Изобретение предназначено для получения средства специфической профилактики против бешенства. Вакцина против бешенства содержит авирулентный мутант штамма SAD Berne вируса бешенства. Штамм характеризуется тем, что содержит в положении 333 природную глутаминовую кислоту, кодон которой отличается от кодонов аргинина по крайней мере двумя нуклеотидами. Штамм депонирован в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов и имеет регистрационный номер C. N.С.М. 1-1238. Штамм получен путем отбора с использованием моноклональных антител, нейтрализующих штамм SAD и нейтрализующих штамм ТAG 1. Штамм и вакцина на его основе характеризуются повышенной безопасностью и эффективностью. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.
Изобретение относится к новой вакцине против бешенства.
Вирус бешенства является рабдовирусом, содержащим пять протеинов, в котором один внешний протеин, гликопротеин, инициирует синтез нейтрализующих антител у привитых животных. Введение очищенного гликопротеина защищает животное от внешней инфекции. Наиболее используемые штаммы вируса бешенства, а именно штаммы CVS и SAD, которые происходят от штаммов SAD, таких как SAD Berne и SAD B19, описаны в «Rabies Viruses», H.F. Clark и T.I. Wictor-Strains of Human Viruses, изд. Majer and Plotkin Karger, Bale, 1972, стр. 177 — 182. Последовательность аминокислот гликопротеина штамма CVS описана Yelverton и др. в «Rabies virus glucoprotein analogs: biosynthesis in Escherichia coli» Science 219, 614 — 620.
Этот гликопротеин содержит два основных антигенных различных сайта, связанных с нейтрализацией вируса /сайты II и III/. Сайт III в положении 330 — 340 содержит аргинин 333, который определяет вирулентность этого штамма.
Последовательность аминокислот гликопротеина штамма SAD Berne не установлена полностью. Однако можно определить, что антигенный сайт III гликопротеина штамма SAD Berne идентичен этому же сайту гликопротеина штамма CVS.
Используемые в настоящее время вакцины против бешенства являются либо вакцинами, полученными из инактивированного вируса, либо вакцинами, состоящими из вирусных штаммов, вирулентность которых уменьшена, либо рекомбинантными вирусами /например, вакцина/.
Инактивация вируса может быть осуществлена различными способами, в частности химическими способами, такими как обработка формолом или -пропиолактоном.
Главным недостатком способа получения вакцины является работа с вирулентными штаммами, что требует точного соблюдения условий работы, и создает риск отравления для работающего персонала.
С другой стороны, инактивированные вакцины, вводимые оральным путем, не обладают защитными свойствами.
Снижение вирулентности вирусных штаммов основано на хорошо известной методике; оно может быть осуществлено, например, последовательным пропусканием вирусных штаммов через хозяина другого вида штамма /кролика или мыши, например/ или через клеточную культуру. Получают таким образом штаммы, несвойственные первоначальному хозяину, и, следовательно, менее патогенные при сохранении их вакцинирующей способности.
Штаммы SAD, такие как SADB19 и SAD Berne, являющиеся доступными, являются ослабленными штаммами и были испытаны в Европе для вакцинации лисиц. Они могут быть смешаны с приманкой для орального введения. Однако эти штаммы проявляют патогенность на других видах животных и на человеке. Следовательно, они создают потенциальный риск отравления, что значительно уменьшает интерес к этим штаммам для оральной вакцинации.
Действительно, например, оральное введение штамма SAD Berne группе из 23 диких грызунов, выбранных среди Apodemus flavicolus et sylvaticus, Arvicola terrestris, Clethrionomys clareolus, Minotus agresti, вызывает смерть от бешенства двух животных.
Испытания на мышах также показывают, что штамм SAD Berne является патогенным для этого типа животных, как при внутричерепном, так и при внутримышечном введении, как это показывают кривые на фиг. 1a и 1b, на которых соответственно показано: фиг. 1a — кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, вводимых интрацеребральным путем (в единицах образующих пятна, ЕОП); фиг. 1b — кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, введенных внутримышечным путем (в единицах, образующих пятна).
При оральном пути введения у мышей отмечается 10%-ная смертность при дозе 10 5,5 ЕОП.
Штамм SAD Berne, применяемый как таковой в вакцинационной кампании на лисицах, представляет опасность для дикой фауны и человека. Это же относится и к штамму SAD B19.
Для устранения этого недостатка уже предлагалась авирулентная вакцина против бешенства. Эта вакцина, описанная в заявке на патент EP 350398, содержит авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, который характеризуется тем, что вместо аргинина 333 гликопротеина он имеет аминокислоту, отличающуюся от лизина, например глицин, изолейцин или серин.
Этот мутант получают заменой одного нуклеотида в кодоне аргинина 333.
К сожалению, этот мутант может при простой обратной мутации вновь дать родительский штамм.
Следовательно, эта вакцина, используемая оральным путем, не всегда безопасна для животных других видов.
Настоящее изобретение относится к эффективной вакцине, которая позволяет устранить указанные недостатки.
Вакцина по изобретению включает авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, который характеризуется тем, что вместо аргинина 333 гликопротеина он содержит природную аминокислоту, кодон которой отличается от кодонов, кодирующих аргинин двумя нуклеотидами.
Изобретение относится также и к способу получения авирулентного мутанта, указанного выше. Этот способ включает: 1) отбор, исходя из штамма SAD вируса бешенства, мутантов, которые не нейтрализованы моноклональными антителами, нейтрализующими вышеупомянутый штамм SAD, но не нейтрализующими штамм TAG1, описанный ниже; 2) отделение путем секвенирования области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) от мутанта, содержащего в положении 333 лизин; 3) получение моноклонального антитела, которое одновременно нейтрализует вышеупомянутый штамм SAD и мутант, полученный на стадии 2), но не нейтрализует штамм TAG1; 4) проведение повторного отбора из мутантов, полученных на стадии 1) с помощью моноклонального антитела, полученного на стадии 3).
Моноклональные антитела, используемые при отборе мутантов по изобретению, получают слиянием клеток миеломы и клеток, производящих антивирусные антитела по методике гибридизации, описанной KOHLER et MILSTEIN, в журнале NATURE, 256, 495 — 497 /1975/, эта методика широко известна в настоящее время специалистам.
Согласно этой методике можно подвергать слиянию клетки, происходящие от различных видов, однако предпочтительными являются клетки животного одного и того же вида. Например, используют преимущественно, с одной стороны, клетки миеломы мыши и, с другой стороны, клетки селезенки мыши, предварительно иммунизированные штаммом вируса бешенства согласно протоколу, приведенному ниже.
В основном, этот способ гибридизации, описанный для клеток мышей, включает следующие стадии: 1) иммунизация мышей заданным количеством вируса, инактивированного -пропиолактоном; 2) извлечение селезенки у иммунизированной мыши и отделение спленоцитов; 3) слияние полученных таким образом спленоцитов с клетками миеломы мыши в присутствии стимулятора слияния; 4) культивирование полученных гибридных клеток в избирательной среде, в которой не развиваются неслившиеся клетки миеломы, в присутствии усваиваемых элементов; 5) отбор клеток, вырабатывающих желаемые антитела и клонирование этих клеток.
