Размножение вируса бешенства в организме куриного эмбриона было осуществлено в конце 30-х годов (Bernkopf, Kligler). М. А. Селимов и Е. В. Семенова культивировали штаммы фиксированного вируса бешенства после предварительной адаптации путем заражения куриных зародышей в мозг. Адаптированные штаммы успешно размножались при заражении куриных эмбрионов в желток.
Заражая куриный зародыш в желток, а в последующих пассажах используя в качестве источника вируса кожио-мышечную ткань, Koprowski, Сох вывели висцеротропный «авианизированный» вирус (штамм Flury). Первоначально он был выделен из мозга девочки по фамилии Flury путем интрацеребрального заражения однодневного цыпленка и пассирован на цыплятах 138 раз (Johnson, Leach). После 40—50 желточных пассажей через развивающийся куриный эмбрион штамм Flury оказался апатогениым для кроликов и собак при подкожном или внутримышечном введении, но сохранил патогенность для сирийских хомяков, морских свинок, мышей и кошек.
Этот вариант вируса, обозначенный как Flury LEP (Low embryon passages), был широко использован для производства живой яичной антирабической вакцины, сыгравшей большую роль в профилактической иммунизации собак. После 180 желточных пассажей он оказался апатогениым для взрослых мышей при интрацсребральном введении, но сохранил патогенную активность для новорожденных мышей.
Некоторые штаммы фиксированного вируса бешенства были адаптированы к организму утиного эмбриона (Powell, Culbertson) или однодневного оплодотворенного куриного яйца (Yoshino е. а.). Адаптация фиксированного вируса бешенства к организму утиного зародыша привела к внедрению в практику инактивированной утиной антирабической вакцины. Эта вакцина для лечебной иммунизации людей широко применяется в США.
Размножение вируса бешенства в культуре клеток. Необходимо различать периоды плазменных культур, переживающих тканей и однослойных клеточных структур. Первые плазменные культуры представляли собой кусочки спииальных ганглиев в плазме крови обезьян, зараженных фиксированным вирусом (Levaditi). В этих опытах в течение 6 пассажей наблюдалось переживание или слабое размножение вируса. Stoel в стационарной плазменной культуре из кусочков мозга куриного зародыша в плазме крови кролика сделал 15 серийных пассажей и в плазменной культуре из кусочков сердца — один пассаж фиксированного вируса, Bequignon с соавт. наблюдали накопление фиксированного вируса до 102 в плазменной культуре из кусочков мозга эмбриона мыши.
Vieuchange, пользуясь методикой диализных пробирок в плазменной культуре, содержащей кусочки мозга эмбриона мыши, добился длительного размножения штаммов уличного и фиксированного вируса (до 80 и 102 дней соответственно). Askel, Aykau отметили сохранение уличного вируса бешенства до 30 дней в плазменной культуре роговицы кролика, помещенной в плазму цыпленка с раствором Тироде и сывороткой лошади. Fernandes, Pomerat во вращающейся плазменной культуре из кусочков аммонова рога и мозжечка новорожденных щенят и котят провели 4 пассажа фиксированного вируса. Авторы отметили накопление вируса до 103-3,2, деструкцию нервных клеток и образование в них телец Негри.
В конце 30-х годов появились сообщения о размножении вируса бешенства в переживающих тканях. Webster, Clow, Kanazawa, Parker, Hollender сообщили о размножении вируса бешенства в течение длительных пассажей в культуре переживающих тканей из мозга эмбрионов мыши, кролика, куриного эмбриона, содержащей раствор Тироде и 10—25% гретой сыворотки обезьяны или кролика. Plotz, Reagen, Nomura с соавт. поддерживали штаммы уличного и фиксированного вируса в течение 9 пассажей в культуре переживающей кожно-мышечной ткани куриного эмбриона в растворе Тироде с 10% сывороткой обезьяны и куриной плазмы.
В культуре переживающих тканей наблюдалось более активное размножение вируса бешенства, чем в плазменных культурах. Указанная методика казалась перспективной для получения больших объемов вируссодержащей жидкости. Однако экспериментальные серии культуральной антирабической вакцины имели низкие показатели иммуногенной активности в сравнении с мозговыми вакцинами, в связи с чем культура переживающих тканей не нашла практического применения.
— Вернуться в оглавление раздела «вирусология»
источник
Репродукция вирусов семейства Rhabdoviridae происходит в цитоплазме клетки-хозяина. Рабдовирусы связываются с рецепторами клетки-хозяина при помощи гликопротеинов G суперкапсида и проникают в клетку путём эндоцитоза (1). Затем, после удаления суперкапсида, освободившийся рибонуклеопротеин (РНП) попадает в цитоплазму клетки (2). В цитоплазме клетки-хозяина с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы (3), синтезируется неполные (4) плюс – нити РНК (пять индивидуальных иРНК для синтеза вирусных белков) и полные (6) плюс – нити РНК, являющиеся матрицей для синтеза геномной РНК (7). Во время трансляции иРНК рибосомами (5) клетки-хозяина синтезируются вирусные белки. Гликопротеин G гликолизируется в эндоплазматическом ретикулуме, а затем окончательно преобразуется в комплексе Гольджи и включается в плазмолемму клетки-хозяина (8). Матриксный белок (М-белок) сразу после синтеза встраивается в плазмалемму с внутренней цитоплазматической стороны билипидного слоя. Включение матриксного белка М в плазмалемму является сигналом к формированию вириона. Рибонуклеопротеин образуется при взаимодействии геномной минус-РНК и белками N, NS и L (дизъюнктивний тип репродукции вируса). После «сборки» вирионы выходят из клетки-хозяина путем почкования (9).
Вирус везикулярного стоматита по особенностям внутриклеточной репродукции очень сходен с вирусом бешенства. Важной особенностью этих вирусов является выраженное угнетение процессов биосинтеза белка в клетке-хозяине за счет блокирования инициации трансляции.
Эти вирусы хорошо размножаются в куриных эмбрионах, в клетках почек новорожденных хомячков и в культурах диплоидных клеток человека.
Таксономия.Вирус бешенства[3] относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus (от греч. lyssa — гидрофобия). Кроме вируса бешенства, к роду Lyssavirus относится еще 5 вирусов (Lagos, Moсola, Duvenhage, Kotonkan, Obodhiang), выделенных от летучих мышей и комаров в Африке и вызывают заболевания у собак, котов, сельскохозяйственных животных, но без клинической картины бешенства. Вирус Moсola, передающийся человеку от больных котов, может быть у человека причиной смертельного паралитического заболевания.
Структура вириона.Возбудителю бешенства (от греч. rhabdos —палка, прутик) характерна палочковидная или пулевидная форма вириона: с одним плоским и другим закругленным концом. Размеры вирионов составляют 80-180 нм.
