28 сентября – Всемирный день борьбы против бешенства. Он отмечается ежегодно и был утвержден по инициативе Всемирного альянса по борьбе с бешенством. Эта дата является не только одним из способов привлечения внимания к проблеме, но и данью памяти создателю вакцины от бешенства Луи Пастеру, ведь именно 28 сентября отмечается годовщина его смерти.
Несмотря на то, что сегодня существует высокоэффективная вакцина против бешенства, ежегодно около 55 тысяч человек в мире умирают от этого заболевания. Это значит, что от бешенства каждые 10 минут погибает один человек. Подавляющее большинство смертей от бешенства приходится на страны, которые не закупают вакцины и не проводят бесплатную вакцинацию пострадавших от укусов зараженных или потенциально зараженных животных.
История создания вакцины против бешенства
Луи Пастер известен в первую очередь как отец иммунизации, хотя свои открытия он совершил параллельно с Эдвардом Дженнером, который работал над созданием вакцины против натуральной оспы и преуспел в этом. К тому же, именно Дженнер дал название «вакцина» разработанному препарату, а впоследствии и всей группе подобных препаратов. Слово «вакцина» происходит от латинского «корова». Исследователь намеренно заражал человека коровьей оспой, не очень опасной для человека, чтобы в их организме выработались антитела к натуральной оспе.
Пастер также достиг больших успехов в области физики, но потомки помнят его как создателя вакцины от сибирской язвы и бешенства. Эта работа стала последним делом его жизни, которую он заканчивал уже очень больным, почти немощным стариком, перенесшим серьезный инсульт, который частично парализовал его.
Бешенство навевало ужас во все времена. В отличие от многих болезней, при которых шансы на выживание были пусть и не высокие, но все-таки были, бешенство было 100% смертельным приговором. Даже сегодня ученые называют вирус бешенства «идеальным убийцей».
Свои первые опыты Пастер проводил на собаках и пытался работать со слюной животных, потому уже в то время было известно, что болезнь передается при попадании в кровь слюны больных животных во время укуса. Однако он не достиг успеха и после череды невнятных результатов Пастер со своим коллегой Эмилем Ру пришел к выводу, что бешенство нужно искать в первую очередь в нервной системе. Эта догадка быстро подтвердилась.
Исследователи пытались выделить возбудителя бешенства и воспроизводить его. Им удалось получить препарат, зараженный ослабленным бешенством путем высушивания вытяжек спинного мозга больных животных в течение некоторого времени. Этот препарат вводили подопытным животным, и спустя некоторое время обнаружилось, что они стали невосприимчивы и к 100% заразному образцу.
В то же время работы по выделению возбудителя зашли в тупик, что очень расстраивало Пастера. Впрочем, у него не было никаких шансов обнаружить возбудителя – дело в том, что бешенство вызывается вирусом, который имеет очень малые размеры, а в 1881-1885 годах, когда Пастер работал над этой проблемой, до изобретения электронных микроскопов было еще очень далеко.
К тому же, Пастера ждала очень серьезная часть работы – это опыты на людях. Первые испытания провалились, один из пациентов скрылся в неизвестном направлении, а заболевшая девочка не выжила, потому что болезнь зашла слишком далеко. На тот момент Пастер еще не знал, что вакцинация бесполезна после появлением первых признаков заболевания.
Как это часто бывает, помог Пастеру случай. В июле 1885 года к нему привели ребенка по имени Жозефа Мейстера, который был сильно искусан бешенным животным. Поскольку в те времена уже было известно о 100% летальности бешенства, надежды у родителей не было, так что Пастер оставался единственным, пусть и призрачным, шансом на спасение. Особенность ситуации была в том, что раны мальчик получил буквально накануне. О вакцинации Жозефа было известно всему городу и все с нетерпением ждали результатов. Раны ребенка зажили и болезнь не развилась. Это стало огромным шагов в борьбе с бешенством. В лабораторию Пастера приезжали пострадавшие от бешенных животных из разных стран Европы и даже из России.
Спустя два года после первой успешной вакцинации, в 1887 году ученый открыл в Париже Институт Пастер, а его метод стал широко применяться во всем мире. Пастеровские станции вакцинации против бешенства появлялись во всем мире. В их числе были и антирабические станции в Одессе и Львове.
Именно создание вакцин от сибирской язвы и бешенства сделало Пастера одним из самых известных людей своего времени. Он был награжден огромным количеством медалей и орденов, а во всем мире существуют сотни лабораторий, институтов и центров имени Пастера.
Бешенство по-прежнему опасно!
Несмотря на высокую эффективность вакцинации, она не производится массово ввиду ряда ограничений. Срок действия вакцинации – около одного года, вакцина имеет высокую стоимость, а бешенство не является широко распространенным заболеванием.
Массовая вакцинация показана животным, особенно собакам. Их вакцинируют ежегодно. В Украине существуют программы вакцинации домашних животных, которые финансируются государством – привить собак и кошек в нашей стране можно бесплатно в государственных ветеринарных клиниках.
Что касается людей, то регулярную вакцинацию проводят только людям, работа которых сопряжена с риском заражения. Это ветеринары, лесничие, волонтеры, которые работают с бродячими животными и т.д. Во всех остальных случаях вакцинация проводится только по показаниям. Вакцина против бешенства не имеет абсолютных противопоказаний и в случае контакта с зараженным животным иммунизацию проводят вне зависимости от других факторов. В сравнении с риском развития бешенства риск побочных эффектов нивелируется. Стоит отметить, что в большинстве случаев антирабическая вакцина хорошо переносится.
Если вас или вашего ребенка покусала собака, кошка, лиса или любое другое животное следует немедленно обратиться за медицинской помощью! Безопасными считаются только привитые домашние животные, если с момента последней вакцинации не прошел год, во всех остальных случаях показано немедленное начало вакцинации и наблюдение за животным. Если наблюдение по каким-то причинам невозможно, то рекомендован полный курс вакцинации.
Следует всегда помнить, что бешенство неизлечимо и 100% смертельно после появления первых симптомов. Будьте осторожны и внимательны!
источник
Первый, но чрезвычайно важный шаг к борьбе с бешенством сделал гениальный французский химик и микробиолог Луи Пастер. Разработку вакцины против этого заболевания он начал в 1880 году, после того как ему пришлось наблюдать агонию пятилетней девочки, укушенной бешеной собакой.
Хотя впервые бешенство было описано еще в I веке до н.э. римлянином Корнелием Цельсом, спустя почти 2000 лет об этой болезни было известно ничтожно мало. Лишь в 1903 году, спустя восемь лет после смерти Пастера, французский врач Пьер Ремленже установил, что бешенство вызывается субмикроскопической формой жизни — фильтрующимся вирусом.
Пастер, не имея этой информации, тем не менее не собирался сдаваться: для создания вакцины он избрал обходной путь — найти вместилище «яда» и превратить его в противоядие. Достоверно было известно, что нечто, передающееся от больного животного к другому животному или человеку вместе с зараженной слюной, поражает нервную систему. В ходе экспериментов было установлено, что у заболевания очень длительный инкубационный период, но это лишь подстегнуло Пастера и его коллег, поскольку означало, что у медиков есть возможность повлиять на медленно развивающийся патологический процесс, — «яду» нужно было по периферическим нервам добраться до спинного, а потом и головного мозга.