Протокол иммунизации включает внутрибрюшинное введение мышам Balb-C 100 мкг инактивированного -пропиолактоном вируса CV5 с адъювантом Фрейда и повторную инъекцию внутривенным путем за 4 дня до слияния клеток после периода отдыха в течение 1 месяца.
Спленоциты иммунизированных мышей собирают после извлечения селезенки классическим способом.
Клетки миеломы мышей, используемые для получения нейтрализующих моноклональных антител, являются клетками миеломы мышей Balb-C, происходящих из колонии SP 2 O. Эти клетки миеломы были отобраны с точки зрения их чувствительности к аминоптерину и культивированы в соответствующей среде, такой как основная среда Игла, модифицированная DULBECCO (Dulbecco Modified Eagle medium), называемая далее среда DMEM, к которой добавлено 15% сыворотки жеребенка.
Слияние клеток миеломы со спленоцитами осуществляют путем смешивания 5 10 7 клеток миеломы с 5 10 7 клеток селезенки иммунизированной мыши в присутствии стимулятора слияния, такого как, например, полиэтиленгликоль.
После инкубации при 37 o C клетки промыват в среде DMEM и вновь суспензируют, затем культивируют в избирательной среде, предназначенной исключительно для роста гибридных клеток. Эта среда содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин.
Отбирают затем супернатанты культур, спустя 7 — 20 дней после слияния клеток, приводя во взаимодействие супернатанты с суспензией вируса CVS и удерживая антитела, которые нейтрализуют вышеупомянутую суспензию.
Термин «антитело, нейтрализующее вирус» обозначает такие антитела, которые при помещении их в суспензию данного вируса ингибируют его вирулентность.
Нейтрализующая способность моноклональных антител, полученных выше, определяется классическим способом, хорошо известным специалисту. Этот способ состоит в смешивании 100 мкл суспензии вируса с содержанием вируса 1000 ЕОП и 100 мкл супернатанта культуры гибридомы, в инфицировании культуры клеток этой смесью и, после 4 дней инкубирования, в подсчете лизированных пятен на агаре по методу, описанному BUSSEREAU et al., 1982, J. Virol. Meth. Vol. 4, стр. 277 — 282. Антитела являются нейтрализаторами, если они ингибируют образование пятен на агаре в вышеупомянутых условиях.
Среди этих антител отбирают затем антитела, которые не нейтрализуют авирулентный мутант TAG1, производный штамма CVS, представленный в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (C.N.C.M. — Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes) Института Пастера — Франция 12 апреля 1985 под N 1-433. Полученные моноклональные антитела, которые нейтрализуют штамм CVS, но не нейтрализуют авирулентный мутант TAG1, позволяют селекционировать авирулентные мутанты исходя из любого штамма вируса бешенства, который нейтрализуется этими моноклональными антителами.
Моноклональные антитела, полученные таким образом, являются антителами, нейтрализующими также штаммы SAD вируса бешенства. Они подходят также для осуществления первичного отбора по способу изобретения.
Секвенирование области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) осуществляют по классической методике, хорошо известной специалисту [SANGER et al., 1977, Proc. Nat. Acad.Sci. USA, vol. 74, p. 5463 — 5467].
Это секвенирование позволяет изолировать мутант, который имеет в положении 333 гликопротеина лизин; этот мутант именуется далее «мутант SK».
Кодон /AAA/ этой аминокислоты /лизина/ отличается от кодона аргинина в положении 333 штамма SAD единственным нуклеотидом, причем кодон аргинина в положении 333 имеет строение AGA.
Далее переходят к получению моноклонального антитела, нейтрализующего одновременно штамм SAD и мутант, полученный выше.
Это моноклональное антитело получают удерживанием среди моноклональных антител, нейтрализующих SAD и не нейтрализующих TAG1, такого, который нейтрализует равным образом лизиновый мутант или мутант SK, полученные выше.
Это моноклональное антитело позволяет осуществить второй отбор /стадию 4/ способа по изобретению.
Патогенная возможность мутантов, полученных после второй селекции, определяется путем интрацеребральной инъекции 10 5 ЕОП взрослым мышам. Мутанты, которые не убивают при этой дозе и при этом методе введения, рассматриваются как авирулентные.
Мутанты по изобретению являются двойными авирулентными мутантами штамма SAD, в частности штамма SAD Berne, получаемыми двумя последовательными селекциями с помощью моноклональных антител, определенных выше.
Мутанты по изобретению могут, кроме того, заключать в себе другие мутации, как например мутацию, придающую устойчивость к моноклональным специфичным антителам антигенного сайта II, что позволяет распознать возможный ревертант вирулентности штаммов SAD, используемых для оральной вакцинации лис.
Мутанты по изобретению могут быть размножены на клетках почки новорожденного хомяка BHK 21, в присутствии среды GEM (основная среда минимум-модификации Глазгоу, выпускаемая фирмой FLOW) и 2%-ной сыворотки теленка при 33 o C во влажной атмосфере с 5%-ным содержанием CO 2 .
Их охарактеризовывают обычными методами, например, определяя летальную дозу 50 /ЛД 50 / на мышах, иммунофлуоресценцией или обсчитывая лизированные пятна на агаре. Они могут храниться при -70 o C.
Анализ последовательности нуклеотидов гликопротеина этих мутантов показывает, что кодон аминокислоты в положении 333 отличается по крайней мере двумя нуклеотидами от всех кодонов, возможных для аргинина. Среди мутантов, которые отвечают этим условиям, предпочтительным особенно является мутант, имеющий в 333 глутаминовую кислоту, так как он хорошо размножается на клеточной культуре, менее патогенен для новорожденных мышей, и он обладает высокой защитной способностью.
Двойной мутант, несущий глутаминовую кислоту, кодон которой: GAA на месте аргинина в положении 333, полученный по вышеприведенному способу; исходя из штамма SAD Berne, называемый далее SAG2, представлен в Национальную Коллекцию Культур Микроорганизмов /C.N.C.M. — Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes/ Института Пастера — Франция 9 июля 1992 под N 1-1238. Этот мутант содержит другую мутацию, а именно устойчивость к моноклональному специфическому антителу антигенного сайта II, что является дополнительным маркером штамма.
Далее представлено детальное описание изобретения, на примере мутанта SAG2, что однако не ограничивает изобретение только этим мутантом.
A — Исследование генетической стабильности штамма при проведении пассажей на мозге мышат.
10 3 ЕОП SAG2 вводят 6 мышатам в возрасте 4 дней. Когда животные заболевают /6/, их умерщвляют. Готовят 6 отдельных измельченных образцов; каждый образец оттитровывают и 30 мкл разбавленного 1/10 образца вводят 3 взрослым мышам /патогенный контроль/ и мышонку /следующий пассаж/, 6 мышат позволяют сделать 6 независимых серий из 3 пассажей.
Титры мозговых веществ в ЕОП /мл даны в таблице.
Все инъектированные взрослые особи /54 мыши/ после 1-го, 2-го и 3-го пассажей остались живы и показали отсутствие реверсии.
B — Защитная способность SAG2.
Мутант SAD2 вводят интрацеребральным путем мышам и определяют защитную способность мутанта в опыте внутримышечного введения 100 ЛД 50 штамма CVS.