Вирус состоит из сердцевины (рибонуклеопротеина — РНП со спиральным типом симметрии и матриксного белка) и суперкапсида. Гликопротеин G отвечает за адсорбцию и проникновение вируса в чувствительную клетку, характеризуется антигенными (является типоспецифическим антигеном) и иммуногенными свойствами. Геном вируса образован линейной нефрагментированной минус-РНК (молекулярная масса 4,4×10 6 Да) и РНК-зависимой полимеразой (транскриптазой – белками L и NS). Капсид образует белок N. Соответственно, рибонуклеопротеин (РНП) содержит 4 % РНК и 96 % протеинов, является инфекционным. РНП характерны антигенные свойства – это группоспецифический антиген.
Вирус бешенстваимеет широкий круг хозяев. Чувствительны к нему человек и все теплокровные животные. Степень патогенности разных штаммов вирусов бешенства для различных животных не одинакова. Например, у некоторых видов летучих мышей (вампиров) вирус бешенства адаптировался только к слюнным железам, не вызывая каких-либо признаков заболевания. У других же видов животных при заражении всегда наблюдается летальный исход.
Штаммы вирусов бешенства, циркулирующие в природе у животных, называются «уличными». Они вызывают заболевания с довольно длительным инкубационным периодом и обычно образуют специфические тельца Бабеша-Негри – включения в цитоплазме клеток. У зараженных животных может наблюдаться длительный период возбуждения и агрессивности. Вирус может проникать в слюнные железы и ЦНС. Последовательные пассажи в мозге кроликов приводят к образованию «фиксированного вируса», не способного в дальнейшем репродуцироваться в каких-либо клетках, кроме нервных. Фиксированный вирус репродуцируется быстро, инкубационный период короткий (обычно 7 дней), цитоплазматические включения в клетках обнаруживаются редко. Этот вирус патогенен только для кроликов.
Вирус бешенства мало устойчив во внешней среде, быстро инактивируется при действии на него ультрафиолетовых лучей или солнечного света. При кипячении он погибает через 2 мин, при 60 °С – через 5 мин. Быстро инактивируется растворами лизола, хлорамина, фенола, жирорастворителями и трипсином. В трупах животных, особенно при сравнительно низких температурах, сохраняется до 4 месяцев.
Эпидемиология.Бешенство – типичный зооантропоноз. Основным источником и резервуаром вируса являются дикие и домашние плотоядные животные: собаки, кошки, волки, шакалы, лисицы, скунсы, мангусты, летучие мыши (вампиры).
С эпидемиологической точкизрения различают естественный тип вируса, очаги которого формируются за счет диких животных, антропургический – очаги поддерживаются домашними животными и смешанного типа (естественно-антрипургический). В очагах естественно-антрипургического типа происходит циркуляция вируса между дикими и домашними животными.
Заболевание обычно передается через укус или при ослюнении поврежденной кожи или слизистой оболочки, так как вирус размножается в слюнных железах животного. Больное животное заразно не только во время болезни, но и в инкубационном периоде за 2-3 дня, иногда больше, до появления первых признаков заболевания.
Патогенез и клиника.Первичная репродукция вируса бешенства происходит в соединительной и мышечной тканях вблизи входных ворот. Затем возбудитель внедряется в рецепторы периферических чувствительных нервов и по эндоневрию шванновских клеток или по периневральным пространствам попадает в ЦНС. Там вирус репродуцируется в нейронах гиппокампа, продолговатого мозга, черепных нервов, симпатических ганглиев. В результате этого возникают воспалительные, дистрофические и некротические изменения нервной системы. В этот период вирус также репродуцируется в клетках слюнных желез.
Наиболее короткий инкубационный период бывает при укусе головы и кистей рук, более длительный – при укусе нижних конечностей; в целом варьирует от 8 до 90 дней. В развитии заболевания выделяют три стадии: предвестников (депрессии), возбуждения, параличей. Сначала появляются беспокойство, страх, тревога, неприятные ощущения в области укуса. Через 1-3 дня наступают выраженное возбуждение, судороги дыхательной и глотательной мускулатуры, появляетсявыраженная водобоязнь (гидрофобия). В этот период характерны агрессивность, слуховые и зрительные галлюцинации. Далее развиваются параличи, и через 5-7 дней от начала болезни наступает смерть от паралича сердечного или дыхательного центров.
Иммунитет.Так как заболевание бешенством заканчивается смертью, то постинфекционным иммунитет не изучен. Установлено, что антитела могут образовываться во время заболевания и после вакцинации. Поствакцинальный иммунитет сохраняется до 1 года.
Лабораторная диагностикапроводится с использованием вирусоскопического, вирусологического, биологического, серологического методов и экспресс-метода. У погибших животных и людей в гистологических срезах или мазках-отпечатках исследуют мозговую ткань (кору больших полушарий и мозжечка, аммонов рог, продолговатый мозг), а также ткань слюнных желез.
В пирамидальных клетках мозговой ткани обнаруживают специфические эозинофильные включения (тельца Бáбеша-Нéгри), располагающиеся в цитоплазме около ядра и являющиеся скоплениями вирусных нуклеокапсидов. Их появление обусловлено затрудненным созреванием вирионов в нервных клетках. Тельца Бабеша-Негри выявляют специальными методами окраски (по Романовскому-Гимзе, Манну, Туревичу, Муромцеву и др.). Они имеют характерную зернистую структуру с базофильными гранулами на ацидофильном фоне, размер их – 4-10 мкм. Недостатком метода является то, что воспользоваться им можно только после смерти человека или животного.
Вирусный антиген может быть обнаружен в тех же препаратах с помощью прямой или непрямой реакции иммунофлуоресценции.
Выделить вирус бешенства удается из слюны больных людей или животных, а также из свежего секционного материала (мозговая ткань, ткань подчелюстных слюнных желез) путем внутримозгового заражения белых мышей и кроликов или хомячков – внутримышечно. У животных развиваются параличи с последующей гибелью. Мозг погибшего животного должен быть исследован для обнаружения телец Бабеша-Негри или вирусного антигена с помощью реакции иммунофлуоресценции.
Антитела к вирусу бешенства могут быть выявлены у вакцинированных лиц с помощью реакций нейтрализации, связывания комплемента, иммунофлуоресценции, а также иммуносорбентных реакций (РИА и ИФА).
Дата добавления: 2014-10-31 ; Просмотров: 1579 ; Нарушение авторских прав? ;
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
источник
Возбудитель бешенства относится к семейству Rhabdoviridae (рабдовирусы).
Семейство это включает вирусы бешенства, везикулярного стоматита и другие вирусы, вызывающие заболевания у животных и насекомых.
На протяжении тысячелетий все человечество страдало от этой страшной болезни — бешенства. Упоминание об этом заболевании встречается в «Илиаде» Гомера, трудах Аристотеля и Авиценны. В I веке до н. э. римский ученый Цельсий предложил выжигать укушенные места каленым железом. Это болезненное мероприятие спасало только в том случае, если рана была невелика и прижигание производилось немедленно после укуса. Можно рассказывать еще о многих средствах, но все они оказывались малоэффективными.