Затем начались эксперименты на кроликах с целью получить максимально смертельный «яд» бешенства в больших количествах. После десятков перенесений ткани мозга от больного животного в мозг здорового, от него — следующему ученым удалось добиться того, что стандартная вытяжка из мозга убивала кролика ровно за семь дней вместо обычных 16−21. Теперь нужно было найти способ ослабить возбудитель бешенства (методика создания вакцин — ослабление возбудителя — тоже открытие Пастера). И способ нашли: двухнедельная сушка пропитанной вирусом ткани кроличьего мозга над поглощающей влагу щелочью.
После введения суспензии из полученного препарата зараженная бешенством собака не только выздоровела, но и стала абсолютно невосприимчива к бешенству, какое бы количество «яда» ей ни вводили.
Окончательно убедившись, что на вакцинированных собак не действует тот самый семидневный лабораторный «яд», исследователи провели жестокий эксперимент: к привитым собакам запустили их больных бешенством сородичей. Покусанные дворняги не заболели!
Затем настала очередь людей. Но где найти добровольцев? Доведенный до отчаяния, Пастер был готов пожертвовать собой ради науки, но, к счастью, вмешался Его Величество Случай.
6 июля 1885 года на пороге парижской лаборатории Пастера появилась заплаканная женщина, державшая за руку девятилетнего сына — Йозефа Майстера. За три дня до этого мальчика покусала бешеная собака, нанеся ему 14 открытых ран. Последствия были вполне предсказуемы: в то время уже было известно, что смерть в таких случаях практически неминуема. Однако отец мальчика был наслышан о работах Пастера и настоял на том, чтобы привезти ребенка из Эльзаса в Париж. После серьезных колебаний Пастер ввел маленькому пациенту экспериментальный препарат, и Йозеф стал первым в истории человеком, спасенным от бешенства.
Возбудитель бешенства (Rabies virus) относится к семейству рабдовирусов (Rhabdoviridae), содержащих одноцепочечную линейную молекулу РНК, роду Lyssavirus. По форме он напоминает пулю длиной около 180 и диаметром 75 нм. В настоящее время известно 7 генотипов.
Вирус бешенства обладает тропностью (сродством) к нервной ткани, так же, как вирусы гриппа — к эпителию дыхательных путей. Он проникает в периферические нервы и со скоростью примерно 3 мм/ч движется в центральные отделы нервной системы. Затем нейрогенным путем он распространяется и на другие органы, в основном — на слюнные железы.
Вероятность заболевания зависит от места и тяжести укусов: при укусах бешеными животными в лицо и шею бешенство развивается в среднем в 90% случаев, в кисти рук — в 63%, а в бедра и в руки выше локтя — лишь в 23% случаев.
Основными дикими животными — источниками заражения — являются волки, лисицы, шакалы, енотовидные собаки, барсуки, скунсы, летучие мыши. Среди домашних опасны кошки и собаки, причем именно на последних приходится максимум подтвержденных случаев передачи бешенства человеку. Большинство больных зверей погибает в течение 7−10 дней, единственное описанное исключение — желтый, он же лисицевидный мангуст Cynictis penicillata, способный носить в себе вирус без развития клинической картины инфекции в течение нескольких лет.
Наиболее характерным и достоверным признаком наличия вируса в организме человека или животного является обнаружение так называемых телец Негри, специфических включений в цитоплазме нейронов диаметром около 10 нм. Впрочем, у 20% пациентов тельца Негри найти не удается, так что их отсутствие не исключает диагноз бешенства.
На фото — вирус бешенства под электронным микроскопом.
В Париж потянулись люди со всего света — алжирцы, австралийцы, американцы, русские, причем зачастую по‑французски они знали только одно слово: «Пастер». Несмотря на такой успех, первооткрывателю вакцины от смертельной болезни пришлось услышать в свой адрес и слово «убийца». Дело в том, что не все покусанные выживали после прививки. Тщетно Пастер пытался объяснять, что они обращались слишком поздно — кто-то через две недели после нападения животного, а кто-то и через полтора месяца. В 1887 году на заседании Академии медицины коллеги напрямую обвинили Пастера в том, что кусочками мозга кроликов он попросту убивает людей. Ученый, отдавший науке все силы, не выдержал — 23 октября у него развился второй инсульт, от которого он так и не оправился до самой смерти в 1895 году.
Но его поддержали простые люди. По подписке за полтора года жители многих стран мира собрали 2,5 млн франков, на которые был создан Институт Пастера, официально открытый 14 ноября 1888 года. На его территории находится музей и усыпальница исследователя, спасшего человечество от смертельно опасной инфекции. Дата смерти Пастера, 28 сентября, выбрана Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для проведения ежегодного Всемирного дня борьбы против бешенства.
Долгое время вакцину вводили под кожу передней брюшной стенки, причем для проведения полного курса требовалось до 40 инъекций. Современный иммунопрепарат вводится внутримышечно, в плечо, достаточно шести визитов в травмпункт.
В течение XX века ситуация с бешенством была однозначной: если пострадавшего не прививали вовремя или он вообще не получал вакцину, дело заканчивалось трагически. По подсчетам ВОЗ, ежегодно в мире после нападения бешеных животных погибает 50−55 тысяч человек, 95% из них приходится на Африку и Азию.
О возможности полноценного лечения инфекции заговорили лишь в XXI веке. Связано это было со случаем американки Джины Гис, которая впервые в истории медицины не получала вакцину, но выжила после появления симптомов бешенства. 12 сентября 2004 года 15-летняя Джина поймала летучую мышь, которая укусила ее за палец. Родители не стали обращаться к врачу, посчитав рану пустяковой, но спустя 37 дней у девочки развилась клиническая картина инфекции: подъем температуры до 39 °C, тремор, двоение в глазах, затруднение речи — все признаки поражения центральной нервной системы. Джину направили в детский госпиталь Висконсина, и в лаборатории Центра по контролю и предотвращению заболеваний (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) в Атланте подтвердили бешенство.
С бактериальными инфекциями человечество борется относительно успешно. Антибиотики и вакцины делают свое дело, да и санитария с эпидемиологией на высоте. С вирусами все намного сложнее. Достаточно вспомнить грипп, которым население Земли болеет с завидной регулярностью, несмотря на все достижения науки и наличие вакцин и противовирусных препаратов.
В первую очередь это связано со способностью вирусов изменяться самым непредсказуемым образом. Некоторые, как возбудители гриппа, меняют белки своей оболочки, как перчатки, поэтому выработать против них высокоточное оружие до сих пор не получается.
В борьбе с заболеваниями успех приходил тогда, когда у вируса обнаруживался слабый двойник, не убивавший человека, но оставлявший после себя мощный перекрестный иммунитет. Преднамеренное заражение более слабым штаммом позволяло защититься от смертельно опасного. Классический случай, с которого началась история вакцинации — натуральная и коровья оспа, затем подобная история повторилась с полиомиелитом. Летом 2012 года появилась надежда, что по аналогичному сценарию удастся справиться с бешенством.