Полученные результаты представлены на фиг. 2, где графически показана защитная способность /%/ как функция количества введенного мутанта, выраженного в (ЕОП) UFP/мышь (log). Повторяют то же исследование с мутантом SK, имеющим в положении 333 лизин.
C — Патогенность SAG2 при интрацеребральном введении.
Вводят мутант SAG2 мышам в дозах от 10 -0,5 до 10 6 ЕОП/мышь и не отмечают смертности в течение периода времени 28 дней.
Параллельно, осуществляют тот же опыт с вирусом SAD Berne или мутантом SK.
Результаты представлены на фиг. 3, где дан график зависимости % смертности /ось ординат/ от количества введенного мутанта мышам /ось абсцисс/.
Установлено, что мутант SAG2 не вызывает никакой смертности, тогда как мутант SK имеет слабую остаточную патогенность.
D — Патогенность SAG2 при внутримышечном введении.
Повторяют испытание, приведенное выше, но при внутримышечном введении. Полученные результаты представлены на фиг. 4, где приведен % смертности /ось ординат/ в зависимости от введенной дозы в ЕОП/мышь /ось абсцисс/.
Видно, что SAG2 и мутант SK не вызывают никакой смертности.
Мутанты по изобретению могут применяться в виде живой вакцины при всех обычно используемых способах введения при вакцинации и особенно при внутримышечном или оральном способе введения. Мутанты предварительно разбавляют в инертном фармацевтически пригодном растворителе, таком как физиологическая сыворотка.
1. Авирулентная вакцина против бешенства, отличающаяся тем, что содержит авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, в котором гликопротеин содержит в положении 333 природную глутаминовую кислоту, кодон который отличается от кодонов аргинина, по крайней мере двумя нуклеотидами.
2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что мутантом является мутант штамма SAD Berene.
источник
Перетрухина А. Т., Блинова Е. И.,
Возбудитель бешенства относится к роду Lyssavirus (от греч. lyssa — водобоязнь), семейству Rhabdoviridae. Вирус бешенства единственный из царства Virae, который поражает всех теплокровных животных, в том числе человека, в глобальном масштабе с летальностью 100 %. Род Lyssavirus объединяет 7 генотипов и 4 неклассифицированных вируса. 1-й генотип включает вирусы классического бешенства, обозначенные как штаммы уличного (дикого) вируса, выделенные от наземных млекопитающих, насекомоядных, плотоядных и кровососущих летучих мышей, а также фиксированные (вакцинные) штаммы вируса бешенства. Широко распространены в Европе, Азии, Северной и Южной Америке. 2-й генотип (Лагос-Бат) включает вирусы, выделенные от плотоядных летучих мышей, собак и кошек в Центральной и Южной Африке. 3-й генотип (Мокола) выделен от землероек, человека, собак и кошек в Центральной и Южной Африке. 4-й генотип (Дувенхаге) выделен от человека, укушенного летучей мышью, и летучих мышей в Южной Африке и Зимбабве. 5-й генотип (лиссавирус европейских летучих мышей 1-го типа) циркулирует в Европе, в т.ч. в европейской части России. 6-й генотип (лиссавирус европейских летучих мышей 2-го типа) циркулирует в Европе. Выделен также от человека в Финляндии и Шотландии. 7-й генотип выделен от людей в Австралии. Вирион имеет форму пули размерами 170×70 нм и состоит из несегментированного генома, представленного одной молекулой спирально закрученной РНК негативной полярности и 5 структурных белков, из которых белок N является группоспецифическим антигеном. РНК не инфекционна, а рибонуклеопротеид, в составе которого находится транскриптаза, обладает инфекционными свойствами. В составе вириона, помимо РНК-полимеразы, содержится ряд ферментов. Среди них находится протеинкиназа, полиаденилаттрансфераза и другие ферменты. Для вируса бешенства характерна адаптационная изменчивость, которая была использована Л. Пастером для получения вакцины против бешенства. Уличный вирус бешенства пассировался интрацеребрально на кроликах. По мере пассирования длительный инкубационный период, характерный для инфекции, вызванной уличным вирусом, постепенно сокращался, пока не стал равным 5 дням. Этот вирус был назван фиксированным и при интрацеребральном введении он вызывал 100 % гибель кроликов. Вместе с тем, он потерял патогенные свойства для собаки и человека. Поэтому фиксированный вирус, после дополнительной обработки (высушивание мозга кролика, приводящее к инактивации вируса) был использован в качестве вакцины для лечебно-профилактических прививок. Бешенство — острое нейровирусное заболевание, передаваемое человеку через укус лисы, собаки, волка и других плотоядных животных, зараженных в природе, в свою очередь, так же — через укус. После укуса больного животного вирус размножается в мышечной ткани в месте укуса, а затем, достигнув нервных окончаний чувствительных периферических нервов, распространяется центростремительно, достигая двигательных нейронов. Происходит распространение вируса в нервно-мозговой ткани, демиелиницация белого вещества, дегенерация аксонов и миелиновых оболочек. В спинном мозге более всего поражаются задние рога. В цитоплазме пораженных нервных клеток образуются специфические цитоплазматические включения — тельца Бабеши-Негри, которые являются диагностическим признаком болезни. Включения ацидофильны, четко контурированы, имеют сферическую форму с диаметром от 0,25 до 25 мкм, чаще 2-10 мкм. Размножение вируса происходит в слюнных железах. К моменту появления первых клинических признаков бешенства вирус широко диссеминирован во всем организме. В связи с этими особенностями патогенеза инкубационный период при бешенстве продолжителен, и тем продолжительнее, чем дальше от спинного и головного мозга находится место укуса. Под инкубационным периодом подразумевается период времени от момента укуса до появления первых признаков болезни. Он варьирует от 6-7 суток до 6 лет, но описаны примеры инкубационного периода продолжительностью 10, 11, 13 и 19 лет. Средний инкубационный период при бешенстве составляет 1-3 месяца. Таким образом, длительность его зависит от продолжительности репликации вируса в воротах инфекции, места и тяжести укусов, количества попавшегов рану вируса, свойств вируса, количества нервных окончаний на месте укуса, а также структуры популяции штамма вируса. Заболевание у человека начинается с продромального периода, который длится 2-4 дня и проявляется недомоганием, головной болью, тошнотой, рвотой, повышением температуры. Во входных воротах инфекции нарушается чувствительность. Повышается активность симпатической нервной системы: отмечаются слезотечение, расширение зрачков, потливость, обильное слюноотделение, при глотании — болезненные спазмы. У больного появляется чувство страха, особенно при виде воды. Появляются агрессивность и буйство, конвульсивные судороги, в финальной стадии — параличи, упадок сердечной деятельности и наступает смерть, обычно через 3-5 дней после начала заболевания. Обычно заболевание имеет летальный исход и поэтому иммунитет после перенесенной инфекции не изучен. После вакцинации людей убитой антирабической вакциной появляются антитела, сохраняющиеся в течение года. Ревакцинация приводит к резкому повышению титра антител. Лабораторная диагностика включает обнаружение телец Бабеши-Негри в тканях мозга (посмертная) и выделение вируса молекулярно-генетическими методами ОТ-ПЦР и секвенированием генов N- и G-белков, а также выявление рибонуклеопротеина прямым методом флюоресцирующих моноклональных антител (прижизненная). Бешенство у человека неизлечимо и всегда заканчивается летальным исходом. Единственный метод борьбы с бешенством — профилактика. Профилактика состоит из предупреждения инфицирования человека и предупреждения развития бешенства у инфицированного человека. Предупреждение инфицирования включает контроль за численностью основных носителей вируса в природе и бездомных и домашних животных, иммунизацию домашних животных от вируса бешенства. Предупреждение развития бешенства у человека после контакта с бешеным или подозрительным на бешенство животным осуществляется путем оказания немедленной антирабической помощи. Антирабическая помощь состоит из местной обработки раны, введения антирабической вакцины или комплексного применения антирабического иммуноглобулина и вакцины. Для лечебно-профилактических прививок в РФ и развитых странах применяются концентрированные, очищенные, высокоиммуногенные культуральные вакцины, приготовленные на различных клеточных субстратах, а также антирабический иммуноглобулин. В развитых странах используется человеческий антирабический иммуноглобулин, а в РФ и третьих странах — лошадиный антирабический иммуноглобулин. При поверхностных укусах и царапинах применяется одна вакцина. В РФ вакцина вводится шестикратно внутримышечно по 1 мл в 0, 3, 7,14, 30, и 90-е сутки. В развитых странах вакцина применяется 5-кратно. Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая (Рабивак — «Внуково-32»), лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения и антирабического иммуноглобулина (КОКАВ) Препарат применяется для лечебно-профилактической и профилактической иммунизации человека против бешенства. Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения представляет собой вакцинный вирус бешенства штамм «Внуково-32», выращенный в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков, инактивированный ультрафиолетовыми лучами и формалином, концентрированный методом ультрафильтрации с последующей очисткой методом гельхроматографии. Вакцина антирабическая — пористая масса белого цвета, гигроскопична. Одна доза (1,0 мл) вакцины содержит: специфический антиген вируса бешенства штамм «Внуково-32» — не менее 2,5 ME (Международных Единиц) — активный компонент, альбумин — 5,0 мг (раствор для инфузий) — стабилизатор, сахарозу — 75,0 мг — стабилизатор, желатин — 10,0 мг — формообразователь. Препарат не содержит консервантов и антибиотиков. Вакцина выпускается в комплекте: 1 ампула вакцины по 1,0 мл (1 доза) и 1 ампула растворителя (вода для инъекций) по 1,0 мл. В упаковке содержится 5 комплектов (5 ампул с вакциной и 5 ампул с растворителем). Вакцина индуцирует выработку иммунитета против бешенства. Вакцинацию проводят по следующей схеме: первичная иммуниза- ция — 3 инъекции в 0, 7 и 30 день по 1,0 мл; первая ревакцинация через 1 год — 1 инъекция 1,0 мл; последующие ревакцинации через каждые 3 года — по 1 инъекции 1,0 мл. Вакцину хранят и транспортируют при температуре от 2 до 8 °С. Допускается транспортирование вакцины при температуре до 25 °С в течение не более 2-х суток. Срок годности вакцины — 2 года. Сухая антирабическая вакцина типа Ферми Вакцину изготовляют из мозга овец в возрасте до 1 года, зараженных фиксированным вирусом бешенства. Для приготовления вакцины по методу Ферми измельченный мозг разводится физиологическим раствором, содержащим 1 % фенола, так, чтобы получить 5 % взвесь. После этого вакцина для инактивации выдерживается в течение 8 дней при 20-22 °С. После инактивации вакцина фильтруется через четырехслойный марлевый фильтр и после проверки стерильности передается в разливку. Вакцину выпускают в сухом виде. Она представляет собой таблетку беловато-серого цвета. Одна таблетка получается в результате лиофильного высушивания 0,75 мл 10 % вируссодержащей суспензии. В коробку с 5 ампулами сухой вакцины вкладывают 5 ампул, содержащих по 3 мл растворителя — дистиллированной воды. После растворения вакцина представляет собой гомогенную жидкость беловато-серого цвета. Вакцину вводят немедленно после разведения. Хранение разведенной вакцины не допускается. Срок годности сухой вакцины — 3 года. Рабипур — инактивированная очищенная вакцина против бешенства Рабипур — вакцина для постэкспозиционной (после укуса бешеного или подозрительного животного) и профилактической вакцинации против бешенства. В настоящее время вакцина находится на перерегистации. Рабипур получают путем выращивания штамма вируса Flury LEP на культуре куриных фибробластов. 1 доза лиофилизированного порошка содержит инактивированный вирус бешенства (штамм Flury LEP) с активностью более 2,5 МЕ. Выпускается во флаконах по 1 дозе, в комплекте с иглой и растворителем в ампулах по 1 мл. Вакцина не содержит консервантов. Порошок белого цвета, после растворения — бесцветная жидкость. Хранят при температуре 2-8 °C. Срок годности — 3 года. Жидкая антирабическая вакцина МИВП Вакцина представляет собой 5 % суспензию в 0,96 % растворе фенола головного мозга белых крыс-сосунков, зараженных фиксированным вирусом бешенства, в возрасте 4-8 дней. Этот препарат выпускается в жидком виде. Срок годности жидкой вакцины — 5 месяцев. Сухая антирабическая вакцина МИВП Для приготовления сухой вакцины к 20 % суспензии головного мозга белых крыс-сосунков, инактивированной в фенолизированном физиологическом растворе при 22 °С в течение 14 дней, добавляют равный объем стабилизирующей сахарозо-желатиновой среды, разливают в ампулы по 3 мл и высушивают из замороженного состояния. В коробку с 10 ампулами сухой вакцины помещают равное количество ампул, содержащих по 3 мл дистиллированной воды, применяемой в качестве растворителя. Срок годности сухой вакцины — 1 год. Культуральная антирабическая вакцина Препарат представляет собой вируссодержащую жидкость, полученную при выращивании фиксированного вируса бешенства на первичной культуре клеток почки сирийских хомяков и частично инактивированную действием фенола. Для приготовления вакцины используется штамм «Сад», идентичный с фиксированным вирусом. Он аттенуирован интрацеребральными пассажами на белых мышах и выращиванием в культуре тканей. Срок годности вакцины — 1 год. Антирабический иммуноглобулин из сыворотки лошади Препарат изготавливается из сыворотки лошадей, гипериммунизированных вирусом бешенства. Выпускается в жидком виде в ампулах и флаконах по 5 и 10 мл. На ампулах и коробках с антирабическим гамма-глобулином, кроме других необходимых данных, указывается титр в международных единицах (МЕ). Активность должна быть не менее 800 МЕ/мл, в коробки вкладывают также ампулы с разведенным в 100 раз препаратом, который применяют для определения чувствительности к лошадиному белку. По условным показаниям антирабический иммуноглобулин вводят взрослым в дозе 0,25 мл/кг, по безусловным — 0,25-0,5 мл/кг. Всю дозу иммуноглобулина вводят в один день. Антирабический иммуноглобулин должен храниться при 2-8 °С. Срок хранения — 2 года. Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови человека Применяют в комбинации с антирабической вакциной для предупреждения заболевания людей гидрофобией при тяжелых множественных укусах бешеными или подозрительными на бешенство животными. При повторном множественном укусе больным бешенством или подозрительным на бешенство животным антирабический иммуноглобулин не назначается, если при первом укусе пострадавший получил полный комбинированный курс лечения антирабическим иммуноглобулином и антирабической вакциной. Препарат представляет собой концентрированный раствор очищенной гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови человека, выделенной методом холодовой экстракции этанолом и подвергнутой процессу ультрафильтрации, очистки и вирусной инактивации при значении рН 4,0 и температуре 23-25 °С в течение 21 дня. В 1 мл содержит специфические антитела к вирусу бешенства, не менее 150 ME; стабилизатор глицин (гликокол) от 20 до 25 мг; натрия хлорид 7 мг; вода для инъекций. Препарат не содержит антибиотиков. HBsAg, антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и к вирусу гепатита С отсутствуют. Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость, бесцветная или светло-желтого цвета. Препарат вводят в как можно более ранние сроки после обращения однократно в дозе 20 МЕ/кг массы тела взрослого или ребенка. Введение антирабического иммуноглобулина в более поздние сроки, а также, после введения антирабической вакцины не допускается. Дозировка иммуноглобулина не должна превышаться ни при каких обстоятельствах, так как введение повышенной дозы иммуноглобулина может частично подавить продукцию антител. Хранение при температуре от 2 до 8 °С в защищенном от света месте. Не допускается замораживание. Срок годности препарата — 2 года. Гомологичный антирабический иммуноглобулин из сыворотки людей, иммунизированных против бешенства Препарат представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую жидкость, бесцветную или имеющую легкую желтую окраску. В 1 мл препарата должно содержаться не менее 40 МЕ антител против бешенства. Доза препарата не менее 160 МЕ/кг. Срок годности иммуноглобулина — 1 год. Флюоресцирующий антирабический гамма-глобулин Для ускоренной индикации антигена вируса бешенства прямым иммунофлюоресцентным методом применяется антирабический гамма-глобулин, химически связанный с флюоресцеинизотиоцианатом. Он сообщает антигену вируса бешенства, фиксированного в отпечатках мозга, яркую специфическую флюоресценцию при разведении конъюгата не ниже 1:8. В отпечатках мозга, содержащего другие гетерологичные вирусы, флюоресценция отсутствует. Срок годности препарата — 1 год.
