут быть объяснены рядом факторов: выбора экспериментального животного, количества их в опыте, способа заражения, способа и срока хранения материала до поступления в лабораторию. Может играть роль и явление интерференции инфекционных частиц неактивными частицами, если для инокуляции ис­пользуют недостаточно разведенный материал.

В мозге и слюнных железах лисиц и скунсов, павших от бешенства, обнаружено вещество, ингибирующее инфекционность вируса, что не позволяет провести диагностику болезни у этих животных методом внутримозгового заражения мышей. Наличие ингибирующего вещества в исследуемом материале не препятствует выявлению вирусного АГ методом ИФ; для скун­сов и лисиц это самый чувствительный метод диагностики.

Из животных всех видов (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомячки), использованных для биопробы, многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам ВБ и менее опасны в работе. Сирийские хо­мячки по чувствительности не уступают мышам, но они менее доступны.

РСК. Выявление специфического АГ в РСК при диагностике бешенства применяется реже, чем другие методы. Из присланного для исследования мозга готовят АГ. Для этого мозговую ткань (особенно богаты АГ, связывающим комплемент, кусочки таламуса и стволового от­дела мозга) растирают в вероналовом буфере в соотношении 1:10 и оставляют при комнат­ной температуре на 1 ч, после чего суспензию инактивируют при 56°С в течение 5 ч. Такая обработка убивает вирус и снимает антикомплементарность мозговой ткани, не повреждая специфический АГ. Суспензию центрифугируют 15 мин при 3500 мин- 1 из надосадочной жидкости, которая представляет собой материал для исследования на наличие АГ, готовят 2-кратно возрастающие разведения от 1:2 до 1:64 и используют для исследования в РСК.

ИФА. В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства животных выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С 8-18 ч. Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ ВБ в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ным р-ром формалина с рН 5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.

В отличие от РН на мышах и в культуре клеток ИФА позволяет выявить AT у животных в течение нескольких часов, ИФА — наиболее перспективный лабораторный метод обнару­жения AT и индикации самого вируса. Экспресс-методом диагностики бешенства является тех­ника захвата и метод ИФ для выявления АГ ВВ. Доказано, что метод выявления АГ ВБ в парафинизированных срезах пероксидазо-антиперокисдазным методом значительно пре­восходит метод ИФА. В 1987 г. создан набор для быстрой энзимиммунодиагностики бешенства (RREID), приемлемый для эпидемиологических и лабораторных исследований.

РН. Используется редко. Рекомендуется модификация с разведением ВБ и постоянной дозы γ-глобулина. ИН 2 указывает на АГ специфичность выделенного вируса.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. С помощью монАТ к гликопротеинам ВБ селектированы АГ варианты, среди которых выделены фенотипически термола­бильные (авирулентные) варианты. При использовании 2-х групп монАТ показано, что штаммы дикования отличаются от шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA и «утиных» штаммов по АГ детерминантам. Изучение с помощью монАТ 7-ми штаммов, выделенных от больных Б людей, позволило выявить определенные отличия их от вакцинного штамма в отношении АГ детерминант.

Общепризнано, что AT отличия между дикими штаммами удается обнаружить, исполь­зуя монАТ против нуклеокапсидного AT N, которые реагируют с цитоплазматическими включениями зараженных вирусом клеток; против гликопротеина (G АГ), которые реаги­руют с мембранами инфицированных клеток, лизируют эти клетки в присутствии компле­мента и нейтрализуют вирус. В связи с возможной АГ вариабельностью поверхностного гликопротеина ВБ из различных географических зон в качестве протективного АГ исполь­зовали рибонуклеопротеин, характеризующийся консервативностью АГ структуры. Таким образом, не только G белок, но и РНП ВБ обладают протективной активностью.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Эти методы для бешенства нетипичны, поскольку используются только с целью проверки поствакцинального иммунитета. Для обнаружения и титрования поствакцинальных AT ис­пользуют РН, которую ставят общепринятым методом. В качестве АГ используют фиксиро­ванный ВБ. РН на клетках ВНК-21 была более чувствительной, чем непрямая ИФ при выяв­лении AT в сыворотках вакцинированных лис. Кроме того, предложены РТГА и ELISA.