Родителям предложили попробовать на девочке экспериментальный метод лечения. Получив согласие, врачи при помощи кетамина и мидазолама ввели пациентку в искусственную кому, фактически отключив ее головной мозг. Она также получала антивирусную терапию в виде комбинации рибавирина и амантадина. В таком состоянии врачи держали ее, пока иммунная система не начала вырабатывать достаточное количество антител, чтобы справиться с вирусом. На это потребовалось шесть дней.
Через месяц анализы подтвердили: в организме девочки нет вируса. Мало того, мозговые функции были нарушены минимально — она закончила школу, а спустя год получила водительские права. В настоящее время Джина окончила колледж и намерена продолжать обучение в университете. Неудивительно, что своей будущей профессией она видит биологию или ветеринарию, а специализироваться планирует именно в области бешенства.
Чтобы попасть в клетку, вирус бешенства использует эндосомальную систему транспорта: клетка должна сама захватить его и втянуть образовавшийся из клеточной оболочки пузырёк — эндосому, «внутреннее тело» — в цитоплазму. Активация этого процесса происходит после связывания вируса с особыми белками-рецепторами на клеточной мембране. Образовавшаяся эндосома со временем распадается, вирусная частица выпускает РНК, далее все идет по стандартному сценарию.
Протокол лечения, который применили к девочке, назвали «Милуокским», или «Висконсинским». Его неоднократно пытались воспроизвести в других лечебных учреждениях… но, увы, без особых успехов. Первая версия протокола была опробована на 25 пациентах, из них выжили только двое. Вторая версия, из которой был исключен рибавирин, но добавлены препараты для предотвращения сосудистого спазма, была применена к десяти пациентам и предотвратила смерть двух из них.
При проведении эпидемиологических расследований оказалось, что пациентов, которых удалось вылечить с помощью Милуокского протокола, кусали летучие мыши. Именно этот факт позволил некоторым ученым предположить, что на самом деле методика лечения тут ни при чем, а дело именно в этих млекопитающих, а точнее в том, что они заражены другим штаммом вируса, менее опасным для человека.
В 2012 году это предположение получило первые подтверждения. В American Journal of Tropical Medicine and Hygiene появилась статья группы экспертов CDC, американских военных вирусологов и эпидемиологов министерства здравоохранения Перу. Результаты их исследования произвели эффект разорвавшейся бомбы: в перуанских джунглях удалось обнаружить людей, у которых в крови есть антитела к вирусу бешенства. Этим людям никогда не вводили никаких вакцин, более того, они даже не помнят, чтобы болели чем-нибудь серьезным. А это означает, что бешенство смертельно не на 100%!
«Из этого района перуанских амазонских джунглей за последние 20 лет поступало множество сообщений о контакте с летучими мышами-вампирами и случаях бешенства среди людей и домашних животных, — объясняет «ПМ» ведущий автор исследования доктор Эми Гилберт, работающая в CDC в программе по изучению бешенства. — Деревни и фермерские хозяйства, которые мы обследовали, находятся в весьма удаленных от цивилизации местах — до ближайшей больницы, например, два дня пути, причем на некоторых участках передвижение возможно исключительно на лодках по воде».
В процессе опроса жителей 63 из 92 человек сообщили ученым об укусах летучих мышей. У этих людей, а также у местных летучих вампиров были взяты пробы крови. Результаты анализов оказались неожиданными: в семи пробах обнаружили антитела, нейтрализующие вирус бешенства.
Наличие антител можно было бы объяснить введением антирабической (лат. rabies — бешенство) вакцины, но, как выяснилось, такую вакцину получал только один из семи человек. Остальные переболели бешенством не только без смертельного исхода, но даже без каких-либо серьезных симптомов. В двух перуанских деревеньках обнаружилось больше выживших после этой инфекции, чем описано во всей медицинской литературе! Неудивительно, что группа Гилберт два года перепроверяла полученные данные, прежде чем решилась их опубликовать.
«Скорее всего, имеет место уникальное стечение обстоятельств, когда местное население регулярно контактирует с особым нелетальным штаммом вируса бешенства, — говорит доктор Гилберт. — При этом происходит естественная вакцинация, что подтверждается достаточно высокими титрами антител. Впрочем, это еще требует дополнительных подтверждений и уточнений».
«Смерть этого ребенка представлялась неизбежной, поэтому я решил, не без серьезных сомнений и тревоги, что хорошо объяснимо, испытать на Джозефе Майстере метод, который я нашел успешным в лечении собак. В результате, через 60 часов после укусов, в присутствии докторов Вильпо и Гранше, юный Майстер был вакцинирован половиной шприца вытяжки из спинного мозга кролика, умершего от бешенства, перед этим обработанной сухим воздухом 15 дней. Всего я сделал 13 инъекций, по одной каждый следующий день, постепенно вводя все более смертоносную дозу. Через три месяца я обследовал мальчика и нашел его полностью здоровым».
Ее точку зрения разделяют и российские коллеги. Вирусолог Александр Иванов из Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, которого «ПМ» попросила прокомментировать находку экспертов CDC, подчеркнул, что эти странные на первый взгляд результаты могут иметь вполне научное объяснение: «На основании имеющихся данных можно предположить, что местные жители были инфицированы вариантами вируса, которые по ряду причин обладали низкой репликативной активностью (способностью к размножению) и низкой патогенностью («ядовитостью»). По моему мнению, это может быть обусловлено несколькими факторами. Во‑первых, у каждого вируса существует огромное число вариантов ввиду его сравнительно высокой изменчивости. Инфекционисты предполагают, что даже для успешного перехода от летучих мышей к другим видам вирус бешенства должен пройти несколько определенных мутаций. Если это так, то многие штаммы вируса, переносимые летучими мышами, могут быть малоопасными для человека. Во‑вторых, мутации в геноме вируса влияют на его узнавание иммунной системой, а также на возможности вируса блокировать иммунный ответ на инфекцию. В то же время именно те варианты вируса бешенства, которые способны ускользать от системы врожденного иммунитета, обладают повышенной патогенностью. Таким образом, эти факты действительно позволяют предположить существование в популяции летучих мышей таких штаммов вируса бешенства, которые вовремя распознаются и уничтожаются иммунной системой человека, не вызывая фатальных последствий».
Но ни в коем случае — это подчеркивают все специалисты, включая авторов исследования — нельзя отказываться от введения антирабической вакцины при укусах диких животных. Во‑первых, действительно может оказаться, что в летучих мышах живет другая разновидность вируса, более слабая, и везение перуанских крестьян не распространяется на штаммы, передающиеся с укусами собак или енотов. Во‑вторых, результаты и выводы данного исследования могут оказаться ошибочными, так что лишний раз подвергаться риску нет никакого смысла.
источник
В чем же заключается метод создания вакцины против бешенства? Какими путями шел Пастер, чтобы ослабить возбудителя бешенства? Как он добился успеха на этом трудном и опасном пути? Наконец, были ли у Пастера предшественники в создании вакцин против заразных болезней, когда он начинал свои исследования по бешенству? Конечно, были, и прежде всего Эдуард Дженнер, создатель вакцины против оспы.
Но главным предшественником Пастера при разработке вакцины против бешенства был он сам, до этого впервые создавший вакцины против куриной холеры и сибирской язвы, пользуясь известным уже читателю методом аттенуации. Но создание вакцины против бешенства не могло быть простым продолжением прежних его работ.
