От бешенства спасут дрожжи
STRF.ru
По словам специалистов, бешенство до сих пор остается практически неизлечимым заболеванием. В мире от него ежегодно погибает до 50 тысяч человек, и рост инфекции продолжается. Россия, к сожалению, тоже не отстаёт от этой печальной статистики.
Исследователи Научного центра молекулярной диагностики и лечения во главе с руководителем отдела биотехнологии Петром Свешниковым при господдержке со стороны Роснауки начали разработку технологии производства первого отечественного препарата от бешенства. По планам авторов, терапевтические антитела против возбудителей болезни будут вырабатывать генномодифицированные дрожжи.
По словам специалистов, бешенство до сих пор остается практически неизлечимым заболеванием. В мире от него ежегодно погибает до 50 тысяч человек, и рост инфекции продолжается. Как отметил, Пётр Свешников, Россия тоже не отстаёт от этой печальной статистики.
Единственный способ лечения бешенства в настоящий момент – применение особых терапевтических антител, так называемых антирабических иммуноглобулинов. Антитела (или иммуноглобулины) – особые белки, образующиеся в организме в ответ на попадание чужеродных веществ, в частности, возбудителей бешенства, и нейтрализующих их вредное воздействие. Если человек заболевает бешенством, то вирус, первоначально попадая в кровь, успевает поразить клетки центральной нервной системы (ЦНС) раньше, чем организм успеет выработать в крови собственные антитела. Следом за вирусом проникнуть в клетки ЦНС антитела уже не способны. Поэтому без срочного укола раствором уже готовых антител не обойтись.
До недавнего времени лекарство от бешенства получали очищением иммуноглобулинов, выделяемых из сыворотки крови лошадей, но такие лекарства не всегда достаточно эффективны. Именно поэтому в рамках нового амбициозного проекта учёные планируют сделать первый реальный шаг к разработке отечественного препарата против бешенства на основе так называемых гуманизированных антител. Исследователи намерены частично изменить генотип антител, получаемых у мышей, на генные конструкции, свойственные человеческим. Причем, как пояснил Петр Свешников, антитела от бешенства смогут производить особые генномодифицированные дрожжи, что существенно удешевит стоимость готового препарата. В рамках проекта учёные также намерены разработать технологию полного цикла получения терапевтических антител от бешенства с помощью генномодифицированных дрожжей, которая ляжет в основу производства нового препарата.
Кстати, как отметил Пётр Свешников, хотя в мире уже разрешено к применению больше двух десятков лекарств на основе терапевтических антител, отечественных среди них до сих пор нет, хотя научные исследования в этом направлении ведутся в России ещё с середины 1980-х годов.
Что касается гуманизированных антител от бешенства, то, как пояснил Пётр Свешников, в мире уже есть как минимум один препарат на основе антитела CR4098, разработанный в компании Crucell (Нидерланды). Он находится на первой фазе клинических испытаний. «Конечно, наши фармкомпании теоретически могли бы приобрести лицензию на выпуск препарата за рубежом, но, по известным мне данным, цена подобных сделок составляет примерно 200 миллионов долларов, что приближается к годовому обороту ведущих отечественных фармацевтических производителей», – подчеркнул Свешников. По этому, считает исследователь, единственный альтернативный импорту способ получить современный препарат против бешенства – его разработка в России.
Планируемые сроки окончания проекта – конец сентября 2010 года. Общий объём государственной поддержки составит семь миллионов рублей.
Итогом работы стали два запатентованных наноантитела. Мы продолжаем работу — хотим ещё больше повысить активность полученных наноантител: оптимизируем их структуру, пытаемся получать их производные, попробуем улучшить свойства связывания и эффективности действия. Мы надеемся по эффективности приблизиться, а может, и превзойти “Авастин”.
Ученые из Исследовательского института им. Эллен Скриппс одной вакциной и дополнительной инъекцией излечили мышей сразу от двух видов опухолей: меланомы и рака толстой кишки. Причём устойчивость к опухоли стала лишь демонстрацией нового подхода, который, по расчетам авторов, при соответствующей модификации подойдёт и для ВИЧ, и для гриппа, и для любых других инфекций.
При раке, диабете, заболеваниях сердца и многих других болезнях химический состав пота изменяется. Антитела могут обнаруживать в отпечатках пальцев специфические для каждой из болезней вещества.
Экспериментальную методику лечения СПИДа успешно испытали на макаках. Разработчики надеются в следующем году приступить к испытаниям нового метода на людях.
Направленное воздействие на специфические антигены клеток печени может предупреждать появление аутоиммунных воспалительных заболеваний головного мозга и помогать их лечению.
Электронное СМИ зарегистрировано 12.03.2009
Свидетельство о регистрации Эл № ФС 77-35618
источник
Лоуренс Кори (Lawrence Corey)
Бешенство представляет собой остропротекающую вирусную болезнь млекопитающих, характеризующуюся поражением центральной нервной системы и передающуюся с инфицированным секретом, обычно слюной.
Чаще всего заражение бешенством происходит во время укуса инфицированного животного, однако в ряде случаев оно может произойти при попадании в организм аэрозольных частиц, содержащих вирус, при использовании в пищу мяса больных животных или в случае трансплантации инфицированных тканей.
Этиология. Вирус бешенства принадлежит семейству рабдовирусов. Вирион имеет форму пули, покрыт оболочкой, содержит одну спираль рибонуклеиновой кислоты (РНК). Диаметр вириона 75—80 нм. Поверхность вириона покрыта гликопротеидными наростами длиной 6—7 нм, имеющими булавовидные утолщения на дистальном конце. Вирусные гликопротеиды способны связываться с ацетилхолиновыми рецепторами и обусловливают нейровирулентность вируса бешенства. Эти поверхностные структуры стимулируют образование нейтрализующих и гемагглютининподавляющих антител, в то время как нуклеокапсидные антигены индуцируют образование комплементсвязывающих антител. Нейтрализующие антитела к поверхностным гликопротеидам играют, видимо, . защитную роль. Антитела против вируса бешенства, используемые в диагностических иммунофлюоресцентных исследованиях, как правило, направлены против нуклеокапсидных антигенов. Вирусы бешенства, выделенные из различных видов животных и из разных областей, имеют разные биологические свойства. Также были обнаружены антигенные вариации у разных штаммов, что может объяснить различия их вирулентности и отсутствие эффекта при использовании некоторых режимов вакцинации. Вирус бешенства индуцирует синтез интерферона, осо бенно в тканях с высокой концентрацией вирусов, что может играть определенную роль в замедлении прогрессирования инфекции.