РТГА. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за на­личия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым ВБ высокочувствите­лен, а главное, ГА АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувстви­тельностью. Для приготовления ГА АГ ВБ предложено использовать шт. Москва, выращен­ный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. ГА отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугирова­нием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой ГА активно­стью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 мес при рН 5-9.

Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную 2-кратную трипсинизацию гу­синых эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипси-низированных эритроцитов (лучше 10 7 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой р-р (рН 9) с добавле­нием 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом р-ре с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, оконча­тельный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 мин, а с эритроцитами 2-дн цыплят или макаки-резус — через 1-1,5 ч.

Разработан радиоиммунологический анализ, основанный на способности AT связы­ваться с меченым 125 1-АГ ВБ. Меченый IgG, выделенный из антирабической гипериммун­ной сыворотки, можно применять для обнаружения АГ ВБ твердофазным РИА. Лучшие ре­зультаты получены при использовании фосфатно-солевого р-ра (рН 6,0) с ионной силой 0,01 М и меченого IgG с активностью 200-250 тыс. имп./мин.

Твердофазный конкурентный РИА применим для выявления антирабических AT в сы­воротке и гибридомных супернатантах.

Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить болезнь Ауески, при кото­рой больные животные неагрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломие­лите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов ВБ, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в ПЦР сегмента гена N.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Анализ на бешенство у собак подразумевает проведение специальных экспресс-тестов на наличие в крови специфических антирабических антител. Иногда его применяют в комплексной диагностике при подозрении на заражение домашних питомцев вирусом бешенства. Данное заболевание представляет угрозу для жизни животных, человека, поэтому заводчики собак должны иметь понятие о том, как проявляется данный недуг. Если есть подозрение на заражение, если питомец имел контакт с возможным бактерионосителем, нужно сразу отвезти питомца в ветлечебницу, для проведения лабораторной диагностики, без которой невозможно установить точный диагноз.

Бешенство (rabies) – остропротекающее заболевание теплокровных животных инфекционной этиологии, вызываемое вирусом, который поражает ЦНС, провоцируя серьезные нарушения в организме. К сожалению, эффективного лечения на данный момент не разработано, поэтому инфекция всегда заканчивается летальным исходом.

Возбудитель инфекционного недуга – РНК-содержащий вирус (рабдовирус). Поражает домашних и диких животных. Существует так называемый «природный» вирус и «лабораторный».

ВАЖНО! БЕШЕНСТВО ОТНОСЯТ К ЗООАНТРОПОЗООНОЗНЫМ БОЛЕЗНЯМ, ТО ЕСТЬ ИНФЕКЦИЯ ПЕРЕДАЕТСЯ ЧЕЛОВЕКУ. ВСПЫШКИ ИНФЕКЦИИ ОТМЕЧАЮТ ВЕЗДЕ. БОЛЕЗНЬ ИМЕЕТ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЙ ХАРАКТЕР.

Природным резервуаром рабдовируса являются инфицированные плотоядные хищники. Смертельно опасный вирус содержится в слюне инфицированных особей. Инфицирование происходит контактным путем, при укусах, проникновении слюны в ссадины, ранки на дерме.

Проникнув в организм, вирус по нервным путям мгновенно перемещается в головной, спинной мозг, слюнные железы, где в дальнейшем он размножается.

В слюне инфицированных животных рабдовирус появляется примерно за три-семь дней до момента проявления первых симптомов. При этом инфицированная особь уже является вирусуносителем, представляя реальную угрозу для человека, других домашних животных. Поэтому заражение бешенством может произойти даже в том случае, если вас или вашего питомца укусило внешне здоровое животное.

Инкубационный период длиться от 2-7-ми суток до нескольких недель. Интенсивность проявления симптоматики зависит от возраста, резистентности, иммунной защиты, вирулентности, концентрации рабдовируса в организме. Смертельно опасный недуг у животных протекает в тихой, буйной, реже в атипической формах.