Не говоря уже о том, что бешенство совершенно иное заболевание, протекающее по иным закономерностям, с иным возбудителем и имеющее особые свойства, были и другие условия, осложнявшие и без того трудную работу. Когда Пастер создавал вакцины против куриной холеры и сибирской язвы, в руках у ученого были чистые культуры, с которыми он ставил опыты. Но еще никому не удавалось не только получить, но даже увидеть микроба бешенства. Как же изучать бешенство? С чего начать? Как получать экспериментально заболевание у животных? Ведь для изучения его всегда надо иметь под руками больных животных.
Жизнь подсказывала метод и в сущности очень простой. Достаточно было бросить бешеную собаку в клетку к здоровым, чтобы, покусанные, они заболели бешенством. Можно было ввести шприцем в кожу животных слюну бешеной собаки и таким путем также получить заболевание.
Да, такие методы допускали возможность заражения животных, но они были недостаточно надежными для экспериментов. Одни собаки заболевали после инкубационного периода 1 в 14 дней, другие — через 60 дней, третьи — через несколько месяцев после заражения. Были собаки, которые совсем не заболевали. По-видимому, в тех каплях слюны, которые попадали в рану, возбудителей бешенства не оказалось.
Таким образом, возникновение бешенства зависело от количества возбудителя, попадавшего в рану, от силы его болезнетворных свойств — вирулентности, от обширности и глубины ран при укусах, от места укусов и свойств организма, в который попадал вирус бешенства, а также от многих других причин.
То, что было известно Пастеру о поражении нервной системы при бешенстве, натолкнуло его на мысль использовать мозг больного животного. Но будет ли мозг бешеных животных более надежным материалом для экспериментов, чем слюна? Но куда вводить его, чтобы вызывать закономерное возникновение экспериментального бешенства? Обязательно ли нужно заражать собак или можно пользоваться другими более удобными лабораторными животными, например кроликами? Как добиться постоянства силы возбудителя, чтобы при определенной дозе вызывать бешенство через определенное количество дней? Ведь если нет культуры микробов бешенства, надо чтобы материал для опытов, т. е. мозг зараженных животных, содержал вирус всегда определенной силы. Эти и многие другие вопросы требовали разрешения.
Опыт подсказывал, что растертый мозг в виде взвеси в бульоне или физиологическом растворе можно вводить под кожу или, что еще лучше, непосредственно в мозг. Но как это сделать? Химик по образованию, Пастер опасался, что такое грубое внедрение в мозг грозит параличом и гибелью животных и был против такой методики. Работа зашла в тупик. Судьба величайшего открытия висела на волоске.
Но ближайший помощник Пастера, врач по образованию, Эмиль нашел выход.
источник
Пастер принялся отыскивать вакцину против сибирской язвы. Прежде всего он убедился на опыте, что животные, перенесшие болезнь, становятся невосприимчивыми: если им привить смертельный яд, они переносят прививку благополучно. Эта болезнь того же типа, что и куриная холера: ее микроб или убивает животное, или, если не убьет, то послужит предохранительной прививкой. Значит, можно быть уверенным, что, ослабив ядовитость микроба, превратишь его в противоядие.
Пастер искал способ ослабления (аттенуации) заразительности бактерий. Под влиянием кислорода бактерии сибирской язвы распадаются на мельчайшие крупинки – споры, на которые кислород уже не действует: они сохраняют свою ядовитость неослабленной. Пастер решил найти такие условия, при которых бактерии не распадаются на споры. Началась работа. После многочисленных опытов, сопровождавшихся варьированием условий культуры, он нашел наконец способ ослаблять «сибиреязвенных» бактерий действием высокой температуры воздуха.
5 мая 1881 г. на ферме Пуй ле Фор под Парижем начался невиданный в истории медицины публичный эксперимент: 27 животных (главным образом – овцы) были привиты полученной Пастером вакциной против сибирской язвы. 17 мая им была сделана прививка повторно, но уже менее ослабленной вакциной, а 31 мая наступил решающий момент: всех вакцинированных животных и столько же невакцинированных заразили смертельной дозой палочки сибирской язвы. Перед этим опытом Пастер уверенно заявил, что все вакцинированные животные устоят перед инфекцией, а невакцинированные – умрут. Так и получилось. Блестящий успех этого эксперимента показал, что человечество получило надежное оружие борьбы против инфекционных болезней.
В 1885 г. работы Пастера и его учеников Ру и Шамберлана открыли новую страницу в борьбе с бешенством. В 1982 г., после избрания его членом Французской академии, Пастер занялся исследованием возможности профилактики заболевания бешенством. Нужно было создать вакцину для прививок против бешенства. Задача была крайне трудной, поскольку несмертельных разновидностей заболевания нет. В отличие от Дженнера Пастер работал с вирулентным возбудителем, способным вызвать заболевание и смерть. Необходимо было как-то ослабить возбудитель.
Поскольку бешенство передается со слюной при укусе, ученые, естественно, предположили, что возбудитель находится в слюне. С этого и начали исследования. В пасть корчившейся в муках бешеной собаке Пастер вставлял стеклянную трубочку и ртом всасывал в нее слюну животного. Смерть витала на кончике трубки, и только крохотный комочек ваты защищал ученого от контакта со слюной бешеного животного.
Ученые упорно продолжали поиски, но им не удалось обнаружить возбудителя бешенства в слюне укушенного животного. Значительно позже он был найден в мозге. Но, не зная природы возбудителя и места его нахождения, Пастер и его сотрудники, тем не менее, создали вакцину против бешенства.
Продолжая экспериментировать, ученые обнаружили, что одни собаки заболевали после инкубационного периода в 14 дней, другие – через 60 дней, третьи – через несколько месяцев после заражения. Но были и собаки, которые не заболевали. Исследователи пришли к выводу, что развитие заболевания зависит от количества возбудителя, попавшего в рану, от его вирулентности, от обширности и глубины ран при укусах, от мест укусов и других причин.
Основываясь на мнении французского ученого Галтье о том, что бешенство – болезнь нервной системы, Пастер решил использовать мозг больного животного. Опыт работы подсказывал, что растертый мозг в виде взвеси в бульоне или физиологическом растворе можно вводить под кожу или непосредственно в мозг животного. Ру – ученик Пастера – выработал для этого надежную экспериментальную методику: при помощи трепана (инструмента для просверливания кости) вырезается кусочек из теменной кости животного и через образовавшееся отверстие под твердую оболочку вводится несколько капель взвеси из продолговатого мозга бешеного животного. Этим способом, во-первых, достигались всегда одинаковые результаты, кроме того, он оказался надежным для постановки диагноза бешенства, которое не оставляет типичных изменений на трупе.
Со временем собак заменили кролики. Пастер, заражая кроликов мозгом бешеного животного, вначале вызывал у них заболевание через 12 дней. Путем длительных исследований, перевивая клетки головного и спинного мозга бешеных кроликов сотни раз, ученый добился сокращения инкубационного периода. Теперь экспериментальное бешенство у кроликов обычно наступало через 5–6 дней после заражения. За счет сокращения скрытого периода ученый повысил вирулентность возбудителя бешенства у кроликов.
Материал для создания вакцины был найден, хотя это была и не чистая культура возбудителя, выращенная на искусственной питательной среде.