Эпидемиология. Бешенство существует в двух эпидемиологических формах: городская форма бешенства распространяется главным образом неиммунизированными домашними животными, собаками и/или кошками; лесная форма бешенства распространяется скунсами, лисами, енотами, мангустами, волками и летучими мышами. Инфекция домашних животных чаще всего «выплескивается» из лесного резервуара инфекции. А человек может быть заражен как домашними, так и дикими животными. Таким образом, заболевание у человека, как правило, возникает в областях, где бешенство носит энзоотический или эпизоотический характер, где имеется большое количество неиммунизированных домашних животных и где люди часто контактируют с дикими животными. Несмотря на’то что ВОЗ сообщает лишь о 800 случаях смерти от бешенства ежегодно, общая частота регистрации бешенства во всем мире свидетельствует о том, что ежегодно возникает около 15000 случаев заболевания. Юго-Восточная Азия, Филиппины, Африка и Индийский субконтинент — это те области, где заболевание особенно распространено. Увеличение распространения лесной формы бешенства и частые посещения стран с высоким уровнем городской формы бешенства делают проблему диагностики и профилактики этого заболевания чрезвычайно важной. В США бешенство у человека встречается исключительно редко. Ежегодно сообщают не более чем о пяти случаях.
В большинстве стран мира основным переносчиком вируса бешенства для человека является собака, хотя волки (Восточная Европа, арктические районы), мангусты (Южная Африка, Карибский район), лисы (Западная Европа) и летучие мыши-вампиры (Латинская Америка) также могут выступать в качестве переносчика заболевания. Грызуны редко инфицируются вирусом бешенства. В США наиболее важными источниками заболевания человека служат скунсы, летучие мыши и еноты. Вирус бешенства встречается преимущественно у диких животных (85%) и только у 2—3% домашних собак и кошек. Однако в большинстве случаев профилактические мероприятия против бешенства проводятся после укусов собак.
Сообщалось о передаче бешенства при трансплантации роговицы.
Патогенез. На первом этапе вирус проникает через эпидермис или попадает на слизистую оболочку. Первичная репликация вирусов происходит, видимо, в клетках поперечнополосатых мышц в месте инокуляции вируса. Контакт вируса с периферической нервной системой осуществляется в области нейромышечного и/или нейросухожильного веретена. Затем, возможно по аксоплазме периферического нерва, вирус распространяется афферентно к центральной нервной системе. Развивающейся вирусемии, как показали эксперименты, недостаточно, чтобы играть ведущую роль в генезе естественного заболевания. После того как вирус достиг центральной нервной системы, он начинает реплицироваться в сером веществе мозга, а затем распространяется эфферентно вдоль вегетативных нервов в другие ткани — слюнные железы, кору надпочечников, почки, легкие, скелетные мышцы, кожу и сердце. Нахождение вируса в слюнных железах обусловливает дальнейшее распространение заболевания с инфицированной слюной. Инкубационный период бешенства чрезвычайно вариабелен: от 10 дней до 1 года и более (в среднем 1—2 мес). Его продолжительность, видимо, зависит от количества попавших в организм вирусных частиц, объема пораженной ткани, защитных механизмов макроорганизма, расстояния, которое вирус должен преодолеть от места инокуляции до центральной нервной системы. Исследования у животных показали, что выраженность иммунного ответа макроорганизма и особенности вирусного штамма также влияют на активность заболевания. Аттенуированные штаммы вируса бешенства вызывают более выраженный цитотоксический эффект по сравнению с диким «уличным» вирусом. Животным, у которых развивается паралитическое бешенство (немое бешенство), видимо, свойствен более выраженный иммунный ответ на инфекцию, чем тем, у которых развивается молниеносный энцефалит.
Нейропатология бешенства сходна с изменениями, которые вызывают другие вирусные заболевания, поражающие центральную нервную систему, — гиперемия, хроматолиз различной степени выраженности, пикноз ядер, нейронофагия, лимфоцитарная и плазмоклеточная инфильтрация периваскулярного пространства; инфильтрация микроглии и разрушение нервных клеток паренхиматозных областей. Патогномоничным признаком бешенства является появление телец Бабеша—Негри, представляющих собой эозинофильное образование размером около 10 нм, состоящее из тонкого фибриллярного матрикса и частиц вируса бешенства. Тельца Бабеша—Негри локализуются в мозге, в частности в гиппокампе, коре и стволе мозга, грушевидных нейронах мозжечка, дорсальных ганглиях спинного мозга. Тельца Бабеша—Негри могут отсутствовать приблизительно в 20% случаев бешенства, что, однако, не исключает этого диагноза.
Клинические проявления. Клинические проявления бешенства могут быть разделены на следующие стадии: 1) неспецифический продромальный период; 2) острый энцефалит, сходный с другими вирусными энцефалитами; 3) глубокая дисфункция стволовых центров, сопровождающаяся классической картиной энцефалита при бешенстве, и 4) выздоровление (в редких случаях).
Продромальный период обычно длится в течение 1—4 дней и характеризуется лихорадкой, головными болями, недомоганием, мышечными болями, повышенной утомляемостью, отсутствием аппетита, тошнотой и рвотой, болями в горле, непродуктивным кашлем, а также парестезиями и/или мышечными подергиваниями в области инокуляции вируса (этот симптом присутствует у 50—80% больных).
