Молекулярные маркеры ассоциированные с мужским бесплодием

Бесплодие у мужчин в большинстве случаев обуславливается нарушением количественных или качественных показателей эякулята. Азооспермия (отсутствие сперматозоидов в эякуляте), криптозооспермия и олигозооспермия тяжелой степени являются наиболее тяжелыми формами мужского бесплодия. Азооспермия может быть обусловлена как нарушением проходимости семявыносящих протоков, нарушением образования сперматозоидов, так и сочетанием обоих факторов. При этом часто причиной этих изменений являются генетические факторы. Наиболее частые причины – синдром Кляйнфельтера и микроделеции Y-хромосомы.

Процесс сперматогенеза – образования сперматозоидов – сложный многоэтапный процесс, который завершается образованием мужских половых клеток – сперматозоидов. Этот процесс контролируется генами, расположенными в разных хромосомах, в особенности – на Y-хромосоме (напомним, что у мужчины – две разные половые хромосомы – X и Y). Изменения в этих генах могут приводить к самым разным изменениям в показателях эякулята – от снижения подвижности до полного отсутствия половых клеток.

На Y-хромосоме расположена область, названная AZF (Azoospermia Factor, фактор азооспермии). В случае делеции одного из регионов этой области может наблюдаться азооспермия, олигозооспермия, что может являться причиной мужского бесплодия. AZF содержит три региона – AZFa, AZFb, AZFc, каждый из которых состоит из отдельных генов, отвечающих за сперматогенез.

Делеция – потеря участка гена. В случае с регионами AZF делеция может быть полной и частичной. При полной утрачивается весь регион – AZFa, AZFb, AZFc. Чаще всего встречается делеция AZFc. В зависимости от того, какой регион утрачен, развивается различная степень нарушения сперматогенеза. Так, при потере AZFa или AZFb+с практически невозможно получить сперматозоиды для оплодотворения, а при делеции AZFс прогноз более благоприятен. При частичной делеции того или иного региона степень нарушений и прогноз могут быть различны. Делеции локуса AZF наблюдаются с частотой 1 на 1000-1500 мужчин, у 10-12% мужчин с азооспермией, 8-9% мужчин с тяжелой олигозооспермией.

Микроделеции определяются в трех субрегионах — AZFa, AZFb, AZFc. Наличие делеции в гене может обуславливать нарушение сперматогенеза.

Результат обозначается следующим образом:

«-» — отсутствие делеции, или «+» — наличие делеции.

Анализ берется путем соскоба со слизистой оболочки щеки. Таким образом, мы получаем клетки с хромосомами для исследования. Каждый регион исследуется по двум маркерам.

Результат выглядит следующим образом:

Регион	Маркер	Результат
AZFa	sY84*	—
AZFa	sY86	—
AZFb	sY134	—
AZFb	sY127	—
AZFc	sY254	—
AZFc	sY255	—

Заключение: Наиболее частые делеции не обнаружены. Делеции обнаружены (наименование)

«-» означает отсутствие делеции

«del» означает наличие делеции

Показания к обследованию:

Азооспермия
Криптозооспермия
Олигозооспермия

источник

Принимая во внимание, что большое количество предполагаемых генов вовлечено в сперматогенез, можно предположить, что мутации или полиморфизм генов-кандидатов, регулирующих сперматогенез, лежат в основе большинства идиопатических форм нарушения сперматогенеза [6]. Тем не менее, несмотря на интенсивные поиски новых генетических маркеров, никаких клинически значимых мутаций/полиморфизмов генов (кроме тех, что связаны с Y-хромосомой) до сих пор выявлено не было. Вероятно, внедрение новых аналитических методов приведет к существенному продвижению в этой области [6].

Проводятся различного рода исследования, посвященные оценке репродуктивного здоровья мужчин [2, 7]. Литературные данные свидетельствуют о большом интересе, проявляемом к изучению состояния репродуктивного здоровья мужчин.

Бесплодие у мужчин в 40-50% случаев может быть связано с нарушениями количественных и/или качественных показателей эякулята. Примерно в 1/3 случаев причину бесплодия установить не удается; предполагается, что оно обусловлено генетическими или иммунологическими факторами. Сперматогенез представляет собой сложный многоэтапный процесс, завершающийся образованием зрелых мужских половых клеток — сперматозоидов. Мутации генов, контролирующих этапы сперматогенеза, могут приводить к нарушению подвижности, морфологических и фертильных свойств сперматозоидов. Так, микроделеции локуса AZF (Azoospermia Factor) хромосомы Y обнаруживаются в среднем в 10-15% случаев азооспермии и в 5-10% случаев олигозооспермии тяжелой степени и обусловливают нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин [12, 13]. Семейство генов DAZ (Deleted in Azoospermia) представлено несколькими различными генами, локализованными в AZFс-субрегионе. Ghorbel M. с коллегами провел анализ ассоциаций делеций генов DAZ2 и DAZ4 с мужским бесплодием. У мужчин нарушения спермограммы менее выражены при сохранении двух DAZ генов, чем у пациентов, у которых отсутствуют все четыре гена [19].

Среди других генетических причин неэффективности лечения бесплодия нужно отметить присутствие определённых мутаций в генах, которые отвечают за метаболизм разных веществ, в том числе и лекарств. К средовым факторам, снижающим фертильность спермы, включая концентрацию сперматозоидов, относят в первую очередь антропогенное загрязнение окружающей среды, обусловленное химическими и физическими агентами [8]. Мутагены и радиация существенно увеличивают вероятность повреждений ДНК в половых клетках, приводя к их потере, изменению морфологии и подвижности [23].

С 90-х годов прошлого столетия по настоящее время наиболее популярна гипотеза об эндокринных дизрапторах. В основе действия эндокринных дизрапторов лежит их общее свойство специфически соединяться с гормональными рецепторами клеток, которые в итоге отвечают на эти сигналы гормоноподобными эффектами [14]. К числу наиболее распространенных эндокринных дизрапторов относится пестицид дихлордифенилтрихлорэтан и его метаболиты, способные изменять секрецию половых гормонов [35]. Диоксины — широко распространенные, высокотоксичные загрязнители окружающей среды. Они замедляют половое созревание и нередко приводят к женскому и мужскому бесплодию. Низкие дозы бисфенола А, который входит в состав пластмасс, приводят к нарушению сперматогенеза, ускоренному половому созреванию [24]. В последние годы отмечено увеличение частоты различных по генезу гиперандрогенных синдромов [5]. Многие исследователи объясняют это социально-экономическими факторами, играющие важную роль в нарушении нейроэндокринного контроля функции эндокринных желез. Кроме того, известно, что экспрессия большинства генетически обусловленных заболеваний также происходит в результате воздействия различных факторов: экологии, стрессов, высокого инфекционого индекса, необоснованной лекарственной терапии.

Система цитохрома Р-450, называемая также микросомальной системой метаболизма в организме выполняет две важнейшие функции [3, 9]. Во-первых, они играют важную роль в эндогенном метаболизме. Во-вторых, участвуют в первой фазе биотрансформации поступающих извне ксенобиотиков путем образования гидрофильных функциональных групп. Yufeng Qin с коллегами изучали полиморфизм генов CYP1A1, CYP2C19 у мужчин с идиопатическим бесплодием, подвергшихся влиянию таких эндокринных дизрапторов, как октилфенол и трихлорфенол. Другое исследование посвящено изучению ассоциации полиморфизмов цитохрома Р450 1А1 (3801T> С) с идиопатическим мужским бесплодием и роли статуса курения. Было выяснено, что у гетерозигот риск бесплодия выше, но только в группе курящих мужчин [40]. Изучению полиморфных вариантов гена P4501A1 у мужчин с идиопатическим бесплодием посвящены и другие исследования [20].