Для ослабления возбудителя Пастер со своими учениками высушивали мозг зараженного бешенством кролика. При 5–6-дневной сушке мозга в банке над едким натром вирулентность его сильно ослабевала. Теперь возбудитель вызывал бешенство только после увеличения периода инкубации. Полученные результаты позволили предположить, что высушенный мозг кроликов можно использовать как ослабленную вакцину.
Для первой прививки использовали мозг 14-дневной сушки (период максимальной безопасности), затем продолжали последовательно вводить суспензию мозга 13-, 12-, 11-дневной и т.д. вплоть до однодневной сушки. Животные оставались здоровыми. Прививки оказались безопасными. Но нужны были доказательства их эффективности.
Вакцинированные собаки после введения возбудителя бешенства в смертельной дозе выжили и были совершенно здоровы. В то же время невакцинированные собаки (контрольные) после инкубационного периода заболели и все погибли.
Но нужно было проверить, как вакцина будет «работать»в организме человека, укушенного бешеным животным? Окажет ли вакцина предохранительное действие?
Пастер не мог сразу решиться начать вакцинацию людей, хотя многое было уже изучено. Ру и Шамберлан, его верные ученики, в этот период также отказались вакцинировать людей, считая прививки преждевременными.
Но неожиданный случай изменил ситуацию. К Пастеру привели девятилетнего мальчика, Жозефа Мейстера, сильно искусанного бешеной собакой (раны на руке, голенях, бедрах, некоторые настолько глубокие, что мешали ходить). Смерть ребенка была неизбежна. Несчастная мать умоляла ученого вакцинировать сына. Пришлось сделать ребенку прививку, всегда удававшуюся на собаках. Мальчик был спасен. Это произошло 6 июля 1885 г. и стало знаменательной датой в истории пастеровских прививок против бешенства.
Вторым пациентом ученого оказался 15-летний пастух Жюпиль, искусанный бешеным волком. Курс прививок спас жизнь и ему.
Весть о спасении Мейстера и Жюпеля разнеслась по всему миру. Из разных стран к Пастеру стали приезжать искусанные бешеными животными люди. Так, из далекой России, из Смоленска, в Париж приехало 19 крестьян, искусанных бешеным волком. Прошло 20 дней после нападения на них зверя. Люди были так истерзаны, что не могли ходить. Их поместили в больницу.
Вакцина спасла всех, кроме трех из обреченных крестьян. Без вакцинирования же они все бы погибли, поскольку прошло слишком много времени с момента укуса.
За полтора года (к концу 1886 г.) 2,5 тыс. человек избежали мучительной и в прошлом неминуемой гибели от бешенства.
Скептики, даже среди ученых и врачей, еще в самом начале работы были против вакцин Пастера. А позже, когда появились сообщения о смертельных исходах, развернулась кампания против ученого, началась травля старого Пастера. Его называли шарлатаном, виновником смерти людей. Требовали прекращения вакцинации. Его незаслуженно обвиняли в гибели отдельных больных, умерших не в результате вакцинации.
источник
Изобретение предназначено для изготовления средств специфической профилактики бешенства всех видов сельскохозяйственных и домашних животных. Фиксированный вирус бешенства (ВБ) культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при 35-37°С в течение 96-144 ч. По окончании репродукции ВБ в вируссодержащую суспензию вносят сначала в качестве стабилизатора полиакриловую кислоту (ПАК) или феракрил (ФА) до концентрации 0,7-1,0%. Затем вносят в качестве инактиванта димер этиленимина (ДЭИ) до концентрации 0,1-0,3%. Смесь инкубируют при 35-37°С в течение 20-24 ч. Полученную вакцину используют как в жидком, так и в сухом виде. Для получения сухого препарата жидкую вакцину высушивают сублимацией. Изобретение повышает специфическую безопасность, иммуногенную активность, стабильность и безвредность вакцины, а также снижает ее реактогенность и аллергенность. 7 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики бешенства всех видов сельскохозяйственных и домашних животных.
Бешенство животных относится к заболеваниям, неизбежно приводящим к гибели и, безусловно, является одной из самых страшных болезней, передаваемых человеку от животных. Поэтому борьба с ним представляется не только экономической, но социальной проблемой, успешное решение которой в значительной мере зависит от качества антирабических вакцин, применяемых с профилактической целью. Проблемы с созданием эффективной вакцины против бешенства животных обусловлены прежде всего трудностями, связанными с наработкой качественной биомассы вируса бешенства (ВБ).
Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ, штамм «овечий» ВГНКИ, в мозговой ткани овец, внесение в вируссодержащую суспензию 1 % раствора фенола в качестве инактиванта, инкубацию смеси при 22 o C в течение 48 часов, ее соединение со средой высушивания, расфасовку препарата и его высушивание. Среда высушивания содержит 90 мл дистиллированной воды, 10 г сахарозы и 1,5 г желатины (1).
Недостатки данного способа заключаются в низкой иммуногенной активности полученной вакцины, высокой токсичности фенола и значительном содержании в препарате остаточного вируса, что способствует проявлению поствакцинальных осложнений у привитых животных, особенно у крупного рогатого скота и декоративных пород собак. Кроме того, содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации сахарозы и желатины увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины. Данный способ допускает выпуск нестерильного препарата.
Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных с использованием инактиванта гидроксиламина (2).
Недостаток данного способа состоит в том, что используемый гидроксиламин не инактивирует микрофлору, присутствующую в вирусной суспензии.
Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ, штамм «овечий» ВГНКИ, в мозговой ткани овец, внесение в вируссодержащую суспензию 20-21% раствора этанола в качестве инактиванта, инкубацию смеси при 30-31 o C в течение 12-14 суток, ее соединение со средой высушивания, расфасовку препарата и его высушивание. Среда высушивания включает 22.5 г сахарозы и 3 г желатины на 100 мл дистиллированной воды (3).
Недостатки данного способа заключаются в низкой иммуногенной активности полученного препарата, высокой трудоемкости его изготовления и нестерильности целевого продукта. Кроме того, содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации сахарозы и желатины увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины.
Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ в культуре клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию в качестве инактиванта бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при 4-6 o C в течение 2-4 часов с последующим добавлением гидроокиси алюминия и сапонина в качестве адъювантов (4).
Недостатками данного способа являются нестабильность полученной вакцины, поскольку она выпускается в жидком виде, высокая себестоимость препарата, так как готовится из концентрированного антигена, наличие в вирусной суспензии контаминирующих вирусов и микрофлоры, попавших с сывороткой, клетками ВНК и из окружающей среды, так как использование бета-пропиолактона для инактивации инфекционности ВБ не обеспечивает стерильность вирусной суспензии.
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ в культуре клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию в качестве инактиванта бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при 4-6 o C в течение 2-4 часов, добавление в нее стабилизатора, адьюванта и лиофилизацию целевого продукта. Стабилизатор содержит, мас.%: пептон (7,5-15), сахарозу (7,5-150), желатину (3-6), воду — остальное. В качестве адъюванта используют сапонин (5, 6).
Недостатки способа — прототипа: 1) низкая иммуногенная активность полученной вакцины; 2) использование бета-пропиолактона в режиме инактивации инфекционности ВБ не обеспечивает стерильность вирусной суспензии от контаминирующих агентов, попавших в нее с сывороткой, клетками ВНК и из окружающей среды; 3) содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации пептона, сахарозы, желатины и сапонина увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины.