О начале стадии острого энцефалита обычно возвещает период избыточной двигательной активности, возбуждения и тревоги. Быстро вслед за этим развиваются нарушения сознания, галлюцинации, агрессивность, спутанность мыслей, менингизм, опистотонус, судороги, местные параличи. Характерно, что периоды нарушения сознания перемежаются периодами его полного восстановления (светлые промежутки). Однако по мере прогрессирования заболевания светлые промежутки становятся короче, затем больной впадает в кому. Очень часто имеет место гиперестезия, избыточная чувствительность к яркому свету, громким звукам, прикосновениям и даже легкому дуновению. Температура тела повышается до 40,6°С. Со стороны вегетативной нервной системы отмечают такие изменения, как неравномерное расширение зрачков, повышенное слезотечение, саливация, потоотделение и постуральная гипотензия. Паралич верхнего двигательного нейрона приводит к слабости, повышению глубоких сухожильных рефлексов и разгибательных подошвенных реакций. Часто развивается паралич голосовых связок.
Вскоре после начала стадии острого энцефалита появляются признаки дисфункции ствола мозга. Вовлечение в процесс черепных нервов приводит к появлению диплопии, паралича лицевого нерва, неврита глазного нерва. Характерно затруднение глотания. Сочетание избыточной саливации и затруднения глотания слюны дает традиционную картину «пены у рта». Приблизительно в 50% случаев можно наблюдать гидрофобию, представляющую собой болезненные, сильные, непроизвольные сокращения диафрагмы, дополнительной дыхательной, глоточной и гортанной мускулатуры, развивающиеся в ответ на попытку проглотить жидкость. Поражение миндалевидного тела может вызвать приапизм и спонтанную эякуляцию. Больной впадает в кому, а вовлечение в процесс дыхательного нерва вызывает смерть в результате апноэ. Выраженность ранней дисфункции ствола мозга отличает бешенство от других вирусных энцефалитов и лежит в основе быстрого прогрессирования заболевания. Средний период течения заболевания после появления симптомов составляет 4 дня, максимально 20 дней при условии проведения искусственных поддерживающих мероприятий.
Если проводится интенсивная дыхательная терапия, то может возникнуть целый ряд поздних осложнений, включая нарушение секреции антидиуретического гормона, несахарный диабет, нарушения ритма сердца, сосудистую нестабильность, респираторный дистресс-синдром взрослых, желудочно-кишечное кровотечение, тромбоцитопению и паралитический илеус. Выздоровление бывает очень редко, но если имеет место, то происходит постепенно. Сообщают лишь о трех подобных случаях. В двух случаях пациентам проводили частичную профилактику после контакта с вирусом, а в третьем случае лабораторного бешенства, возникшего, видимо, вследствие вдыхания аэрозоля, пациент получил профилактическое вмешательство еще до контакта с вирусом.
Иногда бешенство может проявляться в виде восходящего паралича (тихое бешенство). Этот клинический вариант развивается чаще всего после укуса ле тучей мыши-вампира или если профилактика заболевания проводилась еще до контакта с вирусом.
Трудность диагностики бешенства в тех случаях, когда оно сочетается с восходящим параличом, подтверждается фактом передачи вируса при трансплантации зараженных вирусом тканей. Трансплантация роговицы от донора, который умер предположительно от восходящего паралича, привела к развитию клинической картины бешенства и смерти у реципиента. Ретроспективное патологическое исследование препаратов мозга обоих пациентов показало наличие телец Бабеша—Негри. Впоследствии из замороженных глазных яблок донора был выделен вирус бешенства.
Лабораторные исследования. На ранних стадиях заболевания показатели гемоглобина и рутинные показатели крови остаются в пределах нормы. Изменения возникают по мере того, как развивается дисфункция гипоталамуса, появляются желудочно-кишечное кровотечение и другие осложнения. Лейкоцитоз периферической крови обычно составляет 12—17•109/л, но может достигать и 30•109/л или, напротив, оставаться в пределах нормы.
Как и при любой вирусной инфекции, специфическая диагностика бешенства зависит от 1) выделения вируса из инфицированных сред организма— слюны, редко спинномозговой жидкости или тканей мозга; 2) серологического подтверждения острой инфекции или 3) обнаружения вирусных антигенов в инфицированных тканях (контактных мазках роговицы, биопсии кожи или мозга). Образцы ткани мозга, полученные либо при аутопсии, либо при биопсии мозга, следует 1) ввести мышам для дальнейшего выделения вируса; 2) обработать флюоресцирующими антителами, позволяющими идентифицировать антигены; 3) подвергнуть гистологическому и/или электронно-микроскопическому исследованию с целью обнаружения телец Бабеша—Негри. Если жизнь пациента поддерживается и в организме присутствует большое количество нейтрализующих антител (в сыворотке и спинномозговой жидкости), то исследования с инокуляцией вируса и прямой обработкой материала флюоресцирующими антителами для обнаружения антигенов являются надежными и чувствительными. Но может произойти «аутостерилизация», и тогда результаты этих методов будут отрицательными. Использование флюоресцирующих антител для обработки препаратов биопсии кожи, контактных мазков роговицы и слюны позволяет обнаружить антигены вируса бешенства и облегчить прижизненную диагностику заболевания. Следует, однако, попытаться подтвердить эти результаты серологическими методами исследования или обнаружением вируса в тканях мозга.
Если больной не получал противорабической иммунизации, то диагностическое значение имеет четырехкратное повышение титра нейтрализующих антител к вирусу бешенства в серии проб сыворотки. Если больной был вакцинирован против бешенства, то ключом к постановке диагноза служат абсолютный титр нейтрализующих антител и наличие антител к вирусу бешенства в спинномозговой жидкости. Профилактика бешенства, проводимая после контакта больного с вирусом, редко приводит к образованию нейтрализующих антител, попадающих в спинномозговую жидкость. Даже если они присутствуют, то обычно их титр невысок, менее 1:64, в то время как при бешенстве титр антител в спинномозговой жидкости у человека варьирует от 1:200 до 1:160000.