У собак отмечают преимущественно буйную форму инфекции, продолжительность которой составляет от шести до десяти суток. Имеет три стадии проявлении:

• Продромальную. Срок протекания меланхолической стадии — не более двух суток. На этом этапе развития инфекции отмечают изменение поведенческих манер собаки. Животные сильно угнетены, выглядят подавленными, прячутся в темных укромных местах, неохотно идут на контакт, неадекватно реагируют на раздражители.
• Маниакальную (стадия возбуждения). Продолжительность течения не более трех-четырех суток. Больные животные проявляют беспричинную агрессию к своим собратьям, другим домашним питомцам, человеку, включая хозяина. Агрессия сменяется ласковым поведением. Питомец требует внимания, лижет руки, лицо человека. Больные питомцы поедают несъедобные предметы. Нередко собаки убегают из дома и могут пробежать без устали 20-30 км.
• Паралитическую (депрессивную). Для данной стадии, продолжительность которой составляет не более шести суток, характерны тяжелые сбои в функционировании ЦНС. Отмечают паралич глотки, гортани, мышечные судороги, спазмы. Нижняя челюсть отвисает. Отсутствует глотательный рефлекс. Из пасти постоянно течет слюна. Громкие звуки, шум воды вызывает сильнейшую панику. Координация движения нарушена. Питомец впадает в кому, погибает от истощения, нарушения дыхательной, сердечной функции.

Стоит отметить, что бешеная собака, независимо от формы и стадии заболевания кусает человека, животных не предупреждая о нападении лаем.

Для тихой формы болезни характерно отсутствие стадии возбуждения. Продолжительность — от двух до пяти суток. Характеризуется общим угнетением, меланхоличностью, отсутствием реакции на внешние раздражители. Животные гибнут из-за паралича мышечных структур тела, глотки. Болезнь всегда заканчивается летальным исходом.

Реже у собак отмечают атипичную форму болезни, которая проявляется нетипичными, нехарактерными для данной инфекции проявлениями. Протекает остро, подостро, реже хронически (два-три месяца). У животных отмечают изменение поведения, сбои в работе ЦНС, ЖКТ.

Заметив нехарактерное поведение своего домашнего любимца, изменение повадок, проявление агрессии, а также если собака имела контакт или была укушена бездомными, дикими животными, обязательно нужно отвезти питомца в ветлечебницу, проверить собаку на бешенство. Не стоит забывать, что симптоматика нарастает спонтанно в определенной последовательности.

При постановке предварительного диагноза должны быть учтены данные анамнеза, паталагоанатомические результаты, эпизоотологическая ситуация, симптомы. Проводится серия лабораторных, гистологических, микроскопических, бактрериологических исследований, экспресс-тесты.

Учитывая схожесть симптоматики с другими инфекциями, проводится дифференциальная диагностика (ИФА, ПЦР). Необходимо исключить болезнь Ауески, чуму плотоядных, энцефаломиелит.

Важно! Если есть подозрение на инфекцию, животное покусало человека, собаку помещают в специальные изолированные боксы и в течение десяти дней, пока не будут готовы результаты анализов, наблюдают за ее состоянием. Если диагноз подтвердился, к сожалению, проводится эвтаназия. Животных усыпляют, поскольку лечения от данной инфекции нет.

Точный диагноз удается установить только после смерти животных. Полученный патматериал исследуют различными методами.

Наиболее достоверный метод, который всегда подтверждает болезнь – микроскопические исследования биоматериала на наличие специфических включений в мозге – телец Бабеша-Негри. Расположеные в аммоновых рогах.

Для обнаружения специфического антигена в мозге применяют реакцию диффузной преципитации, иммунофлуоресцентный анализ отпечатка роговицы.

Иммунофлуоресцентный метод позволяет максимально быстро диагностировать наличие вируса в организме собак. Метод определяет вирусный антиген в 93-97% случаях.