Широка и многообразна активность ферментов семейства глутатион-S-трансфераз, метаболизирующих тысячи ксенобиотиков [3, 9]. Глутатионопосредованной детоксикации принадлежит важная роль в обеспечении резистентности клеток к перекисному окислению липидов, свободным радикалам. Проводятся работы по исследованию и анализу взаимосвязи между мужским бесплодием и различными полиморфными вариантами генов глутатион-S-трансфераз (GST) [26, 34]. Так, данные анализа исследования зарубежных коллег показали увеличение риска бесплодия у пациентов с нулевым генотипом GSTM1 или GSTT1, а комбинация этих делеций представляет еще более высокий риск бесплодия [29, 30].

N-ацетилтрансферазы 2 участвуют во второй фазе метаболизма ксенобиотиков — детоксикации посредством ацетилирования. Субстратами для Nat2 являются ароматические амины и гидрозины, к которым относятся многие канцерогены, а также некоторые лекарственные препараты. Однако, проведенные исследования не выявили никакой связи между полиморфизмом гена Nat2 (481C> T, rs1799929; 590г>, rs1799930) и идиопатическим мужским бесплодием [39].

Каталаза (CAT) — вездесущий энзим, который разрушает токсичный пероксид водорода, образующийся в ходе различных окислительных процессов в организме. Выявлено, что у мужчин с идиопатическим бесплодием протективную значимость имеет генотип TT гена CAT(C-262T) [33].

Наличие на Х-хромосоме генов, ответственных за сперматогенез, вызывает немало споров. Ген USP26, обнаруженный на X-хромосоме, оказывает влияние на функции гематотестикулярного барьера и развитие клеток Сертоли. Позже был проведен функциональный анализ этого гена и доказана его роль в активации рецепторов андрогена при мужском бесплодии [4]. В других работах также было показано, что мутации гена убиквитинспецифичной протеазы 26 могут служить причиной мужской инфертильности [15, 32].

Ayalon I. выявил некоторые ассоциации полиморфных вариантов гена AR с клиническими параметрами различных медицинских состояниях, характеризующихся гипоандрогенией. Ген AR кодирует белок — андрогеновый рецептор (АР). В гене AR присутствуют повторы из трех нуклеотидов CAG, количество которых может значительно варьировать (от 8 до 25). Одной из причин мужского бесплодия является нарушение гормональной регуляции сперматогенеза, ключевую роль в котором играют мужские половые гормоны андрогены. Взаимодействуя со специфическими андрогеновыми рецепторами, они определяют развитие мужских половых признаков, активируют и поддерживают сперматогенез. В ряде исследований было показано, что меньшему числу CAG-повторов соответствует меньшая степень конформационных изменений рецептора, связь в комплексе гормон-рецептор становится прочнее, что приводит к повышению транскрипционной активности АР. С увеличением количества CAG-повторов связь в комплексе гормон-рецептор становится хуже и транскрипционная активность AР падает, они становятся менее чувствительными к тестостерону, возрастает риск развития олигозооспермии. Снижение концентрации андрогенов также вызывает тяжелые нарушения продукции спермы [27]. У пациентов с длинными полиглутаминовыми аллелями (> 32 CAG-повторов) наблюдается тенденция к более тяжелым дефектам сперматогенеза.

Фесай О.А. и коллеги выявили, что частота аллелей с короткими CAG-повторами (менее 18) была статистически достоверно выше в группе пациентов с азооспермией, а частота аллелей с длинными CAG-повторами (более 28) была статистически достоверно выше в группе пациентов с олигозооспермией. Что позволяет предполагать наличие ассоциации между количеством CAG-повторов и нарушением сперматогенеза у мужчин. В другой работе также было показано, что с увеличением длины CAG-повторов транскрипционная активность гена AR падает [36]. Giagulli V.A. с коллегами также проводил анализ CAG полиморфизма гена андрогенового рецептора у мужчин с идиопатическим бесплодием. Нарушения андрогенового рецептора следует рассматривать в качестве маркера предрасположенности к мужскому бесплодию в совокупности с другими генетическими факторами.

Актуальной проблемой является изучение вклада генов репарации ДНК в формирование индивидуальной чувствительности генома к повреждающему воздействию факторов окружающей среды. Фермент PARP-1 участвует в ремоделировании хроматина за счет поли-АДФ-рибозилирования гистонов. Результаты исследования показали, что генотип PARP1*CC (rs1136410) чаще встречается у инфертильных мужчин с олигоспермией [18].

Многочисленные работы посвящены изучению ассоциаций полиморфных вариантов генов фолатного цикла с мужским бесплодием [25, 28, 31, 37, 38]. Фолиевая кислота участвует в синтезе ДНК, ее метилировании. Исследована связь между нарушением мейоза в ходе сперматогенеза и особенностями полиморфизмов генов фолатного обмена MTHFR (C677T, A1298C), MTRR (A66G) у мужчин со сниженной репродуктивной функцией. Доказана связь между генетически обусловленным нарушением процессов фолатного обмена и наличием численных хромосомных нарушений в мужских половых клетках [11].

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует об актуальности и целесообразности проведения медико-генетических исследований при мужском бесплодии [2, 7]. Литературные данные позволяют повысить информативность причин нарушения фертильности у мужчин, а также сократить группу так называемого идиопатического бесплодия у мужчин. Открытие новых ассоциаций полиморфных вариантов генов с мужской инфертильностью имеет два немаловажных аспекта. Во-первых, большинство исследований недостаточны в связи с недостаточностью объема выборки и этнической и фенотипической гетерогенностью. Во-вторых, исследование полиморфизма одного гена в контексте мужского бесплодия неэффективно. Значительные достижения в области молекулярно-генетических технологий открывают новые перспективные направления. Очевидно, эти исследования прольют дополнительный свет на генетическую архитектуру мужского бесплодия [16].

Викторова Т.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, г. Уфа;

Корытина Г.Ф., д.б.н., старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики человека ФГБУН ИБГ УНЦ РАН, г. Уфа.

источник

В настоящее время бесплодием страдают около 10-15% супружеских пар, при этом примерно в 50% случаев оно обусловлено нарушением репродуктивной функции со стороны мужчины, в 20% — нарушением репродуктивной функции обоих супругов [1,2]. Кроме того, бесплодие у мужчин в 40-50% случаев может быть связано с нарушениями количественных и/или качественных показателей эякулята [3,4]. Примерно у 31,7% мужчин причину бесплодия установить не удается (идиопатическое бесплодие) [5] и предполагается, что оно обусловлено генетическими или иммунологическими факторами.

Мутации генов, контролирующих этапы сперматогенеза, могут приводить к нарушению подвижности, морфологических и фертильных свойств сперматозоидов, блоку сперматогенеза, проявляясь в диапазоне от легкого снижения сперматогенной активности до полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах (синдром «только клетки Сертоли»). Так, микроделеции локуса AZF (Azoospermia Factor, фактор азооспермии) [6,7] хромосомы Y обнаруживаются в среднем в 10-15% случаев азооспермии и в 5-10% случаев олигозооспермии тяжелой степени [8,9], и обусловливают нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин. На коротком плече У-хромосомы расположены: детерминирующий пол человека ген SRY (sex- determining region Y) и ген ZFY(zink finger protein Y) отвечает за формирование пола и оказывает частичное влияние на дифференцировку гонад, два гена позволяющие определить соответствие фенотипического пола генотипическому, а так же множество генов экспрессирующихся при сперматогенезе, такие как AZF регионы длинного плеча У-хромосомы [10,11].