Дифференциальная диагностика. Наибольшую помощь при дифференциальной диагностике бешенства оказывает анамнестический факт контакта пациента с вирусом. К другим состояниям, которые следует иметь в виду при проведении дифференциальной диагностики, относятся истерическая реакция на укус животного (псевдогидрофобия), восходящий паралич, полиомиелит и аллергический энцефаломиелит в ответ на введение рабической вакцины. Последний чаще всего развивается после использования вакцины, полученной из нервной ткани, и проявляется через 1—4 нед после вакцинации.
Профилактика и лечение. Ежегодно более 1 млн американцев обращаются по поводу укусов животных. В каждом случае необходимо принимать решение о том, начинать ли постконтактную противорабическую профилактику. Если принимается решение о начале проведения профилактики, то следует иметь в виду следующие положения: 1) имелся ли физический контакт пациента со слюной или другими веществами, способными содержать вирус бешенства; 2) бешенство имеется или только подозревается у животных, обитающих в соответствующей местности (например, все лица, которых на континентальной части США укусила летучая мышь, улетевшая затем в неизвестном направлении, должны получить постконтактную профилактику); 3) обстоятельства, при которых произошел контакт; 4) варианты лечения и возможные осложнения. Алгоритм проведения постконтактной профилактики бешенства представлен на рис. 142-1.
Рис. 142-1. Алгоритм постконтактной профилактики бешенства (домашний скот и невакцинированные собаки и кошки с нормальным поведением требуют индивидуального подхода. Следует обратиться за консультацией в соответствующие местные и государственные официальные учреждения).
Если известно, что данный вид животных поражен бешенством или этот факт нельзя исключить, то животное, укусившее человека, должно быть при возможности изолировано. Диких животных или любых больных, невакцинированных или заблудившихся домашних животных, в особенности животных, неспровоцированно напавших на человека, поведение которых ненормально, подозрительных на бешенство, следует поймать и умертвить. Голову животного следует немедленно отправить в соответствующую лабораторию для обследования на наличие вируса бешенства. Если обследование мозга животных с помощью флюоресцентных методов не выявило наличия вирусного антигена, то можно предположить, что слюна также не содержит вирус и укушенному человеку лечение можно не проводить. Лица, контактировавшие с исчезнувшим диким животным, которое с большой степенью вероятности могло быть заражено вирусом бешенства (летучая мышь, скунс, койот, лиса, енот и т. д.) в области, где наличие бешенства известно или подозревается, должны получить как пассивную, так и активную иммунизацию против бешенства.
Если здоровое животное (собака или кошка) кусает человека, оно должно быть поймано, изолировано и находиться под наблюдением в течение 10 дней. Если за это время развивается заболевание или поведение животного стано вится ненормальным, то его следует умертвить и обследовать с помощью флюоресцентных методов на наличие вируса бешенства.
Постконтактная профилактика. После того как принято решение о необходимости начать постконтактную профилактику бешенства, следует руководствоваться общим принципом терапии при бешенстве, заключающимся в следующем: уменьшить количество вируса в области инокуляции путем местной обработки раны и способствовать формированию раннего и стойкого титра нейтрализующих антител к вирусу бешенства. В большинстве случаев это включает введение глобулина и вакцин. Рекомендуют использовать следующую схему лечения:
1. Местная обработка раны заключается в тщательном ее промывании с применением моющих средств и большого количества воды. Важно как механическое, так и химическое очищение раны. Также целесообразно использовать такие вещества, как 1—4% растворы хлорида бензалкония или 1% раствор бромида цетримония. Однако 0,1% растворы бензалкония менее эффективны, чем 20% мыльные растворы. Обычно вводят также противостолбнячный анатоксин и антибиотики (как правило, пенициллин).
2. Пассивная иммунизация антирабической антисывороткой лошадиного или человеческого происхождения. Предпочтение следует отдавать человеческому антирабическому иммуноглобулину, поскольку после введения лошадиной антисыворотки высока частота возникновения сывороточной болезни (20—40%).
Половину общей дозы антирабического иммуноглобулина (составляющую 20 ЕД/кг) или лошадиной сыворотки (составляющую 40 ЕД/кг) вводят местно, инфильтрируя рану, вторую половину вводят внутримышечно.
3. Активная иммунизация антирабической вакциной. В Соединенных Штатах имеется в настоящее время лишь одна инактивированная антирабическая вакцина, приготовленная на основе лабораторного штамма вируса бешенства в культуре диплоидных клеток человека (ВДКЧ). Вакцина, созданная в Европе (Институт Мерьё), основана на использовании цельного вируса. Вакцина ВДКЧ, созданная в США, состоит из субъединиц, растворенных в tri-n-бутилфосфате и затем инактивированных бета-пропиолактоном. Вакцина института Мерьё, видимо, более иммуногенна, и с февраля 1985 г. вакцина Wyeth изъята с рынка США.
Тяжелые поствакцинальные осложнения после введения ВДКЧ редки. Приблизительно у 1 из 650 реципиентов развиваются реакции немедленной гиперчувствительности с появлением уртикарной сыпи. Системные реакции, такие как лихорадка, головные боли и тошнота, протекают обычно легко и встречаются у 1—4% реципиентов. У 15—20% вакцинированных можно наблюдать местные реакции: отек, эритему и уплотнение места инъекции.
Как можно скорее после контакта с вирусом необходимо внутримышечно ввести 5 доз ВДКЧ по 1 мл. Одновременно с введением первой дозы вакцины (день 0) в другую руку больного следует ввести антирабический иммуноглобулин. Последующие дозы вакцины следует вводить на 3-й, 7-й, 14-й и 28-й день.
К настоящему времени наблюдение за 575 лицами, перенесшими укусы животных с подтвержденным диагнозом бешенства, показало, что ни один пациент из тех, кому вводили ВДКЧ в комбинации с антирабическим иммуноглобулином, бешенством не заболел. У всех больных, получивших антирабический иммуноглобулин и 5 доз ВДКЧ внутримышечно, сформировался адекватный титр антител: не менее 1:5 при флюоресцентном экспресс-анализе с подавлением фокуса. Сочетанное введение антирабического иммуноглобулина с внутрикожным введением вакцины в дозе 0,1 мл в восемь участков в день 0, в четыре участка на 7-й день и в один участок на 28-й и 91-й дни также создает хорошую ответную реакцию антител.
