Пара, которая планирует завести ребенка, должна помнить, что во всем менструальном цикле женщины, наибольшая вероятность зачатия имеет место в момент овуляции, т.е. освобождения яйцеклетки, примерно в середине цикла, то есть примерно на четырнадцатый день.
Это связано с происходящими в это время изменениями концентрации женских половых гормонов (эстрогена и прогестерона), которые, воздействуя на организм женщины, готовят его к процессу оплодотворения.
Важным элементом этой подготовки является влияние этих гормонов на выделение и консистенцию цервикальной слизи. Ее свойства очень важны для длительного выживания и соответствующей подвижность сперматозоидов, а, следовательно, слизь в значительной степени влияет на возможность оплодотворения.
Стоит отметить, что, применяя соответствующую диету и различные вещества, в период, предшествующий овуляцию, мы можем повлиять на свойства слизи шейки матки, и естественным образом облегчить процесс оплодотворения.
Консистенция и свойства цервикальной слизи меняются в зависимости от фазы менструального цикла, а, следовательно, и в зависимости от концентрации эстрогенов и прогестерона. В первой фазе цикла, так называемой фолликулярной фазе, происходит рост концентрации эстрогенов. Эстрогены вызывают постепенное увеличение производства слизи и увеличивает ее влажность, так что перед овуляцией, она становится водянистой, прозрачной и очень пластичной.
Эти изменения облегчают проникновение сперматозоидов, увеличивая их «срок службы» и подвижность. Между прочим, именно эти изменения приводят к тому, что, согласно научным исследованиям, лучшим временем для зачатия является овуляции и один день до нее.
После овуляции, во время лютеиновой фазы, рост концентрации прогестерона приводит к тому, что количество цервикальной слизи уменьшается и она становится мутной, густой, липкой и непроницаемой для сперматозоидов. При такой ее консистенции оплодотворение затруднено.
Существует множество способов улучшения консистенции слизи шейки матки во время овуляции, что облегчает зачатие ребенка. Поэтому важно, чтобы лица, планирующие зачать ребенка, ознакомились с ними.
Самый простой из известных способов – это просто увеличение количества выпиваемой воды. Через улучшение гидратации организма происходит также рост содержания воды в выделениях, в том числе и в слизи шейки матки. Поэтому женщина, которая планирует забеременеть должна в первой фазе цикла, и особенно перед овуляцией выпивать больше воды, не менее 2 литров в сутки. Это должна быть вода, а не кофе, чай или сок, потому что некоторые содержащиеся в них компоненты могут иссушать организм.
Другим популярным методом является использование масла примулы. Эффективность этого вида лечения связана с тем, что примула является ценным источником ненасыщенных жирных кислот, которые участвуют в образовании в организме важных веществ, влияющих на его правильное функционирование.
Среди многих полезных свойств масла примулы всегда выделяли его положительное влияние на качество слизи шейки матки и помощь в зачатии. В этих целях рекомендуется употребление от 1500 до 3000 мг масла в день в течение всей фоликулярной фазы цикла, например, в виде широко доступных в аптеках препаратов в капсулах.
Не следует, однако, использовать его в лютеиновой фазе, потому что, стимулируя синтез простагландинов, может способствовать повышению сократимости мышц матки и в случае беременности стать причиной выкидыша. Поэтому, во время второй фазы овуляции, лучше всего заменить масло примулы на ложку льняного масла. Используя травяную терапию, следует запастись терпением, потому что эффекта иногда нужно ждать даже два или три месяца.
Гвайфенезин – это, в свою очередь, вещество, содержащееся в широко используемых сиропах от кашля, которое вызывает разжижение секрета в дыхательных путях и это облегчает его откашливание. Такой же разжижающий эффект гвайфенезин оказывает на цервикальную слизь.
В исследованиях было показано, что применение три раза в сутки по 200 мг препарата с гвайфенезином, начиная с пятого дня цикла до овуляции, может принести благотворный эффект в случае, когда источником проблем является нарушение консистенции слизи шейки.
Следует, однако, помнить, чтобы соблюдать осторожность при использовании этого вида препаратов, потому что, как и в случае любого препарата, использование слишком больших доз может вызывать различные побочные эффекты.
Облегчить оплодотворение может также диета снижающая pH организма. Это происходит потому, что, естественно, кислая среда влагалища, отрицательно влияет на жизнеспособность сперматозоидов.
Чтобы избежать закисления организма надо ограничить в рационе такие продукты, как кофе, алкоголь, мясо и молочные продукты, сладости, а также пшеничную муку, а больше потреблять овощей и фруктов.
Среди других средств благоприятно влияющих на процесс оплодотворения стоит отметить зеленый чай, который выполняет в организме роль антиоксиданта, предотвращающая образование активных форм кислорода, которые оказывают неблагоприятное воздействие на различные функции организма, в том числе способствуют появлению нарушений со стороны репродуктивной системы.
Кроме того, помните о благоприятном влиянии применения пробиотиков или экстракта коры дуба в лечении воспалительных заболеваний половых путей, которые также могут быть причиной трудностей с зачатием.
источник
Описание актуально на 22.02.2016
- Латинское название: Guaiphenesinum
- Код АТХ: R05CA03
- Химическая формула: C1H14O4
- Код CAS: 93-14-1
Гвайфенезин, что это? Данное химическое соединение – широко распространенное отхаркивающее средство, выпускается в составе таблеток и сиропов от кашля. Молекулярная масса Гвайфенезина в Википедии указана = 198,2 грамма на моль.
Гвайфенезин, что это такое? Лекарственное средство часто используют в комбинации с другими веществами: псевдоэфедрином, парацетамолом, фенилэфрином, сальбутамолом, рацементолом и т.д. В такой комбинации средство выступает в роли седативного, ликвидирующего чувство тревожности препарата.
Муколитическое, отхаркивающее.
Гвайфенезин оказывает выраженное муколитическое действие, стимулирует работу секреторных клеток слизистой оболочки бронхов. Вещество значительно снижает вязкость мокроты, стимулируя вырабатывать нейтральные полисахариды и деполимеризуя кислые. Также увеличивается объем мокроты, что значительно облегчает ее эвакуацию из бронхов. Под действием лекарства непродуктивный сухой кашель быстро переходит в продуктивный.
Средство быстро и хорошо всасывается из ЖКТ. Спустя полчаса после приема в крови наблюдается достаточно высокая концентрация вещества. Период полувыведения составляет порядка часа. Препараты на основе Гвайфенезина действуют в течение 3,5-4 часов. Метаболизируется лекарство в тканях печени, а выводится из организма с мокротой (легкие) и в виде неактивных метаболитов через почки.
- прифарингите, гриппе, трахеите, синусите, остром трахеите и бронхите с затрудненным отхождением вязкой мокроты;
- у пациентов с бронхиальной астмой по показаниям;
- при бронхоэктатической болезни;
- для лечения туберкулеза легких, пневмониии муковисцидоза в составе комплексной терапии;
- перед операцией и в послеоперационный период для санации бронхиального дерева;
- в составе комплексного лечения нейроциркуляторной дистонии и различных невротических состояний.
- при влажном кашле, если мокроты много и она хорошо отходит;
- пациентам с язвой желудка и 12-персной кишки;
- если ранее у больного наблюдалось желудочное кровотечение;
- детям до 2 лет;
- при аллергии на действующее вещество.
Особую осторожность рекомендуется соблюдать:
- беременным женщинам;
- детям в возрасте до 12 лет;
- во время лактации.
Обычно лекарственное средство хорошо переносится пациентами.
Побочные реакции Гвайфенезина:
- рвота, понос, болезненные ощущения в области живота;
- гипертермия, высыпания на коже аллергического характера, крапивница;
- сонливость, головные боли, головокружение.
Препарат назначают для приема внутрь. Схема лечения и режим дозирования добирается индивидуально, в зависимости от болезни и лекарственной формы.
Согласно инструкции на Гвайфенезин в виде сиропа, лицам в возрасте от 12 лет назначают по 200-400 мг вещества, 3-4 раза в сутки. Лекарство пьют после еды.
Для детей от 6 до 12 лет дозировку необходимо скорректировать до 300-800 мг в сутки, кратность приема та же. В возрасте от 2 до 6 лет можно назначать не более 50-100 мг лекарства, каждые 6-8 часов.
Продолжительность лечения зависит от переносимости и динамики заболевания.
Нет сведений о передозировке препаратом. В случае, если пациент принял большое количество лекарства, необходимо обратиться к врачу.
При одновременном приеме с кодеином значительно затрудняется процесс выведения мокроты.
Данное вещество хорошо сочетается с противомикробными лекарственными средствами, сердечными гликозидами, бронхолитиками.
Сочетание Гвайфенезина с препаратами, угнетающими работу центральной нервной системы, в том числе этанола, усиливает его седативное действие.
Условия хранения средства различные, в зависимости от лекарственной формы.
Во время лечения препаратом моча может окраситься в розовый цвет.
При прохождении терапии рекомендуется обильное питье, вибрационный массаж и постуральный дренаж для стимуляции отхождения мокроты.
Данное вещество может показать ложноположительный результат при взятии мочи на 5-гидроксииндолуксусную или ванилилминдальную кислоту. Поэтому его необходимо прекратить пить за 2 суток до сбора мочи.
Если через 7 дней после начала лечения у пациента не наступают улучшения в состоянии, держится высокая температура, не проходит головная боль, сыпь и боль в горле, то рекомендуется обратиться к врачу за консультацией.
Нежелательно начинать пить лекарство без консультации со специалистом.
Для детей в возрасте от 2 лет препарат безопасен к приему. Однако необходимо скорректировать суточную дозировку, в зависимости от возраста пациента.
У пациентов старше 60 лет чаще наблюдаются побочные реакции на препарат.
Гвайфенезин не рекомендуется сочетать с этанолом и спиртосодержащими средствами.
Беременным и кормящим женщинам лекарство назначают с осторожностью, строго по показаниям врача.
Гвайфенезин входит в состав препаратов Туссин, Туссин Плюс (декстрометрофан) и Колдрекс бронхо.
В комбинации с псевдоэфедрином вещество входит в состав лекарства Судафед.
Растворимый порошок Викс Актив СимптоМакс Плюс содержит данное вещество, парацетамол и фенилэфрин.
В сочетании с бромгексином, рацементолом и сальбутамолом средство находится в составе препаратов Кашнол, Аскорил экспекторант, Кофасма. Также Гвайфенезин содержится в таблетках и каплях Стоптуссин, Джосет, Аскорил.
Отзывы об использовании препарата хорошие. При приеме терапевтических дозировок по показаниям врача побочные реакции, как правило, не проявляются.
Приобрести лекарственное средство можно практически в любой аптеке. Стоимость таблеток Аскорил составляет порядка 170-200 рублей, за 10 таблеток.
источник
Самостоятельно разобраться в разнообразии лекарственных препаратов бывает не просто. Врач не всегда подробно рассказывает, в каких целях следует принимать то или иное лекарство. Стоит рассмотреть, когда назначают препарат, в состав которого входит гвайфенезин, и какое воздействие оказывает медикамент на организм человека.
Торговые названия гвайфенезина различны. Это действующее вещество, которое есть в составе таких аптечных препаратов:
- Вик-сироп;
- Кашнол;
- Колдрекс бронхо;
- Синетос;
- Стоптуссин;
- Судафед;
- Туссин;
- Туссин Плюс;
- Аскорил экспекторант.
Большинство медикаментов предназначено для лечения бронхов. Помимо гвайфенезина некоторые из этих лекарств содержат следующие действующие вещества:
Лекарственные препараты комбинированного действия назначаются врачом при необходимости. Медикаменты этого типа оказывают более выраженное действие.
Присутствие гвайфенезина в некоторых успокоительных препаратах, таких как Новопассит или Нобрассит, вызывает у пациентов недоумение. Это действующее вещество оказывает не просто успокоительное действие. Это мощный анксиолитик, т.е. позволяет человеку справиться с чувством страха, тревоги и паническими атаками.
Анксиолитики входят в группу антидепрессантов с эффектом малого транквилизатора. Медикамент применяют при борьбе с алкогольной зависимостью, при галлюцинациях. К Гвайфенезину не развивается привыкание, что делает его применение безопасным.
Происхождение Гвайфенезина натуральное, так как это вещество производят из коры гваяколового дерева, произрастающего на Багамских и Антильских островах.
Сиропы на основе этого компонента помогают не только бороться со страхами, но и облегчают дыхание, активизируют моторную функцию дыхательных путей.
Медикаментозное средство производится в разных формах выпуска. Помимо гвайфенезина может присутствовать глюкоза, тальк и другие компоненты. Они не оказывают терапевтического воздействия, но обеспечивают постоянство лекарственной формы препарата.
Медицинское средство можно найти в продаже в виде таблеток. Также это может быть Туссин, Синетос или Колдрекс Бронхо.
В продажу поступает сироп. Он имеет приятный вишневый вкус. В 5 мл средства содержится 0,1 г действующего вещества.
Лекарственный препарат помогает излечивать заболевания дыхательных путей, разжижая бронхиальный секрет.
Действующее вещество уменьшает поверхностное натяжение, благодаря чему увеличивается объем мокроты, снижается ее вязкость и облегчается отхождение.
На фоне применения медикамента непродуктивный кашель переходит в продуктивный, причиняющий пациенту меньше мучений.
После приема действие средства сохраняется на протяжении 3-4 часов. Уже через 30 минут лекарство активно действует. Период полувыведения составляет около часа. Частично выводится при кашле с обильным отхождением мокроты. В виде неактивных метаболитов выходит с мочой.
Препарат назначается при заболеваниях дыхательных путей, при которых есть сухой или влажный кашель с густой и вязкой мокротой. Медикамент эффективен при следующих заболеваниях:
- туберкулез;
- муковисцидоз;
- бронхит;
- простуда;
- астма;
- грипп;
- синусит;
- воспаление легких;
- фарингит;
- бронхоэктатическая болезнь.
Медицинское средство назначают пациентам, перенесшим хирургические вмешательства на бронхиальном дереве. Лекарство ускоряет процессы очищения дыхательных путей и нормализации секреции в них.
Лекарственное средство принимают внутрь. Количество медикамента зависит от возраста пациента и диагноза, поставленного врачом. Точную дозировку назначает доктор после обследования.
Медикаментозный препарат в виде сиропа назначают детям в следующих количествах:
- от 2-6 лет — по 2,5-5 мл;
- от 6-12 лет — по 5-10 мл;
- от 12 лет и старше — 10-20 мл.
Лекарство принимать 3-4 раза в день, через равные промежутки времени. Средство от кашля пьют после еды с интервалом в 6-8 часов между приемами.
Неблагоприятные симптомы возникают нечасто. Такое может случиться при нарушении нормального дозирования средства.
Возможны следующие реакции:
- тошнота и рвота;
- боль в области живота;
- расстройство кишечника;
- гастралгия;
- общая слабость;
- сонливость;
- кожная сыпь;
- головная боль;
- головокружение;
- повышение температуры кожи;
- крапивница.
Не принимать, если есть аллергия на главное действующее вещество. Если пить сироп только после приема пищи, вероятность развития побочных симптомов снижается.
Не применяют препараты на основе гвайфенезина при наличии следующих заболеваний и состояний:
- повышенная чувствительность к компонентам;
- кашель с обильным отхождением мокроты;
- язва желудка или 12-перстной кишки;
- желудочное кровотечение.
Медицинское средство запрещено принимать пациентам до 2 лет, т.к. нет данных о реакции организма в раннем возрасте и информации об эффективности лечения.
Во время применения лекарственных средств, в состав которых входит гвайфенезин, важно принимать достаточное количество жидкости. Отсутствие необходимого объема влаги сокращает положительное влияние средства на организм и ослабляет терапевтический эффект.
Лабораторные анализы, при использовании нитрозонафтольного реактива могут давать ложноположительные результаты. Чтобы этого не произошло, прием средства следует приостановить на 2 суток до посещения лаборатории. Не принимать препарат при хроническом кашле, если лекарство не назначил лечащий врач.
Эффективность медикамента повышается при условии сочетания приема Гвайфенезина с постуральным дренажем или вибрационным массажем.
На фоне лечения может происходить окрашивание мочи в красный цвет. Терапию не нужно прекращать.
Если лечение продолжается в течение недели, а улучшения самочувствия нет, стоит проконсультироваться с врачом относительно необходимости дальнейшей терапии данным способом. Возможно, потребуется замена препарата. Если появились побочные реакции, прием средства стоит прекратить и обратиться к специалисту.
С осторожностью и только по назначению врача. Кормление следует приостановить.
До 2 лет не назначают. С 2-12 лет применяют с осторожностью и под наблюдением врача.
Особое внимание необходимо при лечении хронического кашля на фоне бронхита. Осторожно лекарство назначают детям, у которых есть склонность к повышенному отделению мокроты.
Если диагностированы болезни печени и почек, об этом важно сообщить лечащему врачу. Он определит, возможно ли проведение терапии и нужно ли сокращать дозировку средства.
Нет информации о случаях передозировки данного медицинского препарата.
Сочетание с препаратами, угнетающими работу центральной нервной системы, происходит усиление этого свойства. Увеличивается воздействие этанола, поэтому нельзя совмещать медикамент со спиртными напитками.
Хранить в помещениях, где температура не превышает 25°С, вдали от солнечных лучей. Срок хранения 3 года.
Стоимость лекарственного препарата находится в пределах от 300 руб. за флакон объемом 180 мл.
В продаже можно найти следующие аналогичные по действию препараты:
Запрещено самостоятельно заменять медикамент аналогичным.
Виталий Николаевич, педиатр, Москва
Назначаю препарат детям при бактериальном бронхите. Быстро облегчается дыхание и начинается выведение мокроты.
Елена Сергеевна, терапевт, Ростов
Использую лекарство как вспомогательное средство при бронхиальной астме. Пациентам становится легче, приступ проходит быстро.
Принимаю препарат при сухом кашле. Быстро переходит в продуктивный, выздоровление ускоряется.
Владислав, 35 лет, Санкт-Петербург
Применяю Новопассит, содержащий это действующее вещество. Лекарство помогает справляться с беспокойством, вызванным тревожными мыслями.
источник
Что и требовалось доказать!
Ну не могу я поверить, что у вас несовместимость.
А почему вам не предложили полечиться антибиотиками, антигистаминами, эстрогенами и проч.?
То, что это — проба Курцрока-Миллера, я тоже догадалась уже. Только я сделала очепятку : КурцРока-Миллера
Рез-т означает, что у нас биологическое бесплодие.
И вот что я еще выяснила в ходе прочтения этих статей. Мы ведь сдавали тест-конткт в тот цикл в который я стимулировалась Клостилбегитом (группа Кломифенов). А когда Кломифенами стимулируешься, то тест-контакт может оказаться неинформативным! В общем, ИИ надо делать в естественную О. Вот после приема Ярны (когда яичники наотдыхаются) и приступим!
И вот что я еще выяснила в ходе прочтения этих статей. Мы ведь сдавали тест-конткт в тот цикл в который я стимулировалась Клостилбегитом (группа Кломифенов). А когда Кломифенами стимулируешься, то тест-контакт может оказаться неинформативным! В общем, ИИ надо делать в естественную О. Вот после приема Ярны (когда яичники наотдыхаются) и приступим!
А ты уверена, что сделала из этого правильный вывод (ИИ надо делать в естественную О.)? По-моему, из сказанного тобой следует, что тест-контакт надо делать в естественную о. Я тебя все склоняю пересдать его
Последний раз редактировалось: Vitaminka (17.10.2006 10:16), всего редактировалось 1 раз
Муж MAR-тест не делал. Но когда мы сдавали тест-контакт, то сначала головастики бегали активно (в первом поле зрения), потом их осталось очень мало (единичные во втором поле зрения), дальше (в 3-м и 4-м поле зрения) их вообще не видели. Так что у мужа все ОК. Это все из-за моей ЦС. И врач, который делал ИИ, смотрел СГ и результат тест-контакта сказал, что спермики бодрые и борются до конца!
Про посткоитальный тест тоже вчера весь вечер думала. Так это словосочетание прилипло. из головы никак не выходило! Так что скорей всего и его надо будет пройти.
Я сейчас инфу по этим вопросам собираю, печатаю и в понедельник Нарине покажу.
Следует помнить, что самой частой причиной отрицательного посткоитального теста является наличие АСАТ в сперме (т. е. проблема связана с мужем), а не в шейке матки. Однако очень часто наблюдается сочетание роли как мужских, так и женских факторов. Посткоитальный тест является одним из самых «капризных» тестов в обследовании бесплодия. Достаточно велик процент ложных результатов этого исследования. Поэтому посткоитальный тест необходимо дополнять проведением специальных исследований на АСАТ.
Методы лечения
Лечение супружеских пар с выявленным повышением уровня АСАТ проводится по-разному, в зависимости от всего комплекса данных обследования. Начинают обычно с применения барьерного метода (презерватив) в постоянном режиме сроком на 3-6 месяцев или в прерывистом режиме (половая жизнь без презерватива только в дни, благоприятные для наступления беременности). Уменьшение поступления спермы в организм женщины снижает продукцию антител и повышает шансы наступления беременности. Параллельно может назначаться терапия, снижающая вязкость слизи шейки матки (гуайфенезин), и подавляющая продукцию АСАТ у супругов.
источник
Причины невынашивания и идиопатического бесплодия.
У 2-5% супружеских пар бесплодие возникает по причине привычного невынашивания, и 85% беременностей прерываются до факта их установления. После исключения влияний инфекций (1%), хромосомных и генетических аномалий у супругов (7-50%), анатомических дефектов (5-10%) и недостаточности лютеиновой фазы (5-20%) остаются случаи неясной этиологии. Иммунологические факторы предполагаются причиной более 80% невынашивания неясной этиологии и идиопатических форм бесплодия в супружеских парах.
При иммунной причине невынашивания шанс доносить беременность составляет 30% после 3 выкидышей (без врачебных вмешательств), 25% после 4 выкидышей, 5% после 5 выкидышей. При адекватной терапии шанс благополучного исхода беременности составляет 70-85%.
A.Beer и J.Kwak (1