Учитывая то, что вирус перемещается по нервным стволам, его крайне редко удается определить в кровеносном русле. Как правило, при подозрении на заражение для анализов исследуют спинномозговую жидкость.

Серологические исследования заключаются в проведении общего, биохимического анализа крови. Отмечают изменение лейкоцитарной формулы (лейкоцитоз), олигурию, альбуминурию, глюкозурию, увеличение концентрации моноцитов.

Протестировать своего питомца на бешенство, определить напряженность поствакцинального иммунитета позволит тест на наличие специфических антирабических антител в крови. Проводится данная процедура только в аккредитованных лабораториях, некоторых ветклиниках. Стоит отметить, что стоимость данного анализа довольно высока. Результаты после проведения процедуры будут готовы через 10-20 суток.

Сегодня проводится два вида тестов на антирабические антитела – RFFIT (тест быстрого торможения фокуса флюоресценции) и FAVN – тест флуоресцентных вируснейтрализующих антител, который определяет титр антител в МЕ/мл. Данные методики выполняют на живых культурах клеточных структур с добавлением в реакцию возбудителя инфекции. У собак берется 0.5- 1 мл сыворотки крови.

Тест проводят преимущественно в том случае, если вы хотите вывезти своего питомца заграницу. Многие страны ЕС запрещают ввозить на свою территорию не привитых от бешенства животных, а также собак, котов, у которых нет результатов по данному анализу.

Сдавать тест на антитела нужно тогда, когда в крови собаки выработаются антитела к данной инфекции. Специфический иммунитет после иммунизации формируется через месяц после прививки. С этого момента можно везти питомца в лабораторию для прохождения теста на антитела к бешенству. При этом после иммунизации, если возникает потребность в проведении данного теста, от даты прививки не должно пройти более года. Тест нужно сдать не позднее месяца до срока проведения ревакцинации.

Если титр антирабических антител составляет менее 0,50 МЕ/мл – собаку ревакцинируют. Через месяц сдается повторный анализ. На продуцирование защитных антител после иммунизации влияют некоторые факторы: порода, возраст, индивидуальные особенности организма, кратность антирабической иммунизации. Ветврачи рекомендуют проводить мониторинг титра антител у собак, кошек после вакцинации, даже в том случае, если не планируется выезд за границу.

Многие владельцы вывозят своих питомцев на дачу, на природу, в лес, на охоту. Не стоит забывать, что собаку могут покусать дикие звери, которые могут быть инфицированы или являются вирусоносителями.

Единственный способ защитить собаку от смертельно опасной инфекции – своевременно проведенная вакцинация.

В дальнейшем, в зависимости от выбранного препарата, раз год проводится ревакцинация. Некоторые вакцины формируют иммунную защиту сроком на три года. Оптимальную схему вакцинаций, ревакцинаций подберет ветврач.

источник

Весь контент iLive проверяется медицинскими экспертами, чтобы обеспечить максимально возможную точность и соответствие фактам.

У нас есть строгие правила по выбору источников информации и мы ссылаемся только на авторитетные сайты, академические исследовательские институты и, по возможности, доказанные медицинские исследования. Обратите внимание, что цифры в скобках ([1], [2] и т. д.) являются интерактивными ссылками на такие исследования.

Если вы считаете, что какой-либо из наших материалов является неточным, устаревшим или иным образом сомнительным, выберите его и нажмите Ctrl + Enter.

Прижизненная диагностика бешенства заключается в определении вирусного антигена в первые дни болезни методом флюоресцирующих антител в отпечатках роговицы или в биоптатах кожи затылка, а также определением антител после 7-10-го дня болезни РН. У невакцинированных больных диагноз бешенства подтверждает четырёхкратное нарастание титра антител при исследовании парных сывороток. У вакцинированных больных при постановке диагноза опираются на абсолютный уровень нейтрализующих антител в сыворотке, а также на присутствие этих антител в спинно-мозговой жидкости. После проведения постэкспозиционной профилактики нейтрализующие антитела в спинно-мозговой жидкости обычно отсутствуют либо их титр низок (менее 1:64), в то время как при бешенстве титр нейтрализующих антител в спинно-мозговой жидкости колеблется от 1:200 до 1:160 000. С диагностической целью используют также ПЦР для обнаружения РНК вируса бешенства в биоптате мозга.