Предконтактная профилактика. Лица с высоким риском контакта с вирусом бешенства — ветеринарные врачи, спелеологи, сотрудники лабораторий, лица, работающие с животными,—должны получать предконтактную профилактику с применением антирабической вакцины. Для этой цели предпочтение следует отдавать ВДКЧ: в день 0, на 7-й и с 21-го по 28-й дни следует вводить внутримышечно по три дозы вакцины или в те же дни внутрикожно в области дельтовидной мышцы три дозы по 0,1 мл. После вакцинации необходимо проверить титр нейтрализующих антител. Повторную иммунизацию можно проводить в виде однократного введения 1 мл вакцины внутримышечно или 0,1 мл внутрикожно. Постконтактная профилактика у лиц, ранее получивших пред-контактную терапию, включает только применение вакцины. Как правило, достаточно бывает в день 0 и на 3-й день ввести по 2 дозы ВДКЧ.
Повторную иммунизацию рекомендуется проводить с интервалом в 2 года. Однако при этом у 6% лиц, получивших ВДКЧ внутримышечно, развиваются реакции по типу иммунных комплексов, характеризующиеся появлением уртикарной сыпи, артритов, тошноты, рвоты, а иногда и сосудистого отека. Несмотря на то что эти реакции самокупируются, периодически рекомендуется определять уровни антител. Повторную иммунизацию следует проводить лицам с низкими титрами антител, у которых повышен риск контакта с вирусом.
Определение. Вирус Марбург (вирус церкопитековой геморрагической лихорадки) вызывает острое системное фебрильное заболевание, характеризуемое внезапным появлением головных болей, миалгии, фарингита, сыпи и геморрагических изменений. Впервые он был обнаружен в 1967 г., когда вызвал одновременно в ФРГ и Югославии вспышку заболевания среди работников лаборатории, контактировавших с импортированными из Африки зелеными обезьянами (Cercopithecus aethiops). Есть сообщение о вспышке заболевания в Кении. Клинические проявления заболевания сходны с симптомами других геморрагических лихорадок, вызываемых вирусами рода ареновирус или флавивирус (аргентинская и боливийская геморрагическая лихорадка, см. гл. 144). Высокая смертность и способность к нозокомиальному распространению сделало идентификацию этого редкого патогенного агента задачей, важной для всемирного здравоохранения.
Этиология. Вирус Марбург размножается в организме морской свинки и на различных клеточных культурах, таких как клетки почки пестрой мартышки-верветки. Вирусная частица содержит липид и РНК, при электронно-микроскопическом исследовании установлено, что она имеет вид волокнистых удлиненных частиц длиной 80—100 нм с отдельными пузыревидными наростами. Вирус Марбург имеет некоторое морфологическое сходство с другими представителями группы рабдовирусов, а именно вирусом бешенства и вирусами Мокола. Физико-химические исследования показали идентичность вирусов Марбург и Эбола (см. ниже). В настоящее время вирусы выделяют в новое семейство Filoviridae (нитевые вирусы).
Эпидемиология. Первичные вспышки заболевания охватили около 30 человек в Марбурге и Франкфурте (Германия) и Белграде (Югославия) и эпидемиологически были связаны с обезьянами, завезенными из одного источника в Уганде. Вирус был выделен из крови и тканей этих обезьян. Из 25 первично зараженных больных 7 человек умерли. Затем возникли еще 6 случаев вторичного заражения: у двух врачей, одной медсестры, работника морга и жены ветеринарного врача. Была заподозрена возможность распространения инфекции от человека к человеку при случайных уколах иглой или порезах, хотя нельзя было исключить респираторного и конъюнктивального пути передачи вируса. Болезнь вызванная вирусом Марбург, развилась у жены одного из пациентов. Вирус Марбург был обнаружен в семенной жидкости этого пациента, несмотря на наличие циркулирующих антител. Считается, что вторичное заболевание в данном случае было приобретено в результате полового контакта. Естественный резервуар вируса Марбург неизвестен. Серологические исследования, выполненные среди большого числа приматов в Уганде, показали, что обезьяны, видимо, являются восприимчивыми, но случайными хозяевами.
Патология. Вирус Марбург является, видимо, пантропным, так как изменения находят во всех органах, включая лимфоидную ткань, печень, селезенку, поджелудочную железу, надпочечники, щитовидную железу, почки, яички, кожу и мозг. В лимфоидной ткани обнаруживают очаги некроза с дегенерацией. В печени были выявлены эозинофильные цитоплазменные тельца, напоминающие тельца Каунсилмена при желтой лихорадке. В легких может развиваться интерстициальный пневмонит, а в мелких артериолах — эндартериит. Нейропатологические изменения включают множественные мелкие геморрагические инфаркты с пролиферацией глии.
Клинические проявления. После инкубационного периода длительностью 3—9 дней у пациентов внезапно развиваются головные боли в лобной и височной областях, недомогание, миалгии в области поясницы, тошнота и рвота. Температура тела повышается до 39,4—40°С. Приблизительно у 50% больных развивается конъюнктивит. Через 1—23 дня после начала заболевания развиваются водянистая диарея, часто очень тяжелая, летаргия и изменения сознания. В течение 1-й недели заболевания на мягком небе и миндалинах появляются энантемы, развивается шейная лимфаденопатия. Наиболее достоверным клиническим признаком служит макулопапулезная сыпь без зуда, появляющаяся на 5—7-й день заболевания на лице и шее и эфферентно распространяющаяся на конечности. Через 4—5 дней пораженная кожа на ладонях и подошвах начинает слущиваться. Обычно между 5-м и 7-м днем заболевания развиваются геморрагические осложнения, включая желудочно-кишечное, почечное, вагинальное и/или конъюнктивальное кровотечения.