В У хромосоме выделены три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc. Гены — кандидаты AZFa-субрегиона представлены на У хромосоме единственной копией, поэтому, даже точковые мутации могут вызывать нарушения сперматогенеза и приводить к бесплодию мужчин. Тогда как гены, субрегионов AZFb и AZFc содержат по три десятка генов, многие из которых представлены в двух и более копиях [12,13]. Наиболее частым типом полных AZF делеций являются AZFc делеций, доля которых составляет 65-70% от всех полных AZF делеций. Второе место по частоте встречаемости 15-20% занимают делеции, захватывающие регионы AZFс и\или AZFb (AZFb+с). Наиболее редко 5-10% выявляют делеции AZFa региона. В редких случаях обнаруживают другие типы AZF делеций, например, AZF a+b и AZF a+b+c. В большинстве случаев микроделеции являются мутациями de novo, но имеются сведения об единичных случаях наследования после экстракорпорального оплодотворения [14,15]

Целью исследования:кариологическое исследование лимфоцитов периферической крови и изучение AZF региона У хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза.

Материалы и методы. Материалом исследования явилась периферическая кровь мужчин обратившихся в медико-генетическое консультирование с диагнозом мужское бесплодие, патозооспермия. Всем 104 пациентам по показаниям проводили цитогенетическое и молекулярно-генетические исследования.

Для проведения цитогенетических исследований использовали гепаринизированную, венозную кровь пациентов. Препараты хромосом получали из лимфоцитов периферической крови по стандартной методике: 1,5 мл сыворотки крупного рогатого скота, 6 мл –RPMI 1640 + стерильный L-глутамин, 0,15 мл фитогемагглютинина, 0,5 мл периферической крови, стерильный раствор 10 γ колхицина, гипотонический раствор 2,79% KCL, охлажденный раствор фиксатора -этаноловый спирт\100% ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1, 3% ледяная уксусная кислота. Препараты окрашивали GTG-методом. Результаты цитогенетического исследования приведены согласно Международной системе номенклатуры цитогенетики человека[16].

Для проведения молекулярно-генетических исследований из периферической крови была выделена геномная ДНК (набором «Promega», USA). Мультиплексную полимеразную цепную реакцию (мПЦР) проводили на программируемом термоциклере ТП4-ПЦР-01 (ДНК-технология), с использованием Taq-полимеразы. Состав ПЦР смеси: ПЦР буфер-5,0 мкл, dNTPs-12,5мкл, праймеры-1,0 мкл, Taq-полимераза-0,2 мкл, H2O-14,3 мкл, ДНК-2,0 мкл, контрольная ДНК-2,0 мкл. Общее количество смеси -25 мкл. Программа ПЦР проводилась в следующем режиме: 95°- 5 мин; 94°- 45 сек, 65°- 45 сек,72°- 45 сек — 30 циклов; 72°-7 мин.

Результаты амплификации оценивали методом электрофореза в 7 % полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия. Набор праймеров использованных на данном этапе, позволял исследовать 9 STS-маркеров, специфичных для AZF-локусов:

1) для субрегиона AZFa: sY86; sY84; sY615; 2) для субрегиона AZFb: sY127, sY134; 3) для субрегиона AZFc : sY254 , sY255; 4) SRY;5) ZFY.

Результаты и обсуждение. Анализ спермограммы показал, что наиболее часто в 59 % случае были диагностированы азооспермии, астенотератозооспермия и тератоспермии, олигоастенозоосперия — в 10 %, и олигозооспермии — в 5 % случаев.

Как видно из данных таблицы 1 при цитогенетическом исследовании лимфоцитов периферической крови нормальный кариотип — 46,ХУ был диагностирован у 85% (89) пациентов. Хромосомная патология была выявлена в 15% случаев (15) пациентов. Анализ хромосомной патологии показал, что среди аберраций превалируют числовые хромосомные нарушения, так в 14 случаях диагностирован синдром Клайнфельтера (47,ХХУ) и в одном случае структурные хромосомные аберрации — робертсоновская транслокация — 45, ХУ, der (14;15)(q10;q10). Следует отметить, у пациентов с хромосомными аномалиями изменения в 80 % (12) измененных спермограмм составили азооспермия, у 20 % пациентов (3) — астенотератозооспермия и олигозооспермия.

Молекулярно-генетические исследования микроделеции У хромосомы были проведены 50 (48%) мужчинам с патозооспермией и имеющих нормальный кариотип– 46,ХУ. Микроделеции У- хромосомы обнаружены у 7 пациентов, что составило 14%. Были выявлены делеции AZF локусов: AZF a- 14%, AZF b- 14%, AZF а+b- 14%, AZF с-44%. В одном случае обнаружена делеция ZFY гена, которая не ассоциирована с нарушением сперматогенеза, используется в качестве маркера короткого плеча У хромосомы.

По результатам наших исследований видно, что у мужчин с показаниями «азооспермия и тяжелая олигозооспермия» наиболее часто встречалась микроделеция AZF с- субрегиона в 44%, и с одинаковой частотой равной 14% встречались микроделеций AZF a, AZF b, AZF а+b .

Цитогенетические и молекулярно-генетические показатели у мужчин с нарушением сперматогенеза

Так, по данным литературы, для пациентов при обнаружении делеции локуса AZFс в У хромосоме у 71% пациентов могут быть извлечены зрелые сперматозоиды, c помощью ИКСИ в сочетании с извлечением тестикулярных сперматозоидов, в то время как у пациентов с мутацией в локусах AZFa, AZFb прогноз оплодотворения яйцеклетки неблагоприятный [15].

Таким образом, учитывая высокую частоту хромосомной патологии у пациентов с бесплодием неясного генеза, которым рекомендовано экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) или ИКСИ , необходимо проводить комплексное обследование, с обязательным цитогенетическим исследованием лимфоцитов периферической крови и молекулярно-генетический скрининг локусов AZF У хромосомы.

источник

Комплексное исследование, которое позволяет определить ведущие генетические причины мужского бесплодия и выбрать соответствующую тактику ведения пациента.

В исследование включены самые частые генетические причины мужского бесплодия: выявление делеций в области локуса AZF, влияющих на сперматогенез, определение количества CAG-повторов в гене AR, связанных с изменением чувствительности к андрогенам и поиск мутаций в гене CFTR, отвечающего за развитие заболевания муковисцидоз, клиническим проявлением которого является обструктивная азооспермия.

БиоЧип, Автоматическое секвенирование ДНК, полимеразная цепная реакция.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Буккальный (щечный) эпителий, венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Мужское бесплодие (МБ) – это серьезное патологическое состояние, требующее комплексной всесторонней диагностики, неотложной коррекции, а в некоторых случаях и профилактики.

Бесплодием страдает 15-20 % пар репродуктивного возраста. В половине случаев оно связано с «мужским фактором», проявляющимся отклонениями в параметрах эякулята.

Сложность диагностики МБ заключается в большом количестве причин, его вызывающих. К ним относятся аномалии мочеполовой системы, опухоли, инфекции мочеполового тракта, эндокринные нарушения, иммунологические факторы, генетические мутации и др. В отличие от вышеперечисленных причин, генетические не всегда имеют клинические проявления, однако крайне важны для диагностики МБ у обследуемого.

Важно понимать, что диагноз «МБ» и его форм может поставить только врач-специалист на основании анамнестических данных, данных осмотра, результатов инструментальных и лабораторных исследований. Поводом обращения к врачу могут быть следующие причины:

невозможность зачатия ребенка в течение года при условии отсутствия признаков женского бесплодия у партнерши;
нарушения эректильной и эякуляторной функций;
сопутствующие заболевания урогенитальной сферы (воспалительные, опухолевые, аутоиммунные, врождённые и др.);
прием гормональных и цитостатических препаратов;
дискомфорт в урогенитальной области.