В задачу создания изобретения входила разработка способа изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, обеспечивающего унифицированное производство специфически безопасной, высокоиммуногенной, стабильной, безвредной, свободной от контаминирующих агентов вакцины как в жидком, так и сухом виде. Применение препарата должно гарантировать эффективную профилактику бешенства у всех видов сельскохозяйственных и домашних животных.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении специфической безопасности, иммуногенной активности, стабильности и безвредности вакцины, а также в снижении ее реакгогенности и аллергенности.
Указанный технический результат достигается созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных; 2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток; 3) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21; 4) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант; 5) в качестве стабилизатора используют полиакриловую кислоту (ПАК) или ее соль; 6) в качестве соли ПАК используют феракрил (ФА);
7) ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
8) в качестве инактиванта вируса используют димер этиленимина (ДЭИ);
9) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
10) смесь вируссодержащей суспензии, ПАК или ФА с ДЭИ инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
11) полученный препарат используют в жидком виде;
12) полученный препарат высушивают сублимацией.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных;
2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток;
3) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант;
4) использование ПАК или ее соли в качестве стабилизатора;
5) использование ДЭИ в качестве инактиванта ВБ.
Предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) в качестве соли ПАК используют феракрил (ФА);
3) стабилизатор ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
4) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
5) смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
6) полученный препарат используют в жидком виде;
7) полученный препарат высушивают сублимацией.
Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения можно объяснить следующим образом.
Повышение специфической безопасности препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет инактивации ВБ и контаминирующих агентов смесью ПАК или ФА с ДЭИ.
Повышение иммуногенной активности препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет присутствия в вакцине смеси ПАК или ФА с ДЭИ.
Повышение стабильности вакцины, полученной предлагаемым способом, достигается за счет иммобилизации органических веществ в вируссодержащей суспензии с помощью ПАК или ФА.
Снижение реактогенности и аллергенности сухого препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет исключения сапонина и среды высушивания, включающей пептон, сахарозу и желатину, а жидкой вакцины — за счет исключения гидроокиси алюминия и сапонина. ПАК и ФА не являются антигенами.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных;
2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток;
3) внесение инактиванта в вируссодержащую суспензию для инактивации полученного вируса;
4) инкубация смеси;
5) внесение стабилизатора.
По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант;
2) использование ПАК или ее соли в качестве стабилизатора;
3) использование ДЭИ в качестве инактиванта ВБ.
Предлагаемый способ характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) в качестве соли ПАК используют ФА;
3) ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
4) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
5) смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
6) полученный препарат используют в жидком виде;
7) полученный препарат высушивают сублимацией.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого способа, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого способа. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемом способе, изложенных в формуле изобретения.
Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности «новизна».
Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности «изобретательский уровень» заявителем проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.
Известно использование ПАК в качестве стимулятора иммунитета (7, 8).
Известно использование ФА (неполная железная соль полиакриловой кислоты) в качестве гемостатика, обезболивающего средства, а также препарата, обладающего бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микробов (9, 10).
Авторами изобретения установлены новые, ранее не известные свойства ПАК и ее соли ФА повышать вирулицидную и бактерицидную активность ДЭИ при их добавлении в вирусную суспензию перед внесением в нее инактиванта и одновременно служить стимуляторами иммуногенности и стабилизаторами вакцины при ее высушивании или хранении в жидком виде. Последовательное внесение ПАК или ФА и ДЭИ в вирусную суспензию позволили получить стерильную суспензию инактивированного ВБ. В этом случае инактивацию микрофлоры обеспечивает в три раза меньшая концентрация ДЭИ. При использовании каждого препарата в отдельности или порядка их внесения в вирусную суспензию не удалось добиться ее стерильности и стабильности.
Авторами установлено также, что при высушивании ПАК или ФА формируют прочную строму, предотвращающую потери препарата в процессе сушки. Сохранность иммуногенности жидкой вакцины проверена в течении 12 месяцев при температуре 4-8 o C с положительным результатом.
Известно также использование ДЭИ для инактивации вируса ящура (II).
Для инактивации ВБ ДЭИ использован авторами впервые. ДЭИ инактивирует ВБ по реакции первого порядка. Однако исследования по инактивации контаминирующей микрофлоры в образцах суспензии ВБ с помощью ДЭИ показали, что при 37 o C в течение 24 часов концентрация ДЭИ вплоть до 0,3% не всегда обеспечивала стерильность специально контаминированной суспензии. Вопрос получения стерильной суспензии ВБ был решен с помощью ПАК или ФА при добавлении их в вирусную суспензию перед внесением в нее ДЭИ. При этом от использования ПАК и ФА получены одинаковые результаты.
Результаты поиска показывают, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого способа), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого способа преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Для изготовления вакцины против бешенства животных используют фиксированный ВБ штамм «Щелково-51», репродуцированный в суспензионной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в среде Игла, содержащей 5-10% сыворотки и 0,25% гемогидролизата. Культивирование вируса ведут в течение 96-144 часов при температуре 35-37 o C, получая вирусную суспензию с титром инфекционности 5,5-6,5 lg ЛД50/мл. Накопление ВБ в среде культивирования и клетках ВНК-21 происходит без признаков цитопатического действия вируса. По окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию вносят сначала в качестве стабилизатора ПАК м.м.
1.000.000 или ФА до концентрации 0,7-1,0%, а затем — в качестве инактиванта ДЭИ до концентрации 0,1-0,3%. Смесь инкубируют при 37 o C в течение 20-24 часов. Полученную вакцину расфасовывают в 10 мл флаконы для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде. В жидком виде вакцина имеет следующее соотношение компонентов, об.%:
ПАК или ФА — 14-20
ДЭИ — 0,5-1,5
вируссодержащая суспензия — остальное.
Для приготовления сухого препарата жидкую вакцину высушивают сублимацией. Готовую вакцину контролируют на физические свойства, стерильность, иммуногенность, безвредность, авирулентность.
Инактивацию инфекционности ВБ изучали по методике определения величины К50 и в динамике снижения титра инфекционности, используя для этого мышат массой 10-12 г.
К50 — это выраженная в % концентрация ДЭИ, снижающая инфекционность ВБ до уровня 1 ЛД50/0,03 мл в течение 24 часов при температуре 37 o C. К50 рассчитывают по формуле Кербера-Ашмарина
K50= lgDm-lgd(
Li-0,5),
где Dm — концентрация ДЭИ в образце суспензии, обеспечивающая авирулентность ВБ;
d — кратность испытанных концентраций ДЭИ;
L — отношение числа живых мышей к числу зараженных по каждому образцу вирусной суспензии;
i — номер образца суспензии.
Результаты опытов приведены в таблице 1.
Из приведенных в таблице 1 данных следует, что авирулентность суспензий обеспечивала концентрация ДЭИ ниже 0,009-0,012%. Расчетная концентрация ДЭИ, равная 0,004%, снижала инфекционность ВБ до одной ЛД50/0,03 мл.