источник
Из аттенуированных в культуре ткани вариантов вируса бешенства в практическом и теоретическом отношении наибольший интерес представляют генетические варианты штамма: SAD — Внуково-32 и ERA. Оригинальный штамм SAD (Street-Alabama-Dufferin) был выделен из мозга собаки и фиксирован после 130 церебральных пассажей на белых мышах. Впоследствии он прошел 25 чередующихся пассажей через организм мыши (интрацеребральное заражение) и в культуре первичных клеток ПСХ (Fenje). Вариант ERA был аттеиуирован после 10 желточных пассажей через организм развивающегося куриного эмбриона и 30 серийных пассажей в культуре первичных клеток почки новорожденного поросенка. При внутримышечном введении он оказался апатогенным не только для различных лабораторных животных, но и для сельскохозяйственных и некоторых диких животных (Abelseth).
В нашей лаборатории штамм SAD прошел еще 10 чередующихся пассажей при температуре 37°С, а затем поддерживался исключительно в культуре первичных клеток ПСХ при разной температуре. Быстрые изменения штамма были отмечены при температуре 26—28°С, когда после 15 пассажей он приобрел rct40 минус признак, слабо интерферировал с различными вирусами, оказался сравнительно термолабильным и потерял иммуногенную активность (Л. Ф. Никитина, (М. А. Селимов). С точки зрения аттенуации, но без потери антигенной активности заслуживали внимание пассажи при температуре 32°С. К 1976 г. в культуре первичных клеток ПСХ при 32°С и 37°С было соответственно сделано 132 и 162 пассажа этого вируса.
Ниже приводятся результаты изучения некоторых свойств штамма Внуково-32 и Внуково-37 различной степени адаптации к клеткам ПСХ в сравнении с известными за рубежом культу-ральными штаммами фиксированного вируса (ERA, Pasteur — 58 пассажей, CVS-11 — 112 пассажей).
Штамм Внуково-32-25 (25 пассажей в культуре клеток ПСХ при 32°С) обладал rct4o±признаком и Внуково-32-62 rct4o минус признаком. Штаммы Внуково-37-83, ERA, Pasteur, CVS-11 обладали rct4o плюс признаком, т. е. не имели существенных различий в степени накопления при температуре 37°С и 40°С. Было показано, что rct4o признак коррелирует с признаком патогенпости этого вируса для лабораторных животных. Так, исходный штамм SAD был патогенным для сирийских хомяков при подкожном и внутримышечном введении, Внуково-32-63 сохранил патогенную активность при внутримышечном введении, а штамм Внуково-32-107 оказался апатогенным при всех путях экстраневрального введения.
Штаммы SAD, Внуково-37-91 ERA, Pasteur CVS-11 вызывали заболевание лабораторным бешенством у мышей весом 11 —12 г при подкожном, внутрибрюшинном и внутримышечном введении, штамм Внуково-32-91 сохранял некоторую активность при внутримышечном введении, а вариант Внуково-32-107 был апатогенным и при внутримышечном введении.
В процессе адаптации штамма Внуково-32 к клеткам ПСХ при пониженной температуре наблюдалось снижение его патогенной активности для лабораторных животных при интрацеребралыюм введении (индекс нейровирулентноети — разница в титрах на мышах различного возраста или на других животных). При интрацеребральном титровании на мышах весом 5—6 и 15—16 г имели разницу в титрах штамм Внуково-32—2,2, lg LDso/0,03 мл, Внуково-37-83—1,9, ERA—1,3 и остальные штаммы — от 0,3 до 0,8 lgLD5o/0,03 мл.
При интрацеребралыюм титровании на сирийских хомяках штамм SAD имел титр 5,0, Внуково-32—3,4 и Внуково-32-107—1,3 lg LD50/0,03 мл и при титровании на морских свинках титры соответственно оказались 4,0; 3,7 и 3,0 IgLDso в 0,1 мл (при этом титры испытуемых вирусов на мышах с массой 5—6 г были сравнимыми). Наконец, штамм Внуково-32-107 оказался апатогенным для кроликов три интрацеребральном введении. В крови кроликов, не заболевших после интрацеребрального заражения, обнаружены очень высокие титры антител. У мышей, морских свинок, кроликов, иммунизированных внутримышечно однократно вирусом (штамм Внуково-32-107), титры антител в крови достигали от 1 : 625 до 1 : 1312.
Другие штаммы стимулировали низкую (продукцию вируснейтрализующих антител. Все это позволяет заключить, что аттенуированный штамм Внуково-32-107 в антигенном отношении оказался более активным, чем его предшественники (Л. Ф. Грибенча и др.).
источник
При лицензировании новых живых вакцин для животных во многих странах (ЕС, США, Япония) их проверяют на отсутствие горизонтальной передачи вакцинного штамма. Проверку проводят на естественно восприимчивых животных (10 вакцинированных и 10 контактных). При совместном содержании в течение 2—4 недель о наличии или отсутствии горизонтальной передачи судят по результатам тщательного лабораторного обследования этих животных. Однако при отрицательном результате таких исследований не исключается принципиальная возможность контактной передачи вакцинного штамма при массовой вакцинации в условиях влияния множества эндогенных и экзогенных факторов.