Частыми причинами мужского бесплодия являются нарушения структуры и количества сперматозоидов, влияющие на их подвижность и способность к оплодотворению.

Основными генетическими причинами развития МБ являются:

1) делеции (удаления генетических фрагментов) локуса AZF;

2) полиморфизм (увеличение повторов генетического фрагмента – CAG) гена AR;

3) мутации (нарушение последовательности) гена CFTR.

В настоящее время эти маркеры являются неотъемлемой частью стандартных критериев при комплексной диагностике генетических проявлений МБ, встречаясь в группе пациентов в 10-15 % случаев.

Делеции локуса AZF и гена SRY

Важную роль в развитии таких патологий, как олигозооспермия и азооспермия, играют отклонения в специфическом участке Y-хромосомы – AZF-локусе (фактор азооспермии). Входящие в него гены определяют нормальное протекание сперматогенеза, и при нарушении генетической структуры AZF-локуса образование мужских половых клеток может серьезно нарушиться.

AZF-локус находится в длинном плече Y-хромосомы (q11). Гены, расположенные в этом локусе, играют важную роль в процессе сперматогенеза.

Микроделеция Y-хромосомы – это выпадение определенных участков, обнаруживается в среднем в 10-15 % случаев азооспермии и в 5-10 % случаев олигозооспермии тяжелой степени и обусловливают нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин.

Локус AZF разделен на 3 участка: AZFa, AZFb и AZFc. В каждом из них идентифицированы гены, участвующие в контроле сперматогенеза. Делеции в локусе AZF могут быть полными, т.е. целиком удаляющими один из AZF-регионов или более, и частичными, когда они не полностью захватывают какой-либо из трех его регионов.

При полных AZF-делециях прослеживается довольно четкая зависимость степени нарушения сперматогенеза от размера и локализации делеций, что может иметь прогностическое значение в получении сперматозоидов, пригодных для программ экстракорпорального оплодотворения.

Отсутствие всего локуса AZF, а также делеции, целиком захватывающие регионы AZFa и/или AZFb, указывают на невозможность получения сперматозоидов.
Практически у всех пациентов с делециями AZFb или AZFb+c отмечают азооспермию вследствие тяжелых нарушений сперматогенеза (синдрома «только клетки Сертоли»).
При полных делециях региона AZFc проявления варьируются от азооспермии до олигозооспермии. В среднем у 50-70 % пациентов с делецией, целиком захватывающей AZFс-регион, удается получить сперматозоиды, пригодные для искусственного оплодотворения.
При частичных AZFс-делециях проявления варьируются от азооспермии до нормозооспермии.

Исследование состояния AZF-локуса Y-хромосомы у пациентов с азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени позволяет установить генетическую причину нарушений сперматогенеза, провести дифференциальную диагностику бесплодия у мужчин и скорректировать лечение, проверить возможность получения сперматозоидов при тестикулярной биопсии и возможность получения сперматозоидов для ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида).

Следует учитывать, что в случае успешного использования вспомогательных репродуктивных технологий делеция Y-хромосомы передается по мужской линии. Это показывает необходимость диспансерного наблюдения за мальчиками, рождёнными после применения ИКСИ у отцов с микроделециями в Y-хромосоме, для оценки их фертильного статуса.

Показания для скрининга AZF-делеций основываются на количестве сперматозоидов и включают в себя азооспермию и тяжелую олигозооспермию ( T, N1303K, 2143delT, 2184insA, G542X, 1677delTA, R334W, 3821delT, G85E, 2789+5G>A, S1196X, 2183AA-G, I507del, 621+1G>T, R347P, R553X, 1078delT, R347H, 1717-1G>A, G551D, R1162X, 3732delA.

Генетический анализ позволяет выявлять до 95 % всех возможных больных, что существенно превышает разрешающие способности утвержденного в России скрининга.

Совокупность результатов, которые могут быть получены при проведении генетического тестирования на наличие у мужчины делеций AZF, определения числа CAG-повторов гена AR и мутаций гена CFTR, позволяет выявить проблемы по мужской линии при планировании беременности, принять решение по тактике ведения пациента и при необходимости выбрать оптимальную схему вспомогательных репродуктивных технологий.

Когда назначается исследование?

При диагностике причин бесплодия у мужчин;
комплексное обследование бесплодной пары;
при нарушении сперматогенеза неясной этиологии;
при определении терапевтического подхода к получению сперматозоидов для ЭКО (и прогнозировании его возможности);
в случаях нарушения репродуктивной функции по мужской линии в семейном анамнезе;
если у мужчины выявлены структурные аномалии семявыносящего протока (двустороннее отсутствие семявыносящего протока, одностороннее отсутствие семявыносящего протока).

Анализ локуса AZF

Делеции не выявлены – данное состояние не ассоциировано с развитием мужского бесплодия.
Выявлена делеция (делеции) – данное состояние может являться причиной развития клинических проявлений мужского бесплодия и, в зависимости от типа делеции, нарушений сперматогенеза разной степени выраженности.
Делеция AZFa – негативный прогноз в отношении получения сперматозоидов с помощью биопсии яичка.
Делеция AZFb – негативный прогноз в отношении получения сперматозоидов с помощью биопсии яичка.
Делеция AZFc – высокая вероятность получения сперматозоидов, пригодных для искусственного оплодотворения.
Делеция SRY – нарушение дифференцировки гонад по мужскому типу, женский фенотип.

Количество повторов гена AR. Верхней границей нормы для определения риска генетической предрасположенности к гормонозависимому нарушению сперматогенеза является 23 CAG-повтора. По некоторым источникам, диапазон 20-26 повторов считается относительной нормой.

Анализ гена CFTR

N (норма) / N (норма) – мутации не обнаружены.

N (норма) / M (мутации) – выявлена мутация в гетерозиготном состоянии.

M (мутация) / M (мутация) – выявлена мутация в гомозиготном состоянии, подтверждение диагноза «муковисцидоз».

По итогам комплексного исследования выдается заключение с интерпретацией результатов.

[08-038] Простатспецифический антиген общий (ПСА общий)

На протяжении жизни данные генетические маркеры не изменяются, исследование проводится однократно.

Naina Kumar and Amit Kant Singh Trends of male factor infertility, an important cause of infertility: A review of literature J Hum Reprod Sci. 2015 Oct-Dec; 8(4): 191–196.