Известно, что олигомеры этиленимина, к которым относится ДЭИ, инактивируют все вирусы по реакции первого порядка. Для проверки этого факта сняли динамику инактивации ВБ, используя 0,2% концентрацию ДЭИ при 37 o C. Проба суспензии, взятая через час инактивации, имела титр инфекционности o C в течение 24 часов концентрация ДЭИ вплоть до 0,3% не всегда обеспечивала стерильность специально контаминированной суспензии. Контроль стерильности проводили по ГОСТ 28085-89. Вопрос получения стерильной суспензии ВБ был решен с помощью ПАК или ФА при добавлении их в вирусную суспензию до оптимальной концентрации 0,7-1,0% перед внесением в нее ДЭИ. В такой последовательности внесения в вирусную суспензию вышеуказанных препаратов инактивацию микрофлоры обеспечивала в три раза меньшая концентрация ДЭИ.
Различия в количестве ДЭИ, обеспечивающем авирулентность суспензии ВБ (0,009-0,012%) и инактивацию микрофлоры в вирусной суспензии (0,2-0,3%) требовали проведения исследований по влиянию высоких концентраций ДЭИ на иммуногенную активность жидкой и сухой вакцины против бешенства.
Установлено, что иммуногенная активность указанных препаратов не снижалась при увеличении концентрации ДЭИ от 0 до 0,5% (пределы исследований). Следовательно, ДЭИ можно использовать в концентрации 50-кратно превышающей минимально необходимую для инактивации инфекционности ВБ, обеспечивая высочайшую степень специфической безопасности вакцины.
ПАК и ФА, кроме повышения активности ДЭИ, являются стимуляторами иммунитета. При этом они проявляют одинаковую активность. При изготовлении сухой вакцины ПАК и ФА формируют прочную строму, предотвращающую потери препарата в процессе его высушивания сублимацией.
Сохраняемость иммуногенной активности жидкой вакцины проверена в течение 12 месяцев при 4-8 o C с положительным результатом.
Результаты контроля иммуногенной активности на мышах жидких и сухих вакцин против бешенства, изготовленных предлагаемым способом, приведены в таблице 2.
Из приведенных в таблице 2 данных следует, что ФА и ПАК, являясь стимуляторами бактерицидности ДЭИ, существенно повышают иммуногенность как жидких, так и сухих вакцин.
Экономическая эффективность от использования предлагаемого способа будет обусловлена следующими факторами:
1) отсутствием в готовом препарате биологических контаминирующих агентов, способных к репродукции в благоприятных условиях;
2) отсутствием дополнительных органических или неорганических примесей в виде пептона, желатины и сахарозы в сухой вакцине или гидроокиси алюминия и сапонина в жидком препарате;
3) унификацией производства жидкой и сухой вакцины.
Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемого способа следующей совокупности условий:
— способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в области ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
— для предлагаемого способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
— способ, воплощающий предлагаемое изобретение при его осуществлении, обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата: повышение специфической безопасности, иммуногенной активности, стабильности и безвредности вакцины, а также снижение ее реактогенности и аллергенности.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».
1. Авт. свид. СССР N 117464, A 61 K 39/205, 21.11.58 г.
2. Вагабов P. M. Разработка и экспериментальное изучение сухой антирабической вакцины, инактивированной гидроксиламином. Канд. дис. М., 1969, 44-60.
3. Авт. свид. СССР N 770196; C 12 N 7/00, A 61 K 39/205; 23.05.79 г.
4. Лихачев Н.В. Вакцины против бешенства. В кн. Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. М., 1963, 28-38.
5. Пат. РФ N 955577, A 61 K 39/205, 03.03.81 г. (прототип).
6. Временная инструкция по изготовлению и контролю сухой инактивированной культуральной антирабической вакцины. Утверждена ГУБ МСХ СССР 16.09.76 г.
7. Петров Р.В., Хаитов P.M. и др. Иммуногенетика и искусственные антигены. М., Медицина, 1983, 255 с.
8. Химическая энциклопедия. М., БРЭ, 1992, 3, 602 (ПАК).
9. Регистр лекарственных средств России. М. Инфармхим, 1993, 876-877 (ФА).
10. Авт. свид. СССР N 698622, A 61 K 33/26, 22.02.74 г. (ФА).
11. Пат. РФ N 594771, A 61 K 39/12, C 12 N 7/04; 07.05.73 г.
12. ГОСТ 28085-89. Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности.
13. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В. и др. Динамика вирусных болезней животных. Справочник. М., Агропромиздат, 1991, 255-270.
14. Иванов B. C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных инактивированных антирабических вакцин. Вирусные болезни с.-х. животных. Владимир, 1995, 203.
15. Иванов B.C., Скичко Н.Д. Разработка и внедрение в промышленное производство и ветеринарную практику России культуральных инактивированных вакцин против бешенства. Курской биофабрике и агробиологической промышленности России — 100 лет. Тез. докл. науч.-прооизвод. конф., 27-30 августа 1996 г., Курск, 1996, 126-128.
16. Пат. Великобритании N 1551437, C 12 N 7/00, 30.08.79 г.
17. Пат. Великобритании N 1596653, A 61 K 39/205, 26.08.81 г.
18. Пат. США N 4347239, A 61 K 39/205, 31.08.82 г.
19. Пат. США N 4584194, A 61 K 39/205, 22.04.86 г.
20. Пат. США N 4649049, A 61 K 39/205, 10.03.87 г.
21. Пат. США N 4664912, A 61 K 39/205, 12.05.87 г.
22. Пат. США N 4726946, A 61 K 39/12, 23.02.88 г.
23. Пат. Румынии N 87856, A 61 K 39/12, 30.11.85 г.
24. Пат. ЧССР N 238794, A 61 K 39/205, 16.12.85 г.
25. Пат. Швейцарии N 658192, A 61 K 39/205, 31.10.86 г.
1. Способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного вируса бешенства в культуре клеток, внесение инактиванта в вируссодержащую суспензию, инкубацию смеси и внесение в нее стабилизатора, отличающийся тем, что по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант, при этом в качестве стабилизатора используют полиакриловую кислоту или ее соль, а в качестве инактиванта — димер этиленимина.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру перевиваемых клеток ВНК-21.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве соли полиакриловой кислоты используют феракрил.
4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что полиакриловую кислоту или феракрил вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что димер этиленимина вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%.
6. Способ по пп.1-5, отличающийся тем, что смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 ч.
7. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что полученный препарат используют в жидком виде.
8. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что полученный препарат высушивают сублимацией.
источник
Первые сообщения об этой болезни имеются в кодексе законов Вавилона, произведениях древних греков, в частности Аристотеля. Даже название Rabies, Lyssa отражают главный клинический признак болезни и переводится как «неистовство», безумная ярость. Врачи древности сумели определить передачу болезни через слюну «взбесившихся» собак.
В I веке до н.э. Корнелий Цельс дал болезни название, сохранившееся до наших дней, — гидрофобия, и предложил в целях лечения проводить каутеризацию (прижигание места укуса раскалённым железом).
В 1804 г. немецкий врач Г. Цинке доказал, что бешенство можно переносить от одного животного к другому путём введения в кровь или под кожу слюны бешенного животного.
Кругельштейн в 1879 г. выявил локализацию вируса бешенства в нервной ткани. Он писал: «Если ядом слюны инфицировать нервной окончание, то оно, насытившись, передаст затем яд вдоль симпатических нервов спинному мозгу, а от него он достигнет головного мозга» [2].