Редкие случаи такой передачи некоторых вакцинных штаммов известны, но они не ведут к повышению вирулентности вакцинного вируса и не сопровождаются снижением эффективности вакцинации. Исключением из этого правила является живая вакцина против полиомиелита. Вакцинный штамм Сэбина полиовируса типа 1 и 3 в редких случаях оказался способным вновь обрести нейровирулент-ность и вызывать заболевание у вакцинированных или у контактировавших с ними людей. Однако это происходит с исключительно низкой частотой (около одного случая на 106—107 иммунизации) и в общем не влияет на выраженную эпидемиологическую эффективность данного препарата. Выяснена генетическая основа этого довольно редкого повышения вирулентности полиовирусных вакцинных штаммов при репликации в кишечнике привитых.
Другое исключение состоит в том, что некоторые аттенуированные вакцинные штаммы могут довольно легко передаваться горизонтальным путем, не вызывая при этом нежелательных последствий. Однако из-за их высокой эффективности приходится мириться с циркуляцией вакцинного вируса в популяции. Таким примером могут служить некоторые вакцинные штаммы вируса ньюкаслской болезни, которые бессимптомно иммунизируют кур, находящихся в контакте с привитыми в полевых условиях. Способность некоторых аттенуированных штаммов выделяться из организма вакцинированных животных и иммунизировать контактирующих индивидуумов данной популяции считалась положительным явлением, так как облегчала формирование группового иммунитета. Вероятно, данное положение может быть приемлемым только в случае применения нереверсибельных вакцин.
Другая потенциальная опасность живых вакцин состоит в том, что вакцинные штаммы могут длительно персистировать в организме привитых. Например, известны случаи, когда вирус краснухи выделяли из лимфоцитов лиц с артритами через 6 лет после иммунизации. Известны также случаи длительной персистенции (19 мес) вакцинного штамма вируса ветряной оспы в организме привитых детей с последующей реактивацией и восстановлением вирулентности. Однако, в общем, вероятность такой ситуации очень низкая, а широкое применение живой вакцины против кори устраняет редкое, но длительное носительство полевого вируса кори.
Живые вакцины, применяемые в ветеринарии, должны использоваться только для тех видов животных, для которых они предназначены. Например, живая вакцина против чумы собак может вызывать летальную инфекцию у некоторых видов пушных зверей. Живая вакцина против болезни Ауески безопасна для свиней, но высоко вирулентна для пушных зверей.
Противоположным явлением недостаточной аттенуации является чрезмерная аттенуация вируса, при которой могут утрачиваться полезные свойства аттенуированных штаммов и практический смысл их получения. Чрезмерная аттенуация вируса кори при длительном пассировании в различных культурах клеток могла быть возможной причиной ослабления иммуногенной активности вакцины Эдмонстон-Загреб и Ленинград-16. Однако такого не произошло в опытах с вирусом осповакцины. После продолжительной персистентной инфекции выделены аттенуированные для мышей мутанты, имеющие большую делению размером 8 МД на левом конце генома и изменение нуклеотидной последовательности в другой части генома, что сопровождалось значительным изменением структуры белков оболочки (14 и 21 кД) и нуклеоида (39 кД).
Несмотря на такие изменения, аттенуированные мутанты сохраняли иммуногенность и защищали мышей от заражения летальными дозами вирулентного штамма вируса. Таким образом, глубокая аттенуация вируса осповакцины сохранялась в процессе персистенции и, несмотря на значительные изменения генома и поверхностных белков, не сопровождалась потерей иммуногенных свойств. Создается впечатление, что вирус осповакцины является исключением из правил.
Во избежание потери полезных свойств при изготовлении живых вакцин используют вакцинные штаммы только в том диапазоне пассажей, который определен для каждого из них в предварительных опытах и является гарантией безвредности и активности вакцины (обычно в течение не более 20 пассажей от матричной расплодки вируса).
Теоретически одновременное введение двух или более живых вакцин может вызывать снижение иммунного ответа за счет гетерологической интерференции вакцинных штаммов вирусов. На практике оказалось, что это зависит от конкретных вакцин. Так, одновременное применение комбинированной вакцины против кори, краснухи и паротита безопасно и эффективно. Аналогичный результат получен при одновременной иммунизации кур против болезни Марека, ларинготрахеита, ньюкаслской болезни и оспы. Однако пероральная вакцина против полиомиелита и вакцина против ротавирусной инфекции не сочеталась между собой. Также не рекомендуется использовать комбинацию живых вакцин против инфекционного бронхита, ларинготрахеита и ньюкаслской болезни.
Вероятно, все зависит от места репликации вакцинных вирусов в организме. Если места репликации вакцинных штаммов совпадают, значит будет гетероинтерференция, и такие вакцины нельзя применять одновременно.
Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину антирабическую культуральную концентрированную очищенную инактивированную, которая представляет собой лиофилизированный препарат, содержащий производственный штамм «Внуково-32» фиксированного вируса бешенства, выращенный в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков, концентрированный, очищенный и инактивированный УФ-излучением или УФ-излучением в сочетании с обработкой формальдегидом.
Одна прививочная доза вакцины должна содержать вируса бешенства антиген специфический инактивированный, имеющий специфическую активность не менее 2,5 Международных Единиц (МЕ).
Вакцина не содержит консервантов и антибиотиков.
Вакцину выпускают в комплекте с растворителем – водой для инъекций.
Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная предназначена для профилактики бешенства.
Производство вакцины для профилактики бешенства должно быть основано на системе посевных материалов (seed lot system), включающей главный посевной материал и рабочий посевной материал производственного штамма «Внуково-32» фиксированного вируса бешенства.
Количество пассажей полностью охарактеризованного главного посевного вирусного материала для получения рабочего посевного вирусного материала, используемого для производства вакцины, не должно превышать 5.
Рабочий посевной вирусный материал должен отвечать следующим требованиям.
Производственный штамм вируса бешенства должен нейтрализоваться иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади и не должен нейтрализоваться сывороткой крови крупного рогатого скота нормальной. Индекс нейтрализации – не менее 100.
Для испытания параллельно готовят 2 ряда разведений вируса в диапазоне (1:5) — (1:50000) с кратностью разведения 10. В качестве среды разведения используют 2 % раствор сыворотки крови лошади нормальной, приготовленный с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку крови лошади нормальную предварительно инактивируют при температуре 56 о С в течение 30 мин. Для получения разведений вируса в первую пробирку каждого ряда, соответствующую разведению 1:5, вносят 0,4 мл среды разведения, в остальные пробирки ряда– по 0,45 мл среды разведения. В первую пробирку каждого ряда добавляют по 0,1 мл восстановленной суспензии вируса бешенства штамм «Внуково-32» и тщательно перемешивают содержимое пробирок. Далее готовят ряд последовательных разведений путем переноса 0,05 мл смеси из предыдущей пробирки в следующую пробирку, каждый раз используя новую пипетку. Из последней пробирки, соответствующей разведению 1:50000, удаляют 0,05 мл смеси. В результате конечный объем содержимого каждой пробирки составит 0,45 мл смеси.
В каждую пробирку первого ряда вносят по 0,45 мл иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади, в каждую пробирку второго ряда –по 0,45 мл сыворотки крови крупного рогатого скота нормальной, инактивированной при температуре 56 °С в течение 30 мин. В результате получают 2 ряда разведений вируса бешенства штамм «Внуково-32» в диапазоне от 10 -1 до 10 -5 . Содержимое пробирок осторожно перемешивают путем встряхивания и инкубируют при температуре (37 ± 1) о С в течение (75 ± 15) мин. Затем пробирки быстро охлаждают на льду до комнатной температуры и каждым разведением вируса бешенства в объеме 0,03 мл интрацеребрально заражают по 6 беспородных мышей массой 9-10 г. За животными наблюдают 14 дней. Мышей, павших в течение первых 4 дней, при расчетах не учитывают. Титр вируса, использованного для заражения каждой из 2 групп мышей, вычисляют по методу Рида и Менча. Индекс нейтрализации рассчитывают путем вычитания логарифма обратного разведения, соответствующего LD50 вируса в смеси с иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади, из логарифма обратного разведения, соответствующего LD50 вируса в смеси с сывороткой крупного рогатого скота нормальной. Если полученная разница превышает 2, то индекс нейтрализации больше 100.
Не должен содержать бактерий, в том числе микобактерий туберкулеза, и грибов. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».
Испытание на отсутствие микобактерий туберкулеза проводят путем посева на среду Левенштейна-Йенсена.
Не должен содержать микоплазм. Испытание проводят микробиологическим методом в соответствии с ОФС «Испытание на присутствие микоплазм».
Не должен содержать посторонних вирусных агентов по результатам испытания на 20 мышах-сосунках, испытания на 20 беспородных белых мышах массой 15-20 г, испытания на 5 морских свинках массой 350 — 500 г, испытания на культурах клеток.
Используют здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Мышам-сосункам вводят по 0,01 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 0,1 мл интраперитонеально, период наблюдения – 14 сут. Беспородным белым мышам вводят по 0,03 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 0,5 мл интраперитонеально, период наблюдения – 28 сут. Морским свинкам вводят по 0,1 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 5 мл интраперитонеально, период наблюдения – 42 сут.
Не менее 10 -6 LD50/мл при интрацеребральном заражении новорожденных беспородных белых мышей массой 6–8 г.
Не менее 1,0 МЕ. Определение проводят методом NIH (раздел «Испытания готового продукта»).
Для производства вакцины используют первичную культуру клеток почек сирийских хомячков. Почки для получения культуры клеток забирают у клинически здоровых хомячков.
При работе с культурами клеток запрещается использовать антибиотики группы пенициллинов.
Необходимо проводить испытания производственной культуры клеток на стерильность и на отсутствие посторонних вирусных агентов путем изучения феномена гемадсорбции и цитопатических изменений на чувствительных тест-системах: культуре клеток, используемой для производства вакцины, культуре клеточной линии из другого источника, культуре диплоидных клеток человека.
При наличии гемадсорбции и (или) цитопатических изменений в контрольных культурах опыт следует повторить в клеточной культуре другой партии.
Если при повторном исследовании контрольных клеточных культур в одном из испытаний обнаружены цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, то вирус, полученный в соответствующих зараженных культурах, не должен быть использован для производства вакцины.
Все вещества животного происхождения, используемые для получения производственной культуры клеток и культивирования вируса бешенства, проверяют на отсутствие бактерий, грибов, микоплазм и посторонних вирусных агентов. Для размножений клеток не следует применять сыворотки человеческого происхождения.
Все этапы производства должны быть валидированы.
Методы концентрации и очистки вируссодержащей жидкости указывают в нормативной документации. Допускается концентрация и очистка методом ультрафильтрации или концентрация методом ультрафильтрации с последующей очисткой методом гель-хроматографии.
Инактивацию проводят сразу после этапа очистки. При использовании физического метода инактивации отрабатывают режим инактивации: скорость подачи вируссодержащей жидкости, частоту вращения диска инактиватора, интенсивность излучения.
Запрещается использовать в производстве антибиотики после технологического этапа сбора вируссодержащей культуральной жидкости.
В качестве стабилизаторов используют разрешенные вещества, указанные в нормативной документации.
Испытание полуфабриката на стерильность проводят на стадии получения объединенного полуфабриката после этапа концентрации и очистки (до инактивации), после этапа инактивации, после добавления в вакцину стабилизаторов (испытывают смесь для лиофилизации), в процессе розлива.
Испытание полуфабриката на отсутствие микоплазм проводят на стадии получения объединенного полуфабриката после этапа концентрации и очистки (до инактивации), после этапа инактивации.
При использовании дополнительного метода инактивации формальдегидом в полуфабрикате определяют остаточное количество формальдегида. Содержание формальдегида в полуфабрикате – не более 60 мкг/мл.
Испытание полуфабриката на содержание общего белка проводят до добавления стабилизаторов – сахарозы и желатина. Содержание общего белка в полуфабрикате должно быть от 4,7 до 5,0 мг/мл. Определение проводят методом Лоури в соответствии с ОФС «Определение белка».
По показателю «Герметичность» испытывают все ампулы серии. Для проведения испытания ампулы помещают в кассеты, заполненные водой, подкрашенной любым водно-растворимым красителем. Кассеты погружают таким образом, чтобы ампулы полностью находились в воде. Емкость герметично закрывают и создают в ней избыточное давление, по сравнению с атмосферным, – (100 ± 20) кПа. Давление выдерживают не менее 15 мин, после чего устанавливают в емкости давление, равное атмосферному. Емкость открывают, кассеты с ампулами вынимают и просматривают на наличие в них подкрашенной воды. Ампулы, содержащие подкрашенную воду, считают не выдержавшими испытание.
Пористая масса белого цвета, гигроскопична. Определяют визуально.
Вакцина должна вызывать специфический иммунитет к вирусу бешенства при иммунизации мышей. Испытание проводят одновременно с испытанием специфической активности. Определение проводят по разделу «Специфическая активность».
Должна полностью растворяться в течение 5 мин при внесении 1 мл растворителя (вода для инъекций) на 1 дозу вакцины. Определение проводят визуально.
Прозрачная или слабо-опалесцирующая жидкость, не более эталона I. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».
Не более эталона Y4. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС «Степень окраски жидкостей».
От 7,2 до 7,8. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Не более 2,0 %. Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании».
Не более 0,5 мкг в 1 дозе. Определяют методом ракетного иммуноэлектрофореза в соответствии с ОФС «Определение бычьего сывороточного альбумина методом ракетного иммуноэлектрофореза в иммунобиологических лекарственных препаратах». В качестве антисыворотки допускается использовать сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови рогатого скота адсорбированную кроличью диагностическую для судебно-медицинских целей жидкую. Чувствительность сыворотки определяют предварительно и используют в концентрации, при которой с 0,5 мкг/мл БСА образуется четкая ракета с высотой пика не менее 1 мм.
Должна быть стерильной. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации на тиогликолевой среде в соответствии с ОФС «Стерильность».
Должна быть апирогенной. Определение проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Доза препарата для введения составляет 1 прививочную дозу, вводимую внутривенно в объеме 1 мл.
Должна быть нетоксичной. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Морским свинкам вводят по 2 мл восстановленной растворителем вакцины подкожно, мышам – по 1 мл восстановленной растворителем вакцины внутрибрюшинно.
Вакцина не должна содержать живой вирус бешенства.
Для определения специфической безопасности проводят пассаж вакцины в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков. В 2 флакона, содержащие питательную среду с гидролизатом лактальбумина (0,5 %) в растворе Хенкса для культур клеток, вносят по 200 мл клеточной взвеси, содержащей 300-600 тыс клеток/мл. В среду добавляют 10 % раствор сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой.
В качестве контроля используют 2 флакона с незараженной первичной культурой клеток почек сирийских хомячков.
Объем и концентрация клеток, вносимых в опытные и контрольные флаконы, должны быть одинаковыми.
Культуру инкубируют в течение 5-6 сут при температуре (36 ± 1) ºС. Затем отбирают флаконы с полностью сформировавшимся клеточным монослоем. Для испытания на специфическую безопасность от каждой серии отбирают по 25 ампул с препаратом. В каждую ампулу вносят по 1 мл растворителя. Восстановленную вакцину объединяют в одну емкость. Из отобранных флаконов с культурой клеток сливают культуральную жидкость. В каждый опытный флакон вносят по 12,5 мл растворенной вакцины, 2 незараженных флакона оставляют (контрольные). Все флаконы инкубируют при температуре (36 ± 1) о С в течение 90 мин, после чего в опытные и контрольные флаконы вносят по 200 мл питательной среды с гидролизатом лактальбумина (0,5 %) в растворе Хенкса для культур клеток. В поддерживающую среду добавляют 5 % СКРС и канамицин до конечной концентрации 100 мкг/мл или 4 % раствор для инъекций гентамицина сульфата до конечной концентрации 80 мкг/мл. На -8 сут инкубации при температуре (32 ± 1) о С из каждого опытного флакона отбирают по 5 мл культуральной жидкости, смешивают пробы и вводят в головной мозг по 0,03 мл смеси 10 беспородным мышам массой от 6 до 7 г.
Аналогично испытывают культуральную жидкость из контрольных флаконов.
За животными наблюдают 21 сут. За весь период наблюдения не должно регистрироваться ни одного случая смерти от бешенства животного, получившего культуральную жидкость из опытных флаконов. Диагноз устанавливают на основании результатов иммунофлуоресценции (РИФ).
В случае, если в опытной группе зарегистрирована неспецифическая гибель (в первые 4 сут наблюдения) более 2 мышей, испытание повторяют.
При появлении хотя бы у 1 мыши клинических признаков бешенства (тремор конечностей, атаксия, паралич) или при гибели более 2 мышей без клинических признаков заболевания, начиная с 5 сут наблюдения, головной мозг павших животных исследуют методом иммунофлуоресценции. При получении положительных результатов серию считают не выдержавшей испытания; при получении отрицательного результата проводят повторный контроль на удвоенном количестве образцов вакцины и удвоенном количестве мышей.
В случае отрицательного результата при повторном испытании считают, что вакцина не содержит живого вакцинного вируса бешенства. В случае регистрации при повторном контроле хотя бы у 1 мыши клинических признаков бешенства, подтвержденного иммунофлуоресценцией, испытуемую серию вакцины считают не выдержавшей испытания.
Не менее 2,5 Международных Единиц (МЕ) в 1 дозе.
Определение специфической активности проводят по методике Национального института здоровья США (NIH). Специфическую активность испытуемой вакцины определяют в сравнении со стандартным образцом (СО) специфической активности вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной, калиброванным по отношению к Международному стандарту антирабической вакцины. Для определения специфической активности от серии отбирают не менее 3 ампул на каждую иммунизацию.
В каждую ампулу вносят растворитель из расчета 1 мл на 1 дозу вакцины. Полученные растворы объединяют и готовят ряд разведений с пятикратным интервалом в соотношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625; 1:3125 на 0,9 % стерильном растворе натрия хлорида или на среде 199, содержащей 0,1 % альбумина. Разведения, используемые для иммунизации животных, указывают в нормативной документации.
Аналогичным образом готовят разведения стандартного образца, предварительно восстановленного водой для инъекций до содержания 1 МЕ в 1 мл.
Пробирки с разведенной вакциной и стандартным образцом хранят на льду в течение времени постановки опыта, но не более 4 ч.
Для иммунизации используют мышей линии Balb/c или беспородных мышей массой (12 ± 2) г без различия пола. Каждым разведением вакцины и стандартного образца иммунизируют не менее 11 животных; 40 мышей из этой же партии (контрольная группа) содержат в отдельных клетках до проведения титрования фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» (тест-штамм). Мышей иммунизируют внутрибрюшинно по 0,5 мл 2 раза с интервалом 7 сут. На 7 сут после второй иммунизации вводят фиксированный вирус бешенства штамм CVS интрацеребрально в объеме 0,03 мл шприцем вместимостью 1 см 3 . Для заражения всех иммунизированных животных применяют разрешающее (рабочее) разведение вируса бешенства, содержащее от 20 до 100 LD50/0,03 мл вируса.
Одновременно с заражением иммунизированных мышей на неиммунизированных мышах из контрольной группы проводят титрование фиксированного вируса бешенства штамм CVS для определения точной дозы вируса, взятой в испытание. Для этого используют разрешающее (рабочее) разведение вируса (10 0 ) и его десятикратные разведения (10 -1 ; 10 -2 ; 10 -3 ) на
2 % растворе сыворотки крови лошади нормальной, приготовленном с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку крови лошади нормальную предварительно инактивируют при температуре 56 о С в течение 30 мин. Каждым разведением вируса заражают не менее чем по 10 мышей интрацеребрально в объеме 0,03 мл.
За мышами наблюдают в течение 14 сут. При оценке результатов опыта учитывают мышей, заболевших или павших с 5 по 14 сут. Учет проводят ежедневно. Клиническими симптомами на разных стадиях развития заболевания могут быть: взъерошенная шерсть, замедленные и/или круговые движения, дрожание, парез, параличи.
После окончания опыта вычисляют точное количество вируса, содержащееся в 0,03 мл разрешающего разведения, по методу Рида и Менча.
Рассчитывают конечные разведения вакцины и стандартного образца, защищающие 50 % животных (КР50), по следующей формуле:
Т – показатель степени десятичного логарифма;
А – логарифм обратной величины разведения, при котором смертность животных ниже 50 %;
В – показатель смертности животных ниже 50 %;
С – показатель смертности животных выше 50 %;
Д – логарифм кратности разведения.
Специфическую активность испытуемой вакцины (СА) определяют в МЕ относительно специфической активности стандартного образца по формуле:
К – величина, обратная КР50 испытуемой вакцины;
М – величина, обратная КР50 стандартного образца;
У – количество МЕ в 1 мл восстановленного стандартного образца (1 МЕ);
В том случае, когда при проведении испытания специфическая активность вакцины менее нормативных требований, допускается проведение повторного испытания.
Вакцина должна быть термостабильной. После инкубирования образцов при температуре 37 ºС в течение 4 недель специфическая активность вакцины должна быть не менее 2,5 МЕ в 1дозе (раздел «Специфическая активность»). Испытанию на «Термостабильность» подвергают не менее 2 серий вакцины ежегодно.
В нормативной документации указывают растворитель и методику, по которой проводят испытания растворителя.
Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 °С в соответствии сОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».