источник

1 Комплексная лабораторная диагностика мужского бесплодия Персонифицированный подход. Практические рекомендации. Струкова Лидия Александровна, специалист по продукции НПФ Литех (www. bio.fizteh.ru)

2 Мужское бесплодие Бесплодием страдают 15-20% пар репродуктивного возраста Примерно в половине случаев бесплоден мужчина Мужское бесплодие мультифакторный синдром, включающий разнообразные расстройства Зачастую причина бесплодия неясна (идиопатическое бесплодие) Бесплодие может быть врожденным или приобретенным ( www. bio.fizteh.ru

3 Сперматогенез Зрелый сперматозоид ( По

4 Азооспермия и олигозооспермия Классификация по количеству Число сперматозоидов сперматозоидов [млн/мл] Азооспермия 0 Олигозооспермия тяжелой степени 20 В каждой категории морфология и/или подвижность сперматозоидов могут быть нормальными или ненормальными (астенотератозооспермия).(christine M Disteche, 2007) Азооспермия отсутствие сперматозоидов в эякуляте Олигозооспермия снижение концентрации сперматозоидов до 1 млн/мл. Чем меньше концентрация сперматозоидов, тем тяжелее олигозооспермия Синдром клеток Сертоли полное отсутствие в семенных канальцах предшественников сперматозоидов ( наличие только клеток Сертоли)

5 Этиология мужского бесплодия Этиология % Идиопатическое бесплодие 75,1 Варикоцеле 12,3 Урогенитальные инфекции 6,6 Иммунологические факторы 3,1 Врождѐнные аномалии 2,1 Эндокринные нарушения 0,6 Gu >

6 Генетические причины мужского бесплодия Частота цитогенетических нарушений составляет от 2,1 до 28,4 % у бесплодных мужчин и 0,7-1 % в общей численности мужчин (Balkan et. al., 2008) После синдрома Клайнтфельтера микроделеции Y-хромосомы являются наиболее распространенным генетическим нарушением ( По Emre Seli and Denny Sakkas, 2005)

7 Строение Y- хромосомы Короткое плечо — Центромера Длинное плечо- PAR псевдоаутосомные области AZF AZoospermia Factor, участок, ассоциированный с азооспермией SRY (Sex-determining Region Y) ген, определяющий дифференцировку гонад по мужскому типу ZFY ген цинковых пальцев ( По Emre Seli and Denny Sakkas, 2005)

8 Причина возникновения микроделеций Микроделеции возникают в результате сложных перестроек Y-хромосомы и при обмене участками между половыми хромосомами в процессе мейоза

9 Типы AZF-делеций AZF-делеции Полные (классические) AZF-делеции, удаляющие 1, 2 или все 3 AZF- субрегиона, могут быть результатом как макро-, так и микроделеций Y- хромосомы Частичные Микроделеции Y-хромосомы, неполностью удаляющие какойлибо AZF-регион; наиболее часто встречаются в AZFc-локусе a a b a,b,c b c b,c c c Норма AZFa,b,c AZFa AZFb AZFb,c AZFc AZFc частичная

10 Частота встречаемости AZF-микроделеций в Европе Частота встречаемости AZF-делеций у пациентов с необструктивной азооспермией и тяжелой олигозооспермией Год Автор Страна Число пациентов Частота обнаружения AZF-делеций Средняя частота 2000 (Osterland et.al.) Швеция 192 2,1 % В среднем по 2001 (Friel et.al.) Ирландия 78 3,6 % Европе 2002 (Ioulianos et. al.) Греция-Крит 80 5,0 % 5,37% 2004 (Giannouli et.al.) Греция 63 3,0 % (от 2,1 до 10,7%) 2004 (Vicdan et. al.) Турция 208 9,1 % 2006 (Plaseski et.al.) Македония 218 4,1 % 2007 (Исламова А.А.) Россия ,7 % AZF-делеции обнаруживают в среднем у % мужчин с азооспермией и у 8-9 % мужчин с олигозооспермией тяжелой степени (Черных В.Б., 2009)

11 Частота встречаемости различных микроделеций AZF-локуса Делеции AZFc 60% Делеции AZFb 16% Делеции AZFа 5% Делеции двух и более субрегионов 14% Делеции длинного плеча Y-хромосомы вне AZF-локуса 5% Обобщенные литературные данные по структуре делеционных нарушений локуса AZF среди мужчин с бесплодием (по Черных В.Б. и др., 2003) Наиболее часто встречаются микроделеции локуса AZFc!

12 Основные закономерности в обнаружении AZF-делеций Микроделеции обнаружены почти исключительно у мужчин с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени В основном, более крупные делеции ассоциированы с более тяжелыми нарушениями сперматогенеза AZFa-делеции наиболее редкие (1-5%) и чаще ассоциированы с синдромом клеток Сертоли Делеции AZFс и AZFb,c наиболее частые и ассоциированы с различными нарушениями сперматогенеза (от умеренной степени снижения сперматогенной активности, задержки сперматогенеза до синдрома клеток Сертоли) ( По Krausz C. et. al., 1999)

13 Комплексное клинико-генетическое обследование пациентов с нарушениями сперматогенеза Спермиологический анализ (рн, вязкость, объем эякулята, количество сперматозоидов в 1 мл, их морфология и подвижность) Количественный кариологический анализ (ККА) незрелых половых клеток Цитогенетический анализ (окрашивание по методу Гимзы) Микроделеционный анализ локусов AZF Сперматоциты I порядка Гистологическое исследование биоптата яичка Сперматогонии AZFb,c-делеция, задержка сперматогенеза на уровне сперматоцитов ( По Leah Yogev et. al., 2004)

14 Вспомогательные репродуктивные технологии ЭКО экстракорпоральное оплодотворение (in vitro) ИКСИ (ICSI, Intra Cytoplasmic Sperm Injection) инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита) Процедура ИКСИ Полярное тело яйцеклетки Фиксирующая пипетка Микроигла со сперматозоидом (

15 Показания к микроделеционному анализу локусов AZF ТЕSA — тестикулярная аспирация TESE- тестикулярная экстракция, т.е биопсия ТЕSA TESE Анализ микроделеций AZF-региона настоятельно рекомендован пациентам с необструктивной азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени для постановки диагноза Анализ субрегионов AZF-локуса на наличие микроделеций особенно важен при обследовании пациентов перед ИКСИ (Руководство по медико-генетическому обследованию супружеских пар с нарушением репродукции Foresta et al. Europ J Hum Genet v )

16 Микроделеционный анализ AZF-субрегионов Yp Yq AZF-cубрегионы Р1-Р3 STS- локусы Sequence Tag Sites Праймеры Делеция определенного STS-локуса = делеция определенного AZF-субрегиона ( По Navarro-Costa et.al., 2010)

17 Европейский контроль качества анализа микроделеций AZF-локуса Европейской Академией Андрологии совместно с The European Molecular Genetics Quality Network Внешний контроль качества проведения анализа: — Присутствие положительного контроля (ДНК здорового мужчины) (контроль специфичности) — Присутствие отрицательного контроля (ДНК женщины) (контроль контаминации мужской ДНК) — Проба, в которой вместо ДНК-матрицы добавлена вода (контроль контаминации реагентов) Н 2 О (M. Simoni et.al., 2004)

18 Европейский контроль качества анализа микроделеций AZF-локуса С целью повышения эффективности диагностики анализ проводят по двум STS-локусам одного субрегиона В качестве набора STS принято анализировать для AZFa: sy84, sy86 для AZFb: sy127, sy134 для AZFc: sy254, sy255 (оба в DAZ-гене) Внутренний контроль реакции: ZFY общий фрагмент генов-гомологов ZFX/ZFY, встречается и у женщин, и у мужчин (соотв.) SRY — ген, запускающий дифференцировку гонад по мужскому типу (только в Y-хромосоме) (по M. Simoni et.al., 2004)

19 Комплект реагентов для выявления частых микроделеций локуса AZF Y-хромосомы методом ПЦР

20 Комплект реагентов «AZF-делеции» 1) Реагент для выделения ДНК из крови ДНК-экспресс-кровь Метод выделения ДНК основан на принципе термокоагуляции и не требует сложных манипуляций 2) Реагенты для проведения амплификации (ПЦР): 10 х реакционная смесь А 10 х реакционная смесь В Taq-полимераза Разбавитель Контрольная ДНК (норма) Минеральное масло

21 Набор реагентов НПФ «Литех» для выявления AZF-делеций Y-хромосомы ПЦР-набор содержит 2 реакционные смеси с праймерами на 2 группы STS-маркеров A sy86 AZFa sy84 B sy127 AZFb sy134 sy254 AZFc sy255 Анализ по двум локусам повышает надежность диагностики Наборы снабжены необходимыми внутренними (SRY, ZFX/Y) и внешними контролями (нормальная мужская и женская ДНК) Маркеры соответствуют рекомендациям Европейской Академии Андрологии для лабораторной диагностики