На 1-й неделе заболевания температура тела остается в пределах 40°С, постепенно понижается на 2-й неделе, а затем вновь повышается между 12-м и 14-м днем заболевания. На 2-й неделе заболевания развиваются спленомегалия, гепатомегалия, отек лица, покраснение мошонки или губ, а также орхит, способный привести к атрофии яичек, миокардит, сопровождающийся аритмичным пульсом и электрокардиографическими изменениями, панкреатит. Общая смертность составляет около 25%; смерть наступает обычно на 8—16-й день заболевания. Выздоровление обычно затягивается на 3—4 нед. Во время этого периода отмечаются облысение, периодические боли в области живота, ухудшение аппетита и длительные психотические расстройства. К поздним осложнениям относят поперечный миелит и увеит. Вирус Марбург можно выделить из передней камеры глаза и семенной жидкости в течение 3 мес после начала заболевания.
Лабораторные исследования. Уже в 1-й день заболевания обнаруживаются лейкопения со снижением числа лейкоцитов до 1- 10’Ул, нарушения функции гранулоцитов, а на 4-й день развивается нейтрофилия. Затем могут появиться атипичные лимфоциты, а также нейтрофилы, характерные для аномалии Пельгера—Хюэта. На ранних стадиях появляется тромбоцитопения, достигающая своего пика (менее 10•109/л) между 6-м и 12-м днем заболевания. В случае смерти больного можно обнаружить признаки диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Развиваются гипопротеинемия, протеинурия и азотемия; наблюдается повышение уровней глутаматоксалоацетаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке. Результаты люмбальной пункции не выявляют нарушений, или же отмечается небольшой плеоцитоз. Скорость оседания эритроцитов невелика.
Диагностика. Основой диагностики служат характерное клиническое течение заболевания и эпидемиологические признаки. Специфическая диагностика требует выделения вируса или получение серологических доказательств инфекции в парных пробах сыворотки. Вирусемия совпадает с фебрильной фазой заболевания; вирус может быть выделен из тканей, а также мочи, семенной жидкости, смывов глотки и прямой кишки. Попытки изолировать вирус следует предпринимать только в условиях специализированных лабораторий, в соответствии с правилами техники безопасности. Больные должны находиться в строгой изоляции; препараты следует исследовать и транспортировать в соответствии с указаниями ВОЗ.
Лечение. Специфического лечения не существует. Четырем больным вводили сыворотку реконвалесцентов, что привело к уменьшению тяжести течения заболевания. Однако такое же благоприятное течение наблюдали и у больных, не получивших сыворотки.
В период с июля по ноябрь 1976 г. была зарегистрирована вспышка острого фебрильного геморрагического заболевания, возникшая одновременно в Южном Судане и Северном Заире. Были отмечены случаи вторичного и третичного распространения инфекции, особенно у персонала госпиталя. Сообщали о 300 случаях со 151 летальным исходом в Судане и 237 случаях с 211 летальными исходами в Заире. Вирус, изолированный у этих больных, был морфологически сходен с вирусом Марбург, но по антигенному составу отличался от него. Вирус был назван вирус Эбола по названию реки в Заире, около которой вспыхнула эпидемия. В основе различной смертности при эпидемиях в Заире и Судане лежат биологические и антигенные различия между штаммами вируса Эбола, выделенными в этих странах. Возникали также спорадические случаи заболевания. А при серологических обследованиях в эндемичных областях обнаружено, что частота встречаемости антител к вирусу Эбола у населения составляет 7%. Как и при других геморрагических лихорадках, заболевание характеризуется нейтрофильным лейкоцитозом, гипофибриногенемией, тромбоцитопенией, микроангиопатией и гемолитической анемией.
Вирус Эбола размножается в культурах ткани (клетки Веро), а также у новорожденных мышей и морских свинок. Источник вспышки как в Судане, так и в Заире неизвестен. Однако, как и при других вирусных геморрагических лихорадках, резервуаром инфекций считаются грызуны, обитающие вокруг жилья человека. Серологические признаки болезни, вызванной вирусом Эбола, были обнаружены у домашней морской свинки, пойманной в Заире. Как уже отмечалось, может иметь место нозокомиальный и внутрипопуляционный путь распространения инфекции, особенно среди людей, находящихся долгое время в тесном контакте. Возможно, что определенную роль в передаче инфекции играло использование инъекционных игл, подвергнутых дезинфекции, а не стерилизации. Использование защитных приспособлений и строгая изоляция позволяют снизить число нозокомиальных случаев заболевания.
Клинические проявления. Клинически заболевание сходно с болезнью, вызванной вирусом Марбург. Инкубационный период варьирует от 4 до 6 дней (в среднем 7 дней). Пациент обращается к врачу обычно на 5-й день заболевания с жалобами на внезапные головные боли, недомогание, миалгии, выраженную лихорадку, диарею, боли в области живота. У больных отмечают признаки дегидратации, летаргии, плевральные боли, сухой, отрывистый кашель и длительный фарингит. Между 5-м и 7-м днем заболевания появляется макулопапулезная сыпь. У лиц негроидной расы сыпь часто имеет бледную окраску и не диагностируется до тех пор, пока не начнется шелушение кожи. Часто возникают кровавая рвота, мелена, кровотечение из носа, десен, влагалища. У беременных частым осложнением являются выкидыш, метроррагия. Смерть обычно наступает на 2-й неделе заболевания на фоне тяжелой кровопотери и шока.
Лечение. Больные должны находиться в изоляции до тех пор, пока вирусологические исследования не покажут отсутствие у них вируса (обычно через 21 день после начала заболевания). В Судане в крови лиц, страдающих болезнью, вызванной вирусом Эбола, находили также возбудителей малярии, что свидетельствовало о возможности сосуществования паразитемии и вирусемии. Использование плазмы, содержащей специфические антитела к вирусу Эбола, приводит к снижению уровня вирусемии. Однако для подтверждения эффективности этой формы терапии требуются дальнейшие исследования. Запросы о проведении выделения вируса и получении плазмы реконвалесцентов следует направлять в регионарные центры ВОЗ в Атланте или Женеве.