Впервые бешенство изучил Л. Пастер в 1880 г.
В 1886 г. группа одесских врачей на свои средства командировала Н. Ф. Гамалея к Пастеру в Париж для ознакомления с методом приготовления вакцины против бешенства. После его возвращения в Одессе была открыта лаборатория, где изготовлялась антирабическая вакцина.
Морфологическая структура. Возбудитель бешенства имеет палочковидную (пулевидную) форму, один конец которой плоский, другой — вытянутый. Размер 80-180 нм. Вирион содержит однонитчатую РНК, окруженную капсидом. Снаружи капсид покрыт оболочкой, в состав которой входят гликопретеиды и гликолипиды. В оболочке имеются шиловидные образования (пепломеры).
В цитоплазме пораженных вирусом клеток образуются специфические включения, описанные Бабешем (1892) и Негри (1903). Поэтому их называют тельцами Бабеша — Негри. Величина этих телец от 3-4 до 20 мкм. Они разной формы, чаще сферической, но бывают овальной и многоугольной. Кислые красители окрашивают их в рубиново-красный цвет.
Тельца Бабеша — Негри располагаются в цитоплазме нервных клеток головного мозга. Обнаружение телец Бабеша — Негри имеет диагностическое значение.
Культивирование. Вирус бешенства культивируется в мозговой ткани мышей, цыплят, кроликов, в куриных эмбрионах, эмбрионах телят, овец и культурах клеток разного вида животных.
Антигенная структура. Вирусы бешенства не имеют антигенных разновидностей. Существуют два вируса бешенства: дикий, циркулирующий среди животных, вирулентный и для человека, названный уличным вирусом. Другой вирус бешенства получил Л. Пастер в лабораторных условиях путем последовательных, длительных пассажей (133 раза) уличного вируса через мозг кролика. При этом сократилась продолжительность инкубационного периода при заражении кролика с 21 до 7 дней. Дальнейшие пассажи уже не меняли время инкубации, оно зафиксировалось на 7 днях, и вирус был назван фиксированным (virus fixe). В процессе пассажей вирус адаптировался к мозгу кролика и потерял способность вызывать заболевания у человека, собак и других животных. Однако свои антигенные свойства он полностью сохранил, поэтому его используют для приготовления антирабической (против бешенства) вакцины.
Восприимчивость животных. Бешенством болеют многие животные, домашние и дикие, даже птицы. Однако чаще заболевают собаки, волки, лисицы, летучие мыши. Летучие мыши болеют без выраженных признаков заболевания и, возможно, являются хранителями вируса бешенства в природе.
Источники инфекции. Больные животные.
Пути передачи. Вирус бешенства передается прямым контактным путем от больных животных (укусы) либо при попадании слюны больного животного на поврежденную поверхность кожи или слизистых оболочек.
Патогенез. От момента укуса или ослюнения до заболевания человека проходит от 15-45 дней до 3-6 мес (описаны случаи инкубации свыше года).
Длительность инкубации зависит от ворот инфекции, характера повреждения ткани.
Наиболее короткий период инкубации при укусах в лицо и голову.
Из места внедрения вирусы распространяются по нервным стволам и попадают в клетки центральной нервной системы. Наибольшее количество вируса концентрируется в гиппокампе, продолговатом мозге, ядрах черепных нервов и в поясничной части спинного мозга. В нервных клетках вирус репродуцируется (размножается). В результате поражения нервной системы появляется повышенная рефлекторная возбудимость: судороги, особенно дыхательных и глотательных мышц. Возникает одышка и водобоязнь (гидрофобия). Одно представление о питье вызывает у больных сильные болезненные судороги. Смерть наступает через 4-5 дней. Летальность 100%.
Клиническая картина бешенства у собак: животное становится угрюмым, появляется слюнотечение. Собака начинает пожирать несъедобные вещи — камни, щепки и пр. Затем наступает период возбуждения. Собака бежит по прямой линии, низко наклонив голову. Нападает на встречающихся людей, животных без лая и кусает их. Период возбуждения сменяется параличами и гибелью животного.
Иммунитет. Постинфекционный иммунитет не достаточно изучен. Механизм иммунитета, возникающего после прививки, связан с вируснейтрализующини антителами, которые появляются через 2 нед после вакцинации, а также с интерференцией вакцинного и уличного вирусов. Феномен интерференции состоит в том, что фиксированный вирус значительно быстрее достигает клеток нервной системы, размножается в них и препятствует внедрению уличного вируса. Иммунитет сохраняется в течение 6 мес.
Профилактика. Уничтожение бешеных животных, бродячих собак. Регистрация собак и обязательная их вакцинация. В случае укуса немедленная обработка ран.
Специфическая профилактика. Введение антирабической вакцины, предложенной Пастером. Вакцина представляет собой взвесь мозговой ткани животного (кролика, мыши и др.), зараженного фиксированным вирусом бешенства. Имеются 2 типа вакцин: Ферми и Филлипса. Они отличаются между собой количеством и качеством консерванта. Вакцина Ферми содержит 1% фенол, Филлипса — глицерин.
В последнее время пользуются вакциной Флори. Это живая антирабическая вакцина, приготовленная из вирусов, культивированных в эмбрионах птиц. Принцип действия тот же (интерференция вирусов).
Вакцинации подлежат все укушенные или ослюненные больными или подозрительными в отношении бешенства животными. Противопоказаний нет, однако прививки не делают людям без достаточных показаний, так как даже фиксированный вирус может привести к осложнениям. Прививки делают как можно раньше, проводят их многократно. Вакцину вводят подкожно в область живота. Количество прививок назначает врач.
При укусах опасной локализации и для повышения эффективности вакцин применяют еще антирабический иммуноглобулин, который получают из сыворотки гипериммунизированных фиксированным вирусом лошадей. Иммуноглобулин обладает способностью нейтрализовать действие вируса. Кроме того, он предупреждает поствакцинальные осложнения (аллергический энцефаломиелит и др.).
В СССР и других странах мира проводят исследования, направленные на получение антирабической вакцины, не вызывающей осложнений.
Посмертная диагностика основана на: 1) обнаружении телец Бабеша — Негри в клетках мозга; 2) выявлении специфического антигена методом флюоресцирующих антител; 3) выделении вируса методом биопробы на лабораторных животных.
1. Тельца Бабеша — Негри могут быть обнаружены в окрашенных мазках и отпечатках из нефиксированной мозговой ткани и в гистологических срезах (даже в том случае, если мозг подвергается гниению). Для их обнаружения делают несколько препаратов (так как телец может быть мало). При окраске по Муромцеву цитоплазма нервных клеток голубого цвета, а тельца Бабеша — Негри — фиолетового с розовым оттенком и выраженной темно-фиолетовой зернистостью.