22 Анализ микроделеций AZF-локуса 1. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови реагентом «ДНК-экспресс-кровь» 3000 об/мин, 5 мин -20 С, 1 ч 15 мин, 98 С об/мин, 15 секунд 1 мл крови Удаление плазмы Добавление равного объема реактива «ДНК-экспресс -кровь» Отбор супернатанта 2. Постановка ПЦР с использованием комплекта реагентов «AZF-делеции» 5 мкл супернатанта 5 мкл супернатанта Система А Taq-полимераза Разбавитель 10 х реакционная смесь А Система В Taq-полимераза Разбавитель 10 х реакционная смесь В

23 Электрофоретическая детекция продуктов амплификации Система А СИСТЕМА А Название локуса Длина фрагмента, п.н. ZFY/X 507 sy254 (AZF C ) 391 sy86 (AZF A ) 293 sy127 (AZF B ) 190 СИСТЕМА В Название локуса Длина фрагмента, п.н. SRY 479 sy134 (AZF B ) 318 sy84 (AZF A ) 205 sy255 (AZF C ) 129 Система В 1- маркер молекулярного веса 2- положительный контроль (ДНК здорового мужчины) 3- клинический образец без делеций 4- образец ДНК с делециями AZFb,c 5- образец ДНК с делецией AZFc 6- образец ДНК женщины 7- отрицательный контрольный образец (вода)

24 Прогнозы Микроделеции, охватывающие весь регион AZF либо субрегионы AZFa, AZFb, и AZFb,c приводят к полному отсутствию здоровых сперматозоидов В среднем у 50% пациентов с делецией, целиком захватывающей AZFсрегион, удается получить сперматозоиды, пригодные для искусственного оплодотворения Так как у пациентов с AZF-микроделециями часто отмечается прогрессирование нарушений сперматогенеза от олигозооспермии до азооспермии, таким пациентам необходима криоконсервация полученных сперматозоидов Мальчикам, рожденным от пациентов с микроделециями, со временем может понадобиться микроделеционный анализ При рождении девочки никаких угроз нет, так как Y-хромосома отсутствует ( По Черных В.Б.и др., 2009, Krausz C. Et. al., 1999)

25 Обструктивная азооспермия ОБСТРУКТИВНАЯ АЗООСПЕРМИЯ (ОА) характеризуется отсутствием сперматозоидов в эякуляте из-за непроходимости семявыносящих путей В США среди пациентов с азооспермией на долю ОА приходится 2/3 cлучаев.у 9,6% пациентов с ОА находят врожденное двустороннее отсутствие семявыносящих протоков (ВДОСП) В более 80% случаев ВДОСП выявляют мутации CFTR (Ген трансмембранного белка- регулятора проводимости ионов) Определенные мутации гена CFTR приводят к развитию муковисцидоза (МВ) — широко распространенного наследственного заболевания с поражением клеток экзокринных желез. При МВ прогрессируют бронхолегочные нарушения, отмечается недостаточность функций кишечника и поджелудочной железы Легкие Печень Поджелудочная железа Тонкий кишечник Кожа Репродуктивная система

26 Сystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator H2O Ген трансмембранного белкарегулятора проводимости ионов Белок CFTR является мембранным каналом для транспорта ионов хлора Na+ При мутации вырабатывается чрезмерно вязкий секрет Известно более 1500 мутаций CFTR. Спектр мажорных мутаций в популяциях различен. Жесткие и мягкие мутации CFTR участвует в формировании семявыносящего протока, семенных пузырьков, семенных канальцев и частично придатка яичек Пациентам с азооспермией, объемом эякулята менее 1,5 мл и рн 27 Распределение мутаций СFTR у пациентов с ВДОСП ВДОСП МВ Мутация Частота, % хр del F508 52,6 R117H 11,6 W1282X 8 R347H 66 Невозможно тестировать все известные мутации CFTR. Рекомендуется анализировать мутации, частые в популяции. (M.De Braekeleer, С. Ferec. Mol Hum Reproduct 1996 v2, 9, )

28 Важность генетического консультирования Наборы ПЦР — реагентов «SNP-экспресс» Наименование Ген Полиморфизм Муковисцидоз -1 (МВ-1) CFTR Phe508Del МВ — 2 СFTR Gly542Ter МВ — 3 CFTR Gly551Asp МВ — 4 CFTR Trp1282Ter МВ — 5 CFTR Asn1303Lys МВ — 6 CFTR 394delTT МВ — 7 CFTR Arg334Trp Руководство по мужскому бесплодию МВ — 8 CFTR 3821delT МВ — 9 CFTR 2143delT Если у мужчины диагностировано ВДОСП, то обоим супругам рекомендуется пройти ДНК-тестирование на мутации CFTR (Руководство ЕAU, 2009) В случае высокого риска супружеской паре предлагается проведение преимплантационной или пренатальной диагностики гена CFTR

29 Анализ результатов Анализ проводится параллельно в 2 пробирках Результат детектируется в агарозном геле N Ампликоны P K- Отрицательный контроль 1 Нормальная гомозигота 2 Гетерозигота 3 Мутантная гомозигота

30 Тест-системы для выявления основных возбудителей бактериального простатита! 35-50% мужчин трудоспособного и репродуктивного возраста болеют простатитом. На долю хронического бактериального простатита приходится 5-15% случаев % 12% 6% 7% У некоторых пациентов Escherichia coli Enterobacter spp. Proteus spp. Serratia spp. Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis/faecium Staphylococcus aureus Streptococcus spp.

31 Комплект ПЦР-систем «Мужское здоровье» Единая программа амплификации для всех возбудителей Чувствительность: >10 4 г-экв/мл для каждого из 8 возбудителей Внутренний контроль геномная ДНК человека Разработаны наборы для определения резистентности уропатогенов к цефалоспоринам

32 Другие генетические полиморфизмы, ассоциированные с мужским бесплодием Genome-wide Study of Single Nucleotide Polymorphisms Associated with Azoospermia and Severe Oligozoospermia К.I. Aston, D.T. Carrell, May 28, 2009 SNPs, ассоциированные с олигозооспермией и азооспермией Символ гена Полиморфизм Локализация полиморфизма 1 PDE 3A фосфодиэстераза 3А 2 PROK2 прокинетицин 2 A-543C C-6680T flanking 5 UTR flanking 5 UTR 3 EFCAB4B G-8037A интрон 4 COBL A-1632G интрон 5 ATP8A1 A-216G интрон 6 MASP1 T-193C интрон

33 PDE3A фосфодиэстераза 3А Полиморфизм гена PDE3A, ассоциированный и с олигозооспермией, и с секреторной азооспермией Определяет подвижность сперматозоидов, способность к проникновению через яйцевую оболочку Необходима для созревания ооцитов Встречается в миоцитах сердца и сосудов, в тромбоцитах Активность фермента выявлена в задней части головки сперматозоида (в постакросомальном сегменте) Фосфодиэстераза 3A регуляторный фермент, участвующий в сигнальном каскаде, опосредованном цамф и цгмф

34 Регуляторный пептид PROK2 прокинетицин 2 Экспрессируется в мозге, обонятельных луковицах и яичках (в первичных сперматоцитах) Участвует в ангиогенезе, нейрогенезе, секреции гормонов Доказана роль прокинетицина в пролиферации и миграции клеток Мутации PROK2 и его рецептора ассоциированы с развитием синдрома Кальмана (нарушение миграции аксонов в обонятельные луковицы и впоследствии миграции нейронов в гипоталамус) Клинические проявления: задержка полового развития и нарушение обоняния (аносмия и гипосмия) Показана связь мутаций PROK2 с гипогонадотропным гипогонадизмом L.W. Cole et al, J Clin Endocrinol Metab 2008, 93 (9): Pitteloud et. al., 2007 (Elizabeth C. Engle, 2010)