Посмертная диагностика бешенства проводится несколькими методами. Широко используют гистологический метод — экспресс-метод, при котором ответ может быть получен через 1-2 ч с достоверностью 85-90%, он основан на обнаружении телец Бабеша-Негри в мазках-отпечатках головного мозга. Тельца Бабеша-Негри при обработке препарата кислыми красками приобретают рубиновый цвет с базофильной внутренней структурой. Биологическая диагностика бешенства основана на заражении исследуемым материалом лабораторных животных (сосунков белых мышей, сирийских хомячков) и обнаружении телец Бабеша-Негри после гибели животных в мозговой ткани; ответ может быть получен через 25-30 дней. Используют также иммунологические методы — метод флюоресцирующих антител или ИФА, а также вирусологический метод, основанный на выделении и идентификации вируса бешенства.

Для посмертного лабораторного исследования у человека используют кусочки мозговой ткани (2-3 г ткани мозжечка, аммонова рога, коры больших полушарий), слюнных желёз, роговицы, которые помещают в стерильную посуду с 50% раствором глицерина на физиологическом растворе. Забор материала необходимо осуществлять в условиях строгого соблюдения противоэпидемического режима и мер личной профилактики, доставку в лабораторию производят в герметически упакованном виде, в сумке-холодильнике. В качестве материала для лабораторного исследования у животных чаще всего направляют голову, а если животное мелкое, то труп целиком. Материал помещают в полиэтиленовые пакеты, затем в герметические контейнеры с кусочками льда.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]

Консультация хирурга показана при наличии множественных рваных и нагноившихся ран, невропатолога — при клинико-лабораторных симптомах энцефалита иной природы.

Перечень показаний к госпитализации пострадавших от укусов, оцарапывания и ослюнения животными и больных гидрофобией:

• хирургические показания (множественные рваные раны, укусы в лицо, шею, кисти и пальцы рук);
• отягощенный терапевтический анамнез;
• инфицированные укушенные раны (кроме кисти);
• инфицированные укушенные раны кисти;
• отягощенный аллергологический анамнез, лица с необычными поствакцинальными реакциями и осложнениями на антирабические препараты и повторно прививаемые;
• отягощенный неврологический анамнез;
• отягощенный психоневрологический анамнез;
• беременные женщины, пострадавшие от укусов животных:
• новорождённые, пострадавшие от укусов животных;
• больные гидрофобией и пострадавшие от укусов инфицированных животных.

источник

По данным Роспотребнадзора, за январь-декабрь 2015 г. в Российской Федерации зарегистрировано 6 случаев инфицирования человека вирусом бешенства, что превышает показатели 2014 г. в два раза. Так же в стране зарегистрировано 3739 случаев заболеваемости животных, сообщает Центральная научно-методологическая ветеринарная лаборатория. Из них на долю диких животных, приходится 48,8%, собак и кошек – 37,9%, сельскохозяйственных животных – 12,4% эпизодов.

Полученные данные свидетельствуют о резком усугублении эпизоотической ситуации по бешенству, что заставляет обратить специалистов ветеринарной медицины усиленное внимание на данную проблему.

Наиболее действенным методом контроля бешенства среди животных является своевременная иммунопрофилактика и диагностика.

Возбудителем заболевания является вирус бешенства Rabies lyssavirus.

Family/ Семейство – Rhabdoviridae;

Species/ Вид — Rabies lyssavirus.

Методы лабораторной диагностики бешенства стандартизированы. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30-09-2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 г.

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства: метод флуоресцирующих антител (МФА); метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы — НГУК-1); биопроба на белых мышах; метод иммуноферментного анализа (ИФА); реакция диффузионной преципитации (РДП).