В клетках мозга больных бешенством животных тельца Бабеша — Негри обнаруживают чаще, чем в срезах, сделанных из слюнных желез.
2. Метод флюоресцирующих сывороток широкого практического применения пока не получил.
3. Метод биопробы на лабораторных животных проводится только в специальных лабораториях.
Работу, хранение и пересылку нефиксированного материала осуществляют по правилам, предусмотренным для работы с особо опасным инфекционным материалом (см. «Особо опасные инфекции»).
1. Какова форма и величина вируса бешенства?
2. Что такое тельца Бабеша — Негри?
4. Какова восприимчивость животных к вирусу бешенства?
5. Как передается вирус бешенства?
6. Какой вирус бешенства используется для приготовления вакцины (уличный или вирус fixe?)
7. На чем основана вирусологическая диагностика при подозрении на бешенство?
источник
3. Вирус бешенства. Структура вириона, культивирование, внутриклеточные включения, лабораторная диагностика, специфическая профилактика.
Таксономия: РНК-содержащий вирус, семейство Rhabdoviride, род Lyssavirus.
Морфология и антигенные свойства. Вирион имеет форму пули, состоит из сердцевины (РНП(рибонуклеопротеин) спирального типа и матриксного белка), окруженной липопротеиновой оболочкой с гликопротеиновыми шипами. Гликопротеин G отвечает за адсорбцию и внедрение вируса в клетку, обладает антигенными (типоспецифический антиген) и иммуногенными свойствами. Антитела к нему нейтрализуют вирус и выявляются в РН(рекция нейтрализации). РНП состоит из геномной однонитевой линейной минус-РНК и белков: N-белка, L-белка и NS-белка. РНП является группоспецифическим антигеном; выявляется в РСК, РИФ, РП.
Различают два вируса бешенства: дикий вирус, циркулирующий среди животных, патогенный для человека; фиксированный – не патогенный для человека.
Культивирование. Вирус культивируют путем внутримозгового заражения лабораторных животных (мышей, крыс) и в культуре клеток: фибробластов человека, куриного эмбриона. В нейронах головного мозга зараженных животных образуются цитоплазматические включения, содержащие антигены вируса (тела Бабеша-Негри – эозинофильные включения).
Резистентность: Вирус бешенства неустойчив: быстро погибает под действием солнечных и УФ-лучей, а также при нагревании до 60С. Чувствителен к дезинфицирующим веществам, жирорастворителям, щелочам и протеолитическим ферментам.
Эпидемиология. Источниками инфекции в природных очагах являются волки, грызуны. Вирус бешенства накапливается в слюнных железах больного животного и выделяется со слюной. Животное заразно в последние дни инкубационного периода (за 2—10 дней до клинических проявлений болезни). Механизм передачи возбудителя — контактный при укусах. Иногда заболевание развивается при употреблении мяса больных животных или при трансплантации инфицированных тканей (роговицы глаза).
У собаки после инкубационного периода (14дн.) появляются возбуждение, обильное слюнотечение, рвота, водобоязнь. Она грызет место укуса, бросается на людей, животных. Через 1—3 дня наступают паралич и смерть животного.
Патогенез и клиника. Вирус, попав со слюной больного животного в поврежденные наружные покровы, реплицируется и персистирует в месте внедрения. Затем возбудитель распространяется по аксонам периферических нервов, достигает клеток головного и спинного мозга, где размножается. Клетки претерпевают дистрофические, воспалительные и дегенеративные изменения. Размножившийся вирус попадает из мозга по центробежным нейронам в различные ткани, в том числе в слюнные железы. Инкубационный период у человека при бешенстве — от 10 дней до 3 месяцев. В начале заболевания появляются недомогание, страх, беспокойство, бессонница, затем развиваются рефлекторная возбудимость, спазматические сокращения мышц глотки и гортани.
Иммунитет: Человек относительно устойчив к бешенству. Постинфекционный иммунитет не изучен, так как больной обычно погибает. Введение людям, укушенным бешеным животным, инактивированной антирабической вакцины вызывает выработку антител, интерферонов и активацию клеточного иммунитета.
Микробиологическая диагностика: Постмортальная диагностика включает обнаружение телец Бабеша—Негри в мазках-отпечатках или срезах из ткани мозга, а также выделение вируса из мозга и подчелюстных слюнных желез. Тельца Бабеша—Негри выявляют методами окраски по Романовскому—Гимзе. Вирусные антигены в клетках обнаруживают с помощью РИФ.
Выделяют вирус из патологического материала путем биопробы на мышах: заражают интрацеребрально. Идентификацию вирусов проводят с помощью ИФА, а также в РН на мышах, используя для нейтрализации вируса антирабический иммуноглобулин.
Прижизненная диагностика основана на исследовании: отпечатков роговицы, биоптатов кожи с помощью РИФ; выделении вируса из слюны, цереброспинальной и слезной жидкости путем интрацеребрального инфицирования мышей. Возможно определение антител у больных с помощью РСК, ИФА.
Лечение. Симптоматическое; эффективное лечение отсутствует.
Профилактика. Выявление, уничтожение животных. Иммунизация антирабической вакциной собак. Специфическую профилактику проводят антирабической вакциной и антирабической сывороткой или иммуноглобулином. Инактивированная УФ- или гамма лучами культуральная вакцина. С лечебно–профилактической целью иммунизируют людей; формируется активный иммунитет.
источник
Бешенство — острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом.
Восприимчивы человек и все теплокровные животные. Бешенство регистрируется в разных странах мира.
Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. РНК-содержащий. Геном представлен единой односииралыюй линейной молекулой минус-РНК. Вирионы вируса состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки с гликопротеиновыми булавовидными выступами. Вирион пулеобразной формы, средний размер его 180-175 нм.
Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Низкие температуры консервируют вирус. Для него губительны высокие температуры (80—100 °С), в гниющем материале вирус может сохраняться до двух недель. Дезинфицирующие средства (растворы формальдегида, едкой щелочи, хлорной извести) в обычных концентрациях действуют на вирус губительно.
Антигенная структура. Вирионы вируса бешенства содержат гликопротеидный (наружный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих и антигемагглютинирующих антител и обеспечивает развитие иммунитета у животных, а нуклеокапсидный — комплементсвязывающих и преципитирующих антител.
Вирус бешенства имеет 4 серотипа (прототипы): вирус бешенства, Лагос, Мокола, Дювенхейдж. Эпизоотические штаммы вируса бешенства в иммунобиологическом отношении родственные, но различаются по вирулентности. Все выделенные штаммы вируса по вирулентности разделяют на 5 групп. Штаммы первой группы характеризуются высокой, а пятой группы — низкой вирулентностью.