35 Гены, ассоциация которых с мужским бесплодием подтверждена Символ гена Полиморфизм 1 MTHFR Метилентетрагидрофолатредуктаза 2 AHRR Репрессор арилгидрокарбонового рецептора (AHRR; Merisalu et.al., 2007, Watanabe et. al.,2004 MTHFR; Lee et.al., 2006) AHRR Ala222Val Ala185Pro Частично бесплодие связывают с токсичным действием окружающей среды. В организме человека из воды, воздуха и пищи могут накапливаться диоксины сильные токсины, обладающие мощным мутагенным, тератогенным и эмбриотоксическим действием. Белок AHRR, кодируемый одноименным геном, препятствует воздействию диоксинов на организм

36 Механизм действия AHRR В цитоплазме диоксины(н) связываются с арилгидрокарбоновым рецептором (AHR) AHR образует комплекс с ядерным транслокатором (ARNT), проникает в ядро, где влияет на транскрипцию «опасных» генов, взаимодействуя с их промоторами. Репрессор арилгидрокарбонового рецептора (AHRR) так же образует комплекс с ядерным транслокатором Комплекс AHRR- ARNT конкурентно связывается с промоторами генов, не влияя на их активность, тем самым останавливает диоксиновый сигнал (Crews S T Genes Dev. 1998;12: )

37 Полиморфизм Ala185Pro гена AHRR Диоксины оказывают негативный эффект на развитие репродуктивных органов и сперматогенез у мужчин Полиморфизм гена AHRR связан с индивидуальной чувствительностью к диоксинам и, таким образом, может быть фактором мужского бесплодия. Ген AHRR Ala185Pro (экзон 6) Мутантный вариант AHRR связывается с AHRT с меньшим сродством и менее эффективно препятствует распространению диоксинового сигнала (Fujita et.al., 2002). Замена Ala на Pro повышает вероятность нарушения развития мужских половых органов и возникновения бесплодия (Soneda et.al., 2005) Гомозиготность Pro/Pro встречается в два раза чаще у пациентов с нарушениями развития репродуктивных органов, чем в контрольной группе (46 % вместо 27% при выборке 59 больных и 80 контрольных пациентов) (Fujita et.al., 2002).

38 В НПФ Литех разработаны ПЦР-системы для определения генетических мутаций, ассоциированных с мужским бесплодием: Микроделеций AZF-субрегиона Полиморфизмов гена CFTR Полиморфизма MTHFR Гена AHRR А также генов-кандидатов: PDE 3A PROK2 EFCAB4B COBL ATP8A1 MASP1

39 Спасибо за внимание! (495)

40 Литература 1. Lee HC, jeong YM, lee SH, cha KY, song SH, kim NK, lee KW, lee S. Association study of four polymorphisms in three folaterelated enzyme genes with nonobstructive male infertility Hum reprod.;21: Disteche CM. Y chromosome infertility.genereviews [internet]. Seattle (WA): university of washington, seattle; oct 31 [updated 2007 mar19]. 3. D.Pellati et al. Eur J obstet gynecol reprod biol (2008) 140: Emre Seli And Denny Sakkas. Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome: implications for ART human reproduction update, vol.11, no.4 pp , Исламова А.А. Роль y-хромосомы и митохондриального генома в нарушении сперматогенеза. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Г. Уфа.2007 г. 6. В.Б. Черных. AZF делеции частая генетическая причина бесплодия у мужчин:современное состояние исследований. Проблемы репродукции, 1, стр , Черных В.Б. и др. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований. Медицинская генетика. Т стр Krausz C, mcelreavey K. Y chromosome and male infertility. Front biosci jan 15;4:E Черных В.Б., Курило Л.Ф., Гоголевская И.К. и др. Комплексное клинико-генетическое обследование пациентов с азооспермией или олигозооспермией неясной этиологии // Пробл.репрод Т. 7, 3,- с Leah Yogev,shmuel Segal, Einav Zeharia,ronni Gamzu, Batia B. Maymon,gedalia Paz,amnon Botchan, Ron Hauser, Haim Yavetz, And Sandra E. Kleiman. Sex chromosome alignment at meiosis of azoospermic men with azoospermia factor microdeletion. Journal оf Andrology, vol. 25, no. 1, january/february Foresta et al. Руководство по медико-генетическому обследованию супружеских пар с нарушением репродукции Europ J hum genet v Paulo Navarro-costa, Carlos E. Plancha, And Jo ao Goncalves Genetic dissection of the AZF regions of the human Y chromosome: thriller or filler formale (in)fertility? Journal of biomedicine and biotechnology M. Simoni, E. BAkker аnd C. Krausz. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y-chromosomal microdeletions. State of the art International journal of andrology, 27: (2004) 14. European association of urology, Guidelines of male infertility, 2010

41 Литература 15. M.De braekeleer, С. Ferec. Mutations in the cystic fibrosis gene in men with congenitalbilateral absence of the vas deferensmol Hum.reproduct 1996 v2, 9, База данных 1500 мутаций гена CFTR ( 17. European association of urology, Guidelines of male infertility, L.W. Cole et al, J clin endocrinol metab 2008, 93 (9): pitteloud et. Al., Eric Soupene, Dwi Utami Kemaladewi, And Frans A Kuypers. ATP8A1 activity and phosphatidylserine transbilayer movement. J receptor ligand channel res ; 1: Bettina Winckler, and Dorothy A. Schafer, Cordon-bleu:a new taste in actin nucleation. Cell 131, october 19, Ahuja, R., Pinyol, R., Reichenbach, N., Cuter, L., Klingensmith, J., Kessels, M.M., And Qualmann,b. Cordon-bleu is an actin nucleation factor and controls neuronal morphology(2007). Cell 22. Matsushita, m., S. Thiel, J. C. Jensenius, I. Terai, and T. Fujita Proteolytic activities of two types of mannose-binding lectin-associated serine protease. J. Immunol. 165: Yuichi Endo, Masaru Nonaka, Hidetoshi Saiga,yuji Kakinuma, Akiko Matsushita,minoru Takahashi, Misao Matsushita,and Teizo Fujita. Origin of mannose-binding lectin-associated serine protease (MASP)-1 and MASP-3 involved in the lectin complement pathway traced back to the invertebrate, amphioxus.the J. Immunol. 2003;170; Merisalu A, Punab M, Altmäe S, Haller K, Tiido T, Peters M, Salumets A.. The contribution of genetic variations of aryl hydrocarbon receptor pathway genes to male factor infertility.2007 Fertil steril ;88(4): Soneda S, Fukami M, Fujimoto M, Hasegawa T, Koitabashi Y, Ogata T. Association of micropenis with pro185ala polymorphism of the gene for aryl hydrocarbon receptor repressor involved in dioxin signaling.endocr J feb;52(1): Takafumi Watanabe, Issei Imoto, Yoshinori Kosugi, Yoji Fukuda, Junsei Mimura, Yoshiaki Fujii, Keiichi Isaka,Masaomi Takayama,Akira Satojoh,Ji Inazawa. Human arylhydrocarbon receptor repressor (AHRR) gene: genomic structure and analysis of polymorphism in endometriosis. J hum genet (2001) 46: Hideki Fujita,rika Kosaki,hiroshi Yoshihashi, Tsutomu Ogata, Masaru Tomita, Tomonobu Hasegawa, Takao Takahashi, Nobutake Matsuo, And Kenjiro Kosaki. Characterization of the aryl hydrocarbon receptor repressor gene and association of its pro185ala polymorphism with micropenis. Teratology 65:10 18 (2002) 28. Han-chul Lee, Yu-mi Jeong, Sook Hwan Lee, Kwang Yul Cha, Seung-hun Song,nam Keun Kim, Kyo Won Lee And Suman Lee. Association study of four polymorphisms in three Folate-related enzyme genes with non-obstructive male infertility. Human reproduction vol.21, no.12 pp , 2006