Вирус Мокола впервые был изолирован у дикой землеройки, пойманной в Нигерии. Затем была установлена его морфологическая и серологическая связь с вирусом бешенства. Однако ни в одном из двух случаев заболевания человека (в обоих случаях дети) не наблюдали классических клинических признаков бешенства. У одного пациента заболевание (закончившееся выздоровлением) характеризовалось лихорадкой, фарингитом и судорогами. Вирус Мокола был выделен из спинномозговой жидкости. У второго пациента первыми признаками заболевания были лихорадка, кашель, рвота, затем в течение нескольких дней отмечали сонливость, нарушение сознания и генерализованную вялую мы шечную слабость. Изменения состава спинномозговой жидкости не выявляли. Заболевание прогрессировало до глубокой комы, и смерть наступила через 10 дней после его начала. Вирус был выделен из мозга пациента. При гистопатологических исследованиях обнаружили небольшие гранулярные цитоплазматические включения в нейронах, отличные от телец Бабеша—Негри.
Вирус везикулярного стоматита
Везикулярный стоматит представляет собой вирусную болезнь животных, иногда поражающую и человека и проявляющуюся как острая самокупирующаяся гриппоподобная инфекция. Болеют животные в США и Южной Америке. Главным образом поражаются домашний скот, лошади, свиньи, дикие олени, еноты, скунсы и рысь.
У животных везикулярный стоматит характеризуется появлением везикул на слизистой оболочке ротовой полости, языке, вымени и пятках. Распространение инфекции происходит, видимо, при непосредственном контакте. Эпидемии чаще возникают в теплое время года. То, что вирус был выделен у песчаной мухи Phlebotumus (Панама) и у представителей вида Aedes (штат Нью-Мексико), указывает на возможные пути его передачи. Было идентифицировано два различных серотипа: Нью-Джерси и Индиана. Большинство вспышек в Северной Америке были связаны со штаммом Нью-Джерси. Заболевание чаще всего встречается у работников лабораторий. Сообщалось, что у 75% лабораторного персонала, контактировавшего с экспериментально зараженными животными или с вирусом, продуцируются нейтрализующие антитела. В естественных условиях заболевание распространено среди лиц, контактирующих с инфицированными животными, особенно рогатым скотом. Инкубационный период длится от 1 до 6 дней. Затем температура тела внезапно повышается до 40°С, появляются озноб, профузная потливость, миалгии, головная боль и боль при движении глаз. Около 30% пациентов предъявляют жалобы на боль в горле и увеличение шейных и/или подчелюстных лимфатических узлов. На слизистой оболочке ротовой полости появляется везикулярная сыпь. Приблизительно в 20% случаев наблюдаются конъюнктивит и острый ринит. Иногда небольшие везикулы могут появиться на пальцах рук в субкорнеальном и интраэпителиальном слоях, что обычно связано с прямой инокуляцией вируса. Симптомы обычно сохраняются в течение 3—4 дней, но может быть и двухфазное течение заболевания. Инфекция протекает бессимптомно. У работников лабораторий могут присутствовать только серологические признаки заболевания. Клинические же признаки могут отмечаться лишь у 50% из них. В некоторых областях Панамы у 17—35% населения выявляются нейтрализующие антитела к вирусу везикулярного стоматита.
Заболевание следует дифференцировать от вирусной пузырчатки полости рта и конечностей, герпангины, первичного герпетического фарингита и других сли-зисто-кожных синдромов, гриппа. Выделить вирус у больного удается не всегда. Однако повышение уровней комплементсвязывающих или нейтрализующих антител к вирусу везикулярного стоматита в пробах сыворотки крови, взятой в остром и реконвалесцентном периодах, позволяет подтвердить диагноз. Лечение неспецифическое.
источник
Статус ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)
ФГБУ «ВНИИЗЖ» с 2000 года является диагностическим центром РФ по бешенству (Приказ № 32 Департамента ветеринарии МСХ РФ от 19.10.2000 г.). В 2009 г ФГБУ «ВНИИЗЖ» успешно прошел квалификационный тест Французского управления по безопасности пищевых продуктов (AFSSA) в Нанси, Франция и с 2010 г. имеет международную аккредитацию на право определения антител к вирусу бешенства. Ссылка на международную аккредитацию ФГБУ «ВНИИЗЖ» находится на сайте Евросоюза по адресу http://ec.europa.eu/food/animal/liveanimals/pets/approval_en.htm#russia
Сведения для владельцев животных
Для разных стран могут быть разные условия ввоза животных, которые могут меняться, поэтому владельцам необходимо самим выяснять условия ввоза животных в страну на тематических ресурсах.
Метод исследования, сроки исполнения анализа
Титр антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотке крови животного определяют в реакции нейтрализации на культуре клеток.
Длительность анализа c оформлением результатов исследования составляет 10 рабочих дней с момента получения подтверждения оплаты исследований.
Требования, предъявляемые к сывороткам крови животных
Для определения антител к вирусу бешенства у животных используют только сыворотку крови. Кровь берут в лицензированной ветеринарной клинике / лаборатории / СББЖ не ранее чем через 30 дней после последней антирабической вакцинации.
Для получения сыворотки крови проводят забор венозной крови при помощи инъекционной иглы в сухую чистую пластиковую пробирку в объеме не менее 2 мл. Антикоагулянты не добавлять! После забора крови ее выдерживают при 37°С в течение 30 минут для формирования сгустка крови. Далее осторожно отделяют сформировавшийся сгусток крови от стенок и помещают пробирку на 4°С на 30-60 минут. После этого пробу центрифугируют при 189 – 335 g (1500 – 2000 оборотов в минуту). По окончании центрифугирования осторожно, не захватывая осадок, отбирают надосадочную жидкость – сыворотку крови. Сыворотка крови должна быть прозрачная, с цветом от светлого до соломенно-желтого. Допускается легкая степень гемолиза (розоватый цвет). Необходимый объем сыворотки крови для исследования составляет 1,0 мл.