Спектр патогенности вируса тесно связан с его экологией, которая имеет особенности. Так, необходимо различать два основных и независимых эпизоотических проявления лиссавирусной инфекции:
1) эпизоотии бешенства, поддерживаемые наземными животными (лисицы, волки, енотовидные собаки, шакалы, мангусты, скунсы, еноты-полоскуны и др.);
2) эпизоотии хироптерного происхождения, поддерживаемые вампирами, насекомоядными и плотоядными летучими мышами.
С 1960-х годов бешенство диких животных стало преобладающим. Основным резервуаром и источником инфекции оказались лисицы и другие дикие животные. Болезнь у них может протекать латентно, обеспечивая персистенцию вируса в естественных условиях. Бешенство собак при городских эпизоотиях, как правило, заканчивается их гибелью.
Антигенная активность. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют вируснейтрализующие, комплементсвязывающие, преципитирующие, антигемагглютинирующие и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом, в присутствии комплемента) антитела.
Вирус обладает гемагглютинирующими свойствами в отношении эритроцитов гусей, кур, морских свинок, овец, человека (группы 0). Обычно реакцию гемагглютинации ставят с эритроцитами гуся при 0—4 °С, pH 6,2—6,4. Между инфекционной и гемагглютинируюгцей активностью существует линейная зависимость.
Культивирование вируса. В лабораторных условиях вирус можно культивировать на лабораторных животных (мышатах, кроликах, хомячках, морских свинках и др.) при интрацеребральном методе сражения. Вирус репродуцируется в первичных и перевиваемых культурах клеток (почках сирийского хомячка, эмбрионах овец, телят, ВНК-21, клетках невриномы Гассерова узла крысы и др.). В первых пассажах вирус размножается медленно, не вызывая ЦПД. К вирусу бешенства после предварительной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы.
Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится на всех видах теплокровных животных.
Клинические признаки. Продолжительность инкубационного периода зависит от места укуса, характера раны, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, вида, возраста и резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от одной недели до года и даже дольше. Клиническое проявление болезни в основном одинаково у всех животных, но наиболее типично оно у собак, у которых можно наблюдать как буйное, так и тихое (паралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бешенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения может не быть.
Патологоанатомические изменения. Вскрывать подозрительных по заболеванию бешенством животных в полевых условиях запрещено.
У мясоядных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.
Локализация вируса. Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Проникая центростремительно с периферии (место укуса) по нервным стволам в центральную нервную систему, в организме он распространяется центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.
В организме вирус локализуется главным образом в центральной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне. Доказано нахождение вируса в некоторых внутренних органах. Из организма выделяется со слюной, через легкие, кишечник и с мочой.
Источник инфекции — больные животные. Они передают вирус во время укуса. Возможно заражение при ослюнении поврежденной кожи. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 1960-х годов основным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.
Диагностика. Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, имеющих решающее значение.
При работе с больными животными и инфекционным материалом необходимо строго соблюдать меры личной безопасности: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, резиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защитные очки, защитную маску на лицо.
Лабораторная диагностика. Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных — голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектицидами.
Патологический материал упаковывают в пластмассовые мешки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указывают отправителя и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрения в заболевании животного бешенством, дату и подпись врача, отправляют с нарочным.
Лабораторная диагностика включает: обнаружение вирусного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша—Негри и биопробу на белых мышатах.
РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуоресцирующий антирабический γ-глобулин.
На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок и продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 15—20 °С) от 4 до 12 ч, высушивают на воздухе, наносят специфический флуоресцирующий γ-глобулин, помещают во влажную камеру при 37 °С на 25—30 мин. Затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с pH 7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдают разной величины и формы флуоресцирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток. В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах. Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.
Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ 3 мес после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.
В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и т. д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.
РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген + антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).
Реакцию ставят на предметных стеклах, на которые наливают 2,5—3 мл расплавленного 1,5 %-ного раствора агара.
Агаровый гель: агар Дифко — 15 г, натрия хлорид — 8,5 г, 1%-ный раствор метилового оранжевого в 50%-ном этиловом спирте — 10 мл, мертиолят — 0,01 г, дистиллированная вода — 1000 мл.
После застывания в агаре делают лунки по трафарету диаметром 4—5 мм, помещенному под предметное стекло с агаром. Агаровые столбики вынимают ученическим пером. Лунки в агаре заполняют компонентами по схеме.
От крупных животных исследуют все отделы головного мозга (левой и правой стороны), от средних (крысы, хомяки и др.) — какие-либо три отдела мозга, у мышей — весь мозг. С помощью пинцета из мозга готовят пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки.
Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят на отдельном стекле по тому же трафарету.
После заполнения лунок компонентами препараты помещают во влажную камеру и ставят в термостат при 37 °С на 6 ч, затем оставляют при комнатной температуре на 18 ч. Учет результатов ведут в течение 48 ч.
Реакцию считают положительной при появлении между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический γ-глобулин, одной или двух-трех линий преципитации любой интенсивности.
Бактериальная контаминация и загнивание мозга не препятствуют использованию его для РДП. Материал, консервированный глицерином, формалином и другими средствами, для РДП непригоден.
Выявление телец Бабеша—Негри. На предметных стеклах делают тонкие мазки или отпечатки из всех отделов головного мозга (как для РИФ), не менее двух препаратов из каждого отдела мозга, и окрашивают по одному из методов (по Селлерсу, Муромцеву, Манну, Ленцу и т. д.).
Пример окраски по Селлерсу: на свежий, невысохший препарат наносят краситель (одна часть 1%-ного раствора основного фуксина, смешанная с двумя частями 1%-ного метилового синего), покрывая им весь препарат, выдерживают 10—30 с и смывают фосфатным буфером (pH 7,0—7,5), высушивают в вертикальном положении при комнатной температуре (в затемненном месте) и просматривают под микроскопом с масляной иммерсией.
Положительным результатом считают наличие телец Бабеша—Негри — четко очерченных овальных или продолговатых гранулированных образований розово-красного цвета, расположенных в цитоплазме клеток или вне их.
Данный метод имеет диагностическое значение только при обнаружении типичных специфических включений.
Биопроба. Она более эффективна по сравнению со всеми указанными выше методами. Ее ставят при получении отрицательных результатов предыдущими методами и в сомнительных случаях.
Для биопробы отбирают белых мышей массой 16—20 г. Нервную ткань из всех отделов головного мозга растирают в ступке со стерильным песком, добавляют физиологический раствор до получения 10%-ной суспензии, отстаивают 30—40 мин и используют надосадочную жидкость для заражения мышат. При подозрении на бактериальное загрязнение добавляют на 1 мл суспензии по 500 ЕД пенициллина и стрептомицина и выдерживают 30—40 мин при комнатной температуре.
На одну биопробу заражают 10 — 12 мышат: половину интрацеребрально по 0,03 мл, половину подкожно в область носика или в верхнюю губу по 0,1—0,2 мл.