42 Поли-Т полиморфизм 8 интрона гена CFTR GTTTTTTTTTAAACAG 9T GTTTTTTTAAACAG 7T GTTTTTAAACAG 5T 5 Интрон 7 Интрон 8 Интрон 9 Экзон 8 Экзон 9 Экзон 10 3 Альтернативный сплайсинг Экзон 8 Экзон 9 Экзон 10 Экзон 8 Экзон 10 Нормальная мрнк мрнк без экзона 9 У гомозигот 5Т/5Т количество нормального белка может быть менее 10%

источник

Для более быстрой и комфортной работы с сайтом бэби.ру
мы рекомендуем обновить ваш браузер.

Для этого необходимо скачать и установить обновление,
с официального сайта браузера.

Что такое наследственные тромбофилии
Наследственные (генетические) тромбофилии – это обусловленные генетическими дефектами нарушения свойств крови («мутации системы гемостаза») и строения сосудов. Генетическая тромбофилия наследуется от родителей – от одного или обеих. Ген может быть один или несколько. Носительство может проявиться в детском возрасте, в период беременности, при приёме оральных контрацептивов, на протяжении жизни или никогда.

Как действуют мутации?
Выявлено много генов, так или иначе ассоциированных со свертываемостью крови. При мутациях в одних генах может повышаться риск тромбозов, сердечно-сосудистых нарушений, невынашивания беременности, осложнений на поздних сроках беременности. А мутации в других генах действуют наоборот, снижая свертываемость крови, уменьшая вероятность тромбоза. Третья группа генов влияет не на само свертывание крови, а на то, как организм будет воспринимать лекарства.
Мутации генов системы гемостаза проявляются с неодинаковой силой. Есть наиболее значимые и «опасные», например, мутация протромбина или лейденская мутация. А если такие, которые сами по себе не дают выраженного действия, но усиливают действие друг друга или основных мутаций.

Когда гинеколог назначает анализ на мутации системы гемостаза
Полиморфизм генов гемостаза назначается гинекологом в четырех основных случаях — невынашивание беременности, подготовка к ЭКО, осложнения беременности, планирование контрацепции.

Какие полиморфизмы сдаются?
Так как разные мутации могут действовать совместно, усиливая действие друг друга, для понимания картины и выявления причины лучше сдавать полный блок анализов.

Комплексное обследование: Полиморфизм генов системы гемостаза и метаболизма фолатов, полное обследование, 12 показателей. Генетические полиморфизмы, ассоциированные с риском развития тромбофилии и нарушениями фолатного обмена.

Ген F2 – протромбин (фактор II свертывания крови), кодирует предшественник тромбина.
Ген F5 – проакцелерин (фактор V свертывания крови), кодирует белковый кофактор при образовании тромбина и з протромбина.
Ген MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктаза).
Ген PAI1 – серпин (антагонист тканевого активатора плазминогена)
Ген FGB – фибриноген (фактор I свертывания крови).
Ген F7 – проконвертин, или конвертин (коагуляционный фактор VII свертывания крови).
Ген F13A1 – фибриназа (фактор XIII свертывания крови).
Ген ITGA2 – α–интегрин (тромбоцитарный рецептор к коллагену).
Ген ITGB3 – интегрин (GpIIIa) (тромбоцитарный рецептор фибриногена, или тромбоцитарный гликопротеин IIIa).
Ген MTR (В12-зависимая метионин-синтаза), кодирует аминокислотную последовательность фермента метионинсинтазы — одного из ключевых ферментов обмена метионина.
Ген MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктаза).

Такое обследование можно быстро пройти в лаборатории клиники ЦИР, которая специализируются на проблемах свертывания крови, гемостазиологии, причем дополнительная скидка действует при оплате через интернет-магазин, см. http://www.cirlab.ru/price/143621/

Как расшифровать анализы на мутации

Немного о генетике. В организме человека 46 хромосом, 22 пары так называемых аутосом и 1 пара половых: у женщины это две Х хромосомы (ХХ), у мужчины — Х и Y.

Из пары одна хромосома достаётся от мамы, а вторая — от папы.

В хромосоме выделяют гены — участки хромосомы, которые несут целостную информацию. В каждой хромосоме свой набор генов, расположенных в одинаковых местах. В парных хромосомах в одном месте находятся одинаковые гены, например, ген того же протромбина. Но так как хромосомы достаются от разных родителей, варианты гена могут быть разными. Например, от мамы обычный ген протромбина, а от папы — с мутацией, повышающей риск тромбоза. Это называют вариантами или полиморфизмом генов. Если у человека одинаковые варианты в обеих хромосомах, это называется гомозиготностью, если разные — гетерозиготностью.

Кстати, я специально указала, что у мужчины разные половые хромосомы. Это означает, что информация из Х и Y хромосомы у мужчины представлена в одном экземпляре!

Пример расшифровки анализа

Мутацией Лейдена называют состояние, когда в гене фактора V свертывания крови один крохотный « кусочек» гена — гуанин — заменяется на другой — аденин, в месте под номером 1691. Эта замена приводит к тому, что в белке, который кодируется этим геном, одна аминокислота (структурная единица белка) заменяется на другую (аргинин на глутамин).

Правильная запись этого варианта гена может быть такой: G1691A (замена гуанин на аденин); Arg506Gln (замена аргинина на глютамин) или R506Q (R — однобуквенное обозначение аргинина, Q — однобуквенное обозначение глютамина). При проведении анализа на полиморфизмы генов исследуется оба гена для поиска искомого полиморфизма (мутации).

Варианты заключений по этому гену:

G/G – то есть в обоих вариантах генов гуанин, замены нет, то есть вариант гена без лейденской мутации

G/A – в одном варианте есть полиморфизм, называемый лейденской мутацией, а в другом нет (генерозигота)

A/A – в обоих вариантах генов обнаружен полиморфизм G1691A

Это одна из «опасных» мутаций, которая встречается примерно у 2 человек из 100.

Например, вариант гена V фактора свертывания крови, называемый лейденской мутацией, связан с тромбофилиями (склонность к развитию тромбозов). Тромбозы развиваются при наличии дополнительных факторов риска: приема гормональных контрацептивов (риск тромбозов повышается в 6 — 9 раз), наличия других мутаций, присутствия некоторых аутоантител, повышения концентрации гомоцистеина, курении.

При наличии мутации даже в одной копии гена, повышается риск тромбоза вен нижних конечностей, тромбоэмболии лёгочной артерии, тромбозы сосудов головного мозга, тромбозов артерий в молодом возрасте.

У пациенток с лейденской мутацией возможны привычное невынашивание беременности, поздние осложнения беременности, отставание развития плода, фетоплацентарная недостаточность.

источник

3 Сперматогенез Зрелый сперматозоид ( По

19 Комплект реагентов для выявления частых микроделеций локуса AZF Y-хромосомы методом ПЦР

39 Спасибо за внимание! (495)

источник

Молекулярные маркеры ассоциированные с мужским бесплодием

Добавить комментарий Отменить ответ