В 1887 году Бабеш обнаружил в протоплазме нейронов головного мозга бешеных животных особые включения. А Негри в 1903 году придал им диагностическое значение, и с 1950 года их стали называть тельцами Бабеша – Негри; они являются конгломератами скоплений вирусной и внутриклеточной материи [1].
Разработка вакцины против бешенства стала триумфом науки и сделала Луи Пастера (Pasteur L., 1822-1895) всемирно известным человеком. Ещё при жизни ему поставили памятник в Париже. Существует легенда, что в детстве будущий ученый увидел человека, укушенного бешеным волком. Маленького мальчика очень потрясла страшная картина прижигания места укуса раскаленным железом [2].
Несколько лет у Пастера ушло на безрезультатные усилия выделить возбудитель. Потерпели неудачу и попытки размножения возбудителя бешенства в условиях in vitro. Перейдя к экспериментам in vivo, Пастеру и его сотрудниками (Э. Ру, Ш. Шамберлан, Л. Пердри) удалось к 1884 году получить «фиксированный вирулентный фактор бешенства». Следующим этапом создания вакцины стал поиск приёмов, ослабляющих возбудитель бешенства. И к 1885 году вакцина против бешенства была создана и успешно предотвращала развитие заболевания у лабораторных животных.
Но когда Пастер все-таки создал вакцину, он долго не решался проверить эффективность антирабической вакцины на людях. Первые испытания антирабической вакцины на человеке произошли неожиданно: 4 июля 1885 года в лабораторию Пастера был доставлен 9-летний Жозеф Мейстер с множественными укусами бешеной собаки. Мальчик был обречён и поэтому учёный решился применить своё изобретение. Более того, после вакцинации Пастер ввёл пациенту ещё более вирулентный вирус, чем вирус бешенства уличных собак. По мнению учёного, такой приём давал возможность проверить иммунитет, вызванный вакцинацией, либо существенно ускорить смертельную агонию (если бешенство бы не удалось предотвратить). Мальчик не заболел [3].
С этого момента слава Пастера пошла по всему миру. В разных странах начали открываться пастеровские станции, где делали прививки от бешенства, сибирской язвы и куриной холеры. Об успешном начале вакцинации людей Пастер доложил на заседании Французской академии наук и Академии медицинских наук 27 октября 1885 года. Председательствующий на заседании физиолог А. Вюльпиан тут же поставил вопрос о немедленной организации сети станций для лечения бешенства с тем, чтобы каждый человек мог воспользоваться открытием Пастера.
Первоначально Пастер был убеждён в необходимости централизовать антирабическую деятельность в едином международном центре. Поэтому в его институт во Франции стали приезжать больные из разных стран мира, в том числе и из России. Первая половина 1886 года стала самой тяжёлой для Пастера, поскольку смертность пациентов, прибывших в Париж из российских губерний, была удручающей и доходила до 82%, несмотря на интенсивный курс вакцинотерапии. Ближайшие соратники и ученики Пастера (Э. Ру, Ш. Шамберлан, Л. Пердри) прекратили своё участие в прививочной деятельности, считая, что вакцина против бешенства ещё недостаточно изучена [3].
Отсутствие у Пастера врачебного образования делало его при малейших неудачах объектом безжалостной критики. Кроме того, вакцина против бешенства Пастера входила в противоречие с общепринятыми в медицине идеями: врачам было непонятно, как вакцина, введённая уже после заражения, могла оказывать эффект.
Большую поддержку (нравственную и научную) Пастеру оказал в этот период молодой русский врач, командированный в Париж Обществом русских врачей, Николай Фёдорович Гамалея. Он добровольно подверг себя интенсивному курсу прививок против бешенства, тем самым подтвердив безопасность вакцины для человека.
Именно наш соотечественник обратил внимание Пастера на то, что все случаи смерти среди вакцинируемых статистически укладываются в срок после 14-го дня с момента укуса. Позднее Гамалея Н.Ф. писал: «Я предположил, что предохранительные прививки могут уничтожить только яд, не дошедший к нервным центрам, и бессильны против того, который уже находится в последних» [3].
Пастер увидел, что нельзя обойтись одним на вес мир пастеровским институтом, поэтому он согласился на открытие пастеровских станций в других странах и прежде всего способствовал учреждению Одесской (открыта в мае 1886 г.)
Как и любое новое биологическое средство, прививки против бешенства не были лишены некоторых недостатков и Пастеру самому пришлось столкнуться с поствакцинальными осложнениями. Пастер первым указал на ведущую роль самого организма человека (а не вакцины) в поствакцинальном осложнении, а также выделил ряд дополнительных неспецифических раздражителей: употребление алкоголя на фоне вакцинации, переутомление, инфекционные заболевания и др.
В 1903 г. сотрудник института Пастера в Париже П. Ремленже установил, что возбудителем бешенства является не бактерия, а фильтрующийся вирус, обладающий свойством облигатного паразита.
Живая Пастеровская вакцина применялась в течение многих лет. Так, например, в СССР — до 1925 г., во Франции — до 1948 г. Сам Пастер не считал живую вакцину совершенной и в 1887 г. в «Письме о бешенстве», адресованном редактору журнала «Анналы Института Пастера», говорил о перспективности разработки инактивированной вакцины [3].
О бешенстве писали поэты. Так, предположительно за 8 или 10 веков до н. э. легендарный греческий поэт Гомер в своей «Иллиаде» устами Тевкра называет Гектора бешеной собакой. В одной из своих поэм выдающийся поэт Востока Низами отмечает: «Счастлив тот, у кого сомкнуты уста, только у бешеной собаки свисает язык».
По Плутарху, бешенство и лепра появились в Италии за 100 лет до христианского летоисчисления.
В XVIII и XIX столетиях, вероятно, благодаря повышению социально-экономического значения повсеместных эпизоотии бешенства наблюдается особый интерес к изучению этой болезни. За рубежом и в России до 1785 г. было опубликовано более 300 сочинений о бешенстве (Д. Самойлович, Н. Я. Озерецковский). Д. Самойлович высказывал твердое убеждение о заразительности бешенства и опровергал мнение о возможности спонтанного возникновения этого заболевания: «В условиях нашего весьма холодного климата сия болезнь отнюдь сама собой не может никогда возродиться».
До последней четверти XIX века человечество оставалось беспомощным как в предупреждении, так и в лечении этого неизбежно смертельного заболевания. Вместе с тем в литературе были сообщения примерно о 400 будто бы излечивающих средствах (Н. Ф. Гамалея). Вряд ли найдутся какие-либо лекарственные и нелекарственные средства, такие, как «русская баня» или погружение в холодную воду, которые не были бы испытаны для этой цели.
К началу XX века в ряде стран Европы (Англия, скандинавские страны, Швейцария) бешенство не регистрировалось, что было результатом успешных профилактических мероприятий. Однако в период двух мировых войн и после них заболеваемость этой инфекцией вновь повсеместно выросла [4].
Библиографический список
Груздев, К. Н. Бешенство животных [Текст]: практическое руководство / К. Н. Груздев, В. В. Недосеков – М.: Аквариум ЛТД, 2001. – 303с.
источник