Не принимаются к исследованию цельная кровь или образцы с примесью форменных элементов крови, сыворотки крови с сильным гемолизом (темно-красного цвета), с осадком, мутные, с гнилостным запахом.
Пробирка для сыворотки крови должна быть пластиковая, герметично закрытая, крышка дополнительно герметизирована (парафильм, скотч) промаркирована устойчивым маркером и опечатана печатью ветеринарного учреждения, в котором проводили забор крови на исследование.
Правила транспортировки образцов сыворотки крови
В зависимости от длительности транспортировки пробы необходимо направлять в замороженном либо охлажденном состоянии в термоконтейнере. Пробирку с сывороткой максимально обезопасить от проливания образца или попадания в него влаги. Для примера: использовать 2 пакета со льдом, первый положить на дно контейнера, затем положить сыворотку в пластиковой, герметично закрытой, промаркированной пробирке и завернутую в целофановый пакет, второй пакет со льдом положить сверху. К контейнеру приложить (прикрепить, например скотчем) пакет документов. Все это упаковать в тару (пакет).
До отправки в ФГБУ «ВНИИЗЖ» сыворотку крови хранят при 4°С не более 2 дней. Если сыворотку крови необходимо хранить более длительный срок, то ее помещают при минус 20°С. Замороженную сыворотку крови для отправки в ФГБУ «ВНИИЗЖ» упаковывают, как описано выше. Не допускается замораживание и оттаивание сыворотки крови более 2 раз. Если отбирают пробы от нескольких животных, принадлежащих одному владельцу, то каждую пробу (пробирку) необходимо маркировать. Посылку нужно отправить на адрес ФГБУ «ВНИИЗЖ», дополнительно указать «Пункт приема патологических материалов».
Если Вы сами не можете привезти пробу, то ее можно доставить в ФГБУ «ВНИИЗЖ» любой экспресс-почтой, которая пересылает биологический материал, по России, например, SPSR, Pony-express, Major-express, Dimex, DHL (компания работает только с юридическими лицами) и т.п. Правила упаковки пробы такие же.
Контакты, адрес, схема проезда для доставки сыворотки курьерской службой здесь: http://www.arriah.ru/main/about/contacts
Сопроводительное письмо в ФГБУ «ВНИИЗЖ»
Вместе с образцами сывороток крови направляют сопроводительное письмо (Приложение 1) для исследований на наличие антител к вирусу бешенства, заверенное подписью ветеринарного врача и печатью ветеринарной клиники, где проводился отбор образцов.
К сопроводительному письму необходимо приложить:
1. копию ветеринарного паспорта животного (страница с данными о животном и владельце, страница с последней вакцинацией против бешенства), заверенную подписью ветврача и печатью ветеринарной клиники;
2. копию российского паспорта владельца для выписывания счета на оплату (данные о владельце, адрес проживания, электронный адрес);
3. копию заграничного паспорта владельца для оформления документов на вывоз.
Если в ветеринарном паспорте в графе «владелец» написан один человек, а вывозить будет другой человек, то от владельца нужна доверенность на имя того человека, который будет вывозить животное. Доверенность нужна на границе, в ветеринарном пункте. Правила ее оформления, пожалуйста, уточняйте в посольстве той страны, в которую Вы вывозите животное. Для постановки анализа данная доверенность не нужна.
В ряде случаев у молодых и старых животных, если они прививались впервые, может оказаться, что уровень антител ниже требуемой нормы в 0,5 международных единиц/мл. Это может быть обусловлено индивидуальными, породными особенностями животного, его физиологическим состоянием на момент вакцинации, качеством вакцины. В этом случае, мы рекомендуем пройти повторную вакцинацию и провести повторный анализ. Поэтому планируйте проведение анализа не накануне вылета.
Прием материала для исследования
Сыворотку крови для исследования на антитела к вирусу бешенства передают в «Пункт приема патологических материалов» ФГБУ «ВНИИЗЖ». Время работы пункта с 8:00 до 15:30. Необходимо заключить договор на проведение исследования в коммерческом отделе ФГБУ «ВНИИЗЖ» (отдел реализации). Результаты Вам могут быть отправлены «Почтой России» или курьерской службой.
Получить консультацию по вопросам проведения исследования на антитела к вирусу бешенства можно в лаборатории бешенства и BSE по телефону 8 (4922) 26-19-88, 26-15-12, 26-17-65, добавочный 23-33, Чернышова Елена Владимировна, либо по эл. почте chernishova@arriah.ru. Всю необходимую информацию для заключения договора, получения счета и результата можно уточнить в отделе реализации по телефонам: (4922) 26-15-51, 26-15-25, Рябова Юлия, либо по эл. почте ryabova@arriah.ru .
в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
референтную лабораторию по бешенству и BSE
600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец
Направляется сыворотка крови для исследования на наличие антител к вирусу бешенства от:
пол________________________, дата рождения_________________________,
индивидуальный идентификационный номер (чип)_______________________
последняя дата вакцинации против бешенства «____» «___________» 20___г.
серия и номер______________________________________________________
дата взятия крови для анализа ________________________________________
ФИО владельца ____________________________________________________
Адрес, индекс владельца_____________________________________________
Телефон, E-mail владельца___________________________________________
Прилагаются следующие документы: 1. копия рос. паспорта владельца (стр. 2-3, 5-6);
2. копия загран. паспорта владельца (стр. с фотографией); 3. копия паспорта животного.
ФИО владельца ____________________________________________________
ФИО вет. врача ____________________________________________________
«____» «__________» 20____г. М.П.
название организации (вет. клиника / лаборатория / СББЖ), адрес, телефон
источник
Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.
Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.
Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.
Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.
Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.
Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.
Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.
Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.
Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.
Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:
а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.
Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.
Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.
Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов
Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.
Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).
Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.
В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.
Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.
При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.
Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).
Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.
Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.
Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.
Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.
Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.
Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.
Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.
ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.
Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.
Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.
В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.
Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.
Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).
Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».
Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.
Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.
По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.
Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).
Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).
источник