Для диагностики используются:

1. Метод флуоресцирующих антител. Выявление антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.

Для выявления вирусного антигена в мазках-отпечатках мозга используют прямую и непрямую реакцию иммунофлюоресценции. Мазки фиксируют в холодном ацетоне в течение 8-10 ч при температуре 4° С и обрабатывают во влажной камере 30 мин. антирабический иммуноглобулин, меченым ФИТЦ, промывают фосфатным буфером, высушивают и исследуют в люминесцентном микроскопе. Антигены вируса наблюдается в виде зеленых гранул разной формы и величины. В случае отрицательного результата, требуется провести другие методы диагностики.

2. Метод выделения вируса в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131. Основан на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

Суспензированый пат. материал вносят в культуру клеток, оставляя лунки для контроля. Положительный контроль — суспензия мозга мыши со штаммом вируса бешенства CVS, отрицательный — суспензия мозга клинически здоровой мыши. Далее инкубируют во влажном CO₂ инкубаторе с содержанием 5 CO₂% при 37±1°С в течении 42-28ч. Высушивают, фиксируют в холодном ацетоне в течении 30 мин, вновь высушивают. Далее с добавлением ФАГ в рабочем разведении, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при 37±1°С в течении 30 мин. По окончании трехкратно промывают, погружая на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе. Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы с четкими краями.

3. Метод биопробы. Выделение вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.

Наиболее пригодными для заражения являются мыши-сосунки. Для постановки биопробы используют 15-20 животных. Заражение проводят под наркозом путем интрацеребрального введения 0,03 мл суспензии исследуемого материала. При наличии в исследуемом материале вируса бешенства у мышей возникает тремор мышц, параличи. В большинстве случаев животные погибают в течение пяти дней. Наличие вируса бешенства в зараженных и погибших мышах необходимо подтвердить с помощью прямой реакции иммунофлуоресценции или обнаружения телец Бабеша-Негри. Идентификацию обнаруженного вируса бешенства проводят также с помощью реакции нейтрализации на белых мышах.

4. Метод иммуноферментного анализа. (ELISA) Основан на специфическом взаимодействии вирусного антигена с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго, меченного ферментом, антитела, путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

ИФА проводят в «сэндвич» варианте. На твердой фазе иммобилизуют гамма-глобулин. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положи­тельный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различ­ных разведениях. Инкубируют и отмывают. В лунки вносят антирабический пероксидазный коъюгат. После инкубации проводят отмывку. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении опти­мального окрашивания в лунках с положительным контролем. Отрицательный результат нуждается в подтверждении другими методами диагностики.

5. Реакция диффузионной преципитации. Метод, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый в виде линии преципитации.

Готовые разведения антирабической сыворотки вносят в приготовленные лунки в агаровом геле. Чашки Петри помещают в термостат при 37±1°С на 48 часов. Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-гло­булин. Отрицательный результат подтверждается другими методами.

Принимая во внимание высокую опасность болезни, обусловленную полной летальностью, специалисту ветеринарной медицины нужно знать, что окончательный диагноз может быть поставлен только методами лабораторной диагностики. Поэтому трудно переоценить значимость вышеперечисленных методов для практической ветеринарной медицины.

Библиографический список

Гайсаров, М.С. Эпизоотологическая характеристика бешенства животных в Республике Башкортостан, профилактика и меры борьбы с ним [Текст] : автореферат дис. канд. биол. наук : 16.00.03 / Гайсаров М. С.; Башкирский ГАУ. — Уфа : [б. и.], 2009. с. 18-19

Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза [Текст] / А.М. Гулюкин // М.:Вопросы вирусологии № 3, 2014 г. — с. 5-10.

Масимов, Н.А. Инфекционные болезни собак и кошек. [Электронный ресурс] / Н.А. Масимов, С.И. Лебедько. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2009. — 128 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/book/256

Методы лабораторной диагностики бешенства. [Текст] : ГОСТ 26075-2013 — Введ. 2015-01-01. — М.: Госстандарт России, 2013. — 19с.

источник