Зараженных мышат помещают в стеклянные банки (лучше аквариумы) и наблюдают за ними в течение 30 дней, ведя ежедневную регистрацию. Гибель мышей в течение 48 ч считают неспецифической и не учитывают в оценке результатов. При наличии вируса бешенства в патологическом материале с 7—10-го дня после заражения у мышей наблюдают следующие симптомы: взъерошенность шерсти, своеобразную горбатость спины, нарушение координации движений, паралич задних, затем передних конечностей и гибель. У павших мышей головной мозг исследуют в РИФ, на обнаружение телец Бабеша—Негри и ставят РДП.
Биопробу на бешенство считают положительной, если в препаратах из мозга зараженных мышат обнаруживают тельца Бабеша— Негри или выявляют антиген методами РИФ или РДП. Отрицательный диагноз — отсутствие гибели мышат в течение 30 дней.
Рекомендуют для ранней диагностики методом биопробы (особенно это важно, когда исследуемое животное покусало человека) использовать для заражения не 10—12, а 20—30 мышат, и с третьего дня после заражения ежедневно забивать по 1—2 мышонка для исследования их головного мозга в РИФ. Это позволяет (в положительных случаях) сократить срок исследования на несколько дней.
В лабораторной практике иногда ставят метод так называемой специфической биопробы. Сущность его в том, что мыши заболевают при заражении мозговой тканью больных бешенством животных и не заболевают, если эту ткань предварительно обработать (10 мин при 37 °С) антирабической сывороткой.
Некоторые исследователи рекомендуют проводить прижизненную диагностику бешенства методом иммунофлуоресцентного исследования отпечатков роговицы подозреваемых в заболевании бешенством животных, но эффективность этого метода невысока.
Обычно в лаборатории проводят исследование в следующей последовательности: из головного мозга делают мазки-отпечатки для РИФ и обнаружения телец Бабеша—Негри, ставят РДП, при получении отрицательных результатов делают биопробу.
При высококвалифицированном выполнении РИФ получают 99—100 % совпадения с биопробой. Тельца Бабеша—Негри выявляют лишь в 65—85 % случаев бешенства, в РДП — от 45 до 70 %.
Специфическая профилактика. В настоящее время для профилактики бешенства применяют инактивированные и живые вакцины. Условно вакцины можно разделить:
на вакцины первого поколения, которые готовят из головного мозга животных, инфицированных фиксированным вирусом бешенства;
вакцины второго поколения, которые готовят из штаммов вируса бешенства, адаптированных к культуре клеток;
вакцины третьего поколения, которые получают с помощью генно-инженерных методов.
За рубежом разработали и в некоторых странах успешно применяют рекомбинантную вакцину, которая содержит рекомбинантный вирус оспы, несущий ген основного гликопротеина оболочки вируса бешенства.
В настоящее время начата разработка и показана возможность применения ДНК-вакцин для профилактики бешенства. В России и СНГ широко применяют инактивированную вакцину из штамма Щелково-51, которую готовят с использованием культуры клеток ВНК-21.
Достижения науки по оральной вакцинации лисиц в естественных условиях природы представляют значительную веху в борьбе с природными очагами инфекции.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
источник
106. Возбудитель бешенства. Таксономия. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика.
Таксономия: РНК-содержащий вирус, семейство Rhabdoviride, род Lyssavirus.
Морфология и антигенные свойства. Вирион имеет форму пули, состоит из сердцевины (РНП(рибонуклеопротеин) спирального типа и матриксного белка), окруженной липопротеиновой оболочкой с гликопротеиновыми шипами. Гликопротеин G отвечает за адсорбцию и внедрение вируса в клетку, обладает антигенными (типоспецифический антиген) и иммуногенными свойствами. Антитела к нему нейтрализуют вирус и выявляются в РН(рекция нейтрализации). РНП состоит из геномной однонитевой линейной минус-РНК и белков: N-белка, L-белка и NS-белка. РНП является группоспецифическим антигеном; выявляется в РСК, РИФ, РП.
Различают два вируса бешенства: дикий вирус, циркулирующий среди животных, патогенный для человека; фиксированный – не патогенный для человека.
Культивирование. Вирус культивируют путем внутримозгового заражения лабораторных животных (мышей, крыс) и в культуре клеток: фибробластов человека, куриного эмбриона. В нейронах головного мозга зараженных животных образуются цитоплазматические включения, содержащие антигены вируса (тела Бабеша-Негри – эозинофильные включения).
Резистентность: Вирус бешенства неустойчив: быстро погибает под действием солнечных и УФ-лучей, а также при нагревании до 60С. Чувствителен к дезинфицирующим веществам, жирорастворителям, щелочам и протеолитическим ферментам.
Эпидемиология. Источниками инфекции в природных очагах являются волки, грызуны. Вирус бешенства накапливается в слюнных железах больного животного и выделяется со слюной. Животное заразно в последние дни инкубационного периода (за 2—10 дней до клинических проявлений болезни). Механизм передачи возбудителя — контактный при укусах. Иногда заболевание развивается при употреблении мяса больных животных или при трансплантации инфицированных тканей (роговицы глаза).
У собаки после инкубационного периода (14дн.) появляются возбуждение, обильное слюнотечение, рвота, водобоязнь. Она грызет место укуса, бросается на людей, животных. Через 1—3 дня наступают паралич и смерть животного.
Патогенез и клиника. Вирус, попав со слюной больного животного в поврежденные наружные покровы, реплицируется и персистирует в месте внедрения. Затем возбудитель распространяется по аксонам периферических нервов, достигает клеток головного и спинного мозга, где размножается. Клетки претерпевают дистрофические, воспалительные и дегенеративные изменения. Размножившийся вирус попадает из мозга по центробежным нейронам в различные ткани, в том числе в слюнные железы. Инкубационный период у человека при бешенстве — от 10 дней до 3 месяцев. В начале заболевания появляются недомогание, страх, беспокойство, бессонница, затем развиваются рефлекторная возбудимость, спазматические сокращения мышц глотки и гортани.
Иммунитет: Человек относительно устойчив к бешенству. Постинфекционный иммунитет не изучен, так как больной обычно погибает. Введение людям, укушенным бешеным животным, инактивированной антирабической вакцины вызывает выработку антител, интерферонов и активацию клеточного иммунитета.
Микробиологическая диагностика: Постмортальная диагностика включает обнаружение телец Бабеша—Негри в мазках-отпечатках или срезах из ткани мозга, а также выделение вируса из мозга и подчелюстных слюнных желез. Тельца Бабеша—Негри выявляют методами окраски по Романовскому—Гимзе. Вирусные антигены в клетках обнаруживают с помощью РИФ.
Выделяют вирус из патологического материала путем биопробы на мышах: заражают интрацеребрально. Идентификацию вирусов проводят с помощью ИФА, а также в РН на мышах, используя для нейтрализации вируса антирабический иммуноглобулин.
Прижизненная диагностика основана на исследовании: отпечатков роговицы, биоптатов кожи с помощью РИФ; выделении вируса из слюны, цереброспинальной и слезной жидкости путем интрацеребрального инфицирования мышей. Возможно определение антител у больных с помощью РСК, ИФА.
Лечение. Симптоматическое; эффективное лечение отсутствует.
Профилактика. Выявление, уничтожение животных. Иммунизация антирабической вакциной собак. Специфическую профилактику проводят антирабической вакциной и антирабической сывороткой или иммуноглобулином. Инактивированная УФ- или гамма лучами культуральная вакцина. С лечебно–профилактической целью иммунизируют людей; формируется активный иммунитет.
источник
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ — выращивание вирусов в искусственных условиях путем заражения животных, культур клеток и тканей. К. в. производят в диагностических целях (выделение от больных и носителей), при экспериментальной работе (изучение вирусов), для производства вирусных вакцин и диагностикумов.
Гальтье (V. Galtier) впервые осуществил в 1879 г. культивирование вируса бешенства, заразив кролика мозгом больной собаки. Левенштейн (A. Lowenstein, 1919) первый опубликовал данные об успешной передаче вируса герпеса от человека кролику. Грютер (W. Gruter, 1920) доказал возможность культивирования вируса герпеса на кроликах. Способность вируса вакцины (коровьей оспы) репродуцироваться в тканевой культуре была доказана Паркером и Наем (F. Parker, В. N. Nye) в 1925 г. В 1931 г. Вудрафф (А. М. Woodruff) и Э. Гудпасчер показали возможность К. в. на хорион-аллантоисной оболочке эмбрионов кур (вирус оспы птиц).
Вирусы репродуцируются только в живых клетках, поэтому для их накопления заражают вирусами животных или культуры клеток и тканей. При этом происходит адаптация вируса, полученного из организма больного или носителя, к новым условиям. Чем меньше отличается искусственная система от естественной, тем легче осуществляется адаптация вируса.
Для оптимальной репродукции вируса необходимо использовать наиболее чувствительную систему и проводить заражение сильно разведенным свежим материалом, поскольку инактивированные вирусные частицы могут тормозить размножение инфекционных вирионов. Система, в к-рой вирус проходит полный цикл репродукции, носит название пермиссивной (разрешающей). В непермиссивной (неразрешающей) системе происходит неполный цикл репродукции вируса либо он вообще не репродуцируется. Пермиссивная для данного вируса система может стать для него непермиссивной при изменении условий культивирования, напр, при изменении температуры.
На животных культивируют те вирусы, которые вызывают у них четкую клиническую или патологоанатомическую картину (напр., развитие у мышей параличей при заражении вирусом бешенства или пневмонии при гриппозной инфекции). Многие вирусы лучше растут в мало-дифференцированных тканях эмбрионов птиц и новорожденных млекопитающих, чем в организме взрослых особей.
Для К. в. используют мышей, крыс, морских свинок, кроликов, сирийских хомячков, африканских хорьков, обезьян, кур и др. На взрослых мышах культивируют вирусы гриппа, бешенства, многие тогавирусы; мыши-сосунки незаменимы при выращивании ряда вирусов Коксаки и тогавирусов ряда ареновирусов — возбудителей вирусных геморрагических лихорадок.
Сосунков белых крыс и сирийских хомячков часто используют для культивирования онкогенных вирусов. Морские свинки служат для выращивания вирусов ящура, марбургской болезни и др. Из обезьян наиболее часто используют зеленых африканских мартышек и разные виды макаки. Так, изучение вирусов полиомиелита и желтой лихорадки стало возможным после их адаптации к организму макак. Культивирование возбудителей некоторых медленных инфекций (куру, болезни Крейтцфельдта—Якоба), а также вирусов гепатитов А и В впервые удалось при заражении шимпанзе. Чувствительными к вирусу гепатита А также оказались южноамериканские обезьяны мармозеты.
Для получения стандартных результатов животные, используемые для работы с вирусами, должны быть генетически однородными. Этой цели служит инбредное скрещивание лаб. животных — братьев и сестер или родителей и детей, чем достигается возрастающая степень гомозиготности.
Для успешного К. в., помимо вида и возраста животных, имеет значение путь введения материала, что обусловлено тропностью вируса. Поэтому в большинстве случаев для размножения вируса в организме животного необходима его инокуляция в чувствительную ткань. Лишь некоторые вирусы патогенны для животных при любых способах инокуляции (напр., вирус венесуэльского энцефалита лошадей для мышей).
Большинство нейротропных вирусов культивируют путем введения их в полушария головного мозга животных. Этим путем заражают мышей различными тогавирусами, буньявирусами и другими арбовирусами. Вирус бешенства вводят таким же образом мышам, кроликам, овцам и собакам, вирус лимфоцитарного хориоменингита — мышам и морским свинкам. При культивировании вируса полиомиелита на обезьянках его инокулируют в спинной мозг или таламус головного мозга. Часто при культивировании нейротропных вирусов их вводят животным в брюшную полость, однако этот путь инокуляции уступает по чувствительности внутримозговому. Респираторные вирусы культивируют обычно путем интраназального заражения — их закапывают в ное наркотизированным животным или вводят в виде аэрозоля в специальной камере.
Аденовирусы инокулируют сирийским хомячкам подкожно или в слизистую оболочку защечных мешков, вирус герпеса обезьян — кроликам внутрикожно, а оспенные вирусы — на скарифицированную кожу (кроликам, телятам, курам). Вирусы оспы и герпеса можно культивировать на скарифицированной роговице кролика. Введение вирусов в мышцу, внутривенно, через рот и per rectum применяют редко. Внутривенное заражение морских свинок, хомячков и хорьков технически сложно, вместо этого материал чаще вводят в полость сердца.
К. в. на животных очень затрудняется наличием в их организме различных бактерий, микоплазм и вирусов, которые могут загрязнить культивируемый вирус. Иногда вирус, находящийся в организме животного, создает иммунитет к культивируемому вирусу, напр, возбудитель эктромелии у мышей к вирусу вакцины.
Для уменьшения риска загрязнения культивируемых вирусов посторонними возбудителями все чаще используют животных, выращенных в условиях изоляции. С этой целью получают животных, свободных от специфических для данного вида патогенных агентов,— SPF (specific pathogen free). У их матерей не должно быть инфекций, передающихся через плаценту. Детенышей извлекают при помощи кесарева сечения, вводят им в кишечник апатогенные бактерии, напр, молочнокислые, после чего они вскармливаются SPF самками. В дальнейшем эти животные размножаются обычным путем. Содержат их в закрытых помещениях, куда подается стерильный воздух, пища, вода и пр.
Животных, свободных от всяких возбудителей, содержат в специальных боксах в условиях еще более строгой изоляции (см. Стерильные животные).
Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Для получения оптимальных результатов имеет значение вид и возраст эмбрионов, путь заражения, введенная доза и температура инкубации. Чаще всего используют эмбрионы кур. Они наиболее чувствительны до 13-го дня инкубации. Инокулируют вирусы обычно на хорион-аллантоисную оболочку, в желточный мешок, аллантоисную и амниотическую полость; в мозг эмбрионов и внутривенно (в сосуды оболочек) вирусы вводят редко. В желточном мешке культивируют многие тогавирусы; вирусы гриппа и инф. паротита хорошо культивируются в амниотической полости 10 —11-дневных эмбрионов, при этом вирус гриппа размножается не только в клетках амниона, но также в трахее и легких эмбриона. Вирусы оспенной группы и др. культивируют на хорион-аллантоисной оболочке, заражая 10—13-дневные эмбрионы через естественный воздушный мешок или через отверстие на боковой поверхности яйца после создания искусственного воздушного мешка. При заражении любым путем эмбрионы могут быть травмированы, поэтому их гибель в первые 24 часа расценивается как неспецифическая. Оптимальное количество вируса при заражении — 1000—10 000 инфекционных доз. К. в. в эмбрионах обычно происходит при t° 36—37°. Некоторые вирусы, напр, вирус вакцины, могут размножаться при температуре выше 40°, в то время как возбудитель натуральной оспы необходимо культивировать при температуре не выше 38,5°. Температурно-чувствительные мутанты вирусов, обладающие, как правило, сниженной патогенностью, культивируют при t° 25—28°.
При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (многие арбовирусы, вирус энцефаломиокардита и др.), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.
Большинство известных вирусов можно выращивать в культурах клеток и тканей (см.). Чаще всего используют однослойные первичные или перевиваемые клеточные культуры на стекле, реже применяют суспензионные культуры. К первичным культурам клеток вирусы адаптируются легче, чем к перевиваемым. Вирусы человека лучше всего размножаются в культурах человеческих клеток и почечных клеток обезьян.
Оптимальная доза вируса при заражении — 0,1—0,001 50% тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. Объем инокулята должен быть небольшим. Адсорбцию вируса проводят в течение 1—2 час. при t° 37°, после чего инокулят удаляют, если он токсичен для клеток. Питательная среда должна иметь pH 6,9 — 7,2. Если к ней прибавлена сыворотка, последняя не должна содержать антител или неспецифических ингибиторов по отношению к культивируемому вирусу. Наиболее интенсивная репродукция большинства вирусов происходит при t 36 — 37°; при более низкой температуре (33°) культивируют риновирусы.
При К. в. с целью их выделения из инфицированных органов весьма эффективно культивирование клеток самой исследуемой ткани после ее трипсинизации (напр., ткани миндалин для выделения аденовирусов).
Размножение большинства вирусов сопровождается цитопатическими изменениями. Максимальное количество вируса в культуре обычно наблюдается при дегенерации 75% клеток. Размножение вирусов, не обладающих цитопатической активностью, можно установить с помощью реакции гемадсорбции (многие миксо- и тогавирусы), методом иммунофлюоресценции, путем исследования культуральной жидкости на наличие гемагглютининов (напр., миксовирусы) или комплементсвязывающего вирусного антигена, а также в опытах на животных (вирус бешенства). Некоторые вирусы можно выявить по их способности подавлять размножение цитопатогенного вируса, т. е. по феномену интерференции (напр., в культурах клеток эмбрионов кур, инфицированных вирусами лейкоза птиц, не размножается вирус саркомы Рауса). Некоторые вирусы образуют в клетках включения.
Большинство вирусов после размножения в клетках выходит в культуральную среду, ряд других остается связанным с клетками (вирусы оспы, аденовирусы), некоторые герпетические вирусы необходимо пересевать вместе с неповрежденными клетками, поскольку при разрушении клеток они инактивируются. Иногда при взаимодействии вируса и клетки развивается хрон, инфекция. Напр., инфицированные вирусом лимфоцитарного хориоменингита перевиваемые человеческие клетки могут продуцировать инф. вирус в продолжение многих поколений.
Для выращивания коронавирусов человека и некоторых других используют тканевые культуры, т. е. культивируемые вне организма тканевые фрагменты. Чаще всего используют ткань трахеи кролика. О размножении вируса в этом случае судят по прекращению движения ресничек культуры ткани.
Следует учитывать возможность присутствия в культурах клеток и тканей различных вирусов и мико-плазм. Они могут быть внесены вместе с клетками, если последние взяты из инфицированного организма, попасть из трипсина или используемой в качестве ингредиента питательной среды сыворотки.
Адаптация вируса к искусственным условиям размножения требует проведения нескольких пассажей, быстро следующих друг за другом при заражении небольшой дозой вируса. Обычно интенсивность репродукции вируса при этом значительно возрастает. Иногда вирус после адаптации к одной системе приобретает способность размножаться также в других системах. Свежевыделенные вирусы более пластичны, чем долго культивировавшиеся в каких-либо одних условиях. К. в. в искусственных условиях нередко приводит к снижению их патогенности для естественных хозяев, чем пользуются для получения вакцинных штаммов. В неблагоприятных условиях культивирования (малочувствительных системах или при заражении слишком большой дозой) могут формироваться дефектные вирусные частицы, содержащие лишь часть генома или не имеющие нуклеиновой к-ты. Некоторые вирусы вообще не удается культивировать в искусственных условиях или их репродукция прекращается после нескольких пассажей.
Сохранять вирусы в течение нескольких дней можно при t° 4° в среде с pH ок. 7,0. Устойчивость их возрастает при удалении клеточных фрагментов и прибавлении сыворотки (10%), глицерина (50%) или обезжиренного молока (50%). Все вирусы хорошо сохраняются при t° —70° и ниже в герметически закрытых сосудах; многие остаются жизнеспособными месяцы и даже годы. Оспенные вирусы и энтеровирусы хорошо сохраняются при t° —20°. Замораживание вируса должно происходить быстро. Для повышения устойчивости вируса прибавляют к среде сывороточный белок, куриный желток, пептон, сахарозу или глюкозу. Влияние стабилизаторов на разные вирусы неодинаково. Вирусы могут оставаться жизнеспособными длительное время и после лиофилизации. В качестве стабилизаторов при этом используют пептон (10%), молоко (50%), сахарозу с желатиной или куриным желтком (по 10 %). Лиофилизированный вирус должен сохраняться в вакууме или нейтральном газе (напр., азоте) при t° 4° или —15°.
Библиография: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974; С о к о л о в М. И., С и-н и ц к и й А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Штарке Г. и др. Практическая вирусология, пер. с нем., М., 1970, библиогр.; Comparative diagnosis of viral diseases, ed. by E. Kurstak a. C. Kurstak, v. 1—2, N. Y. a. o., 1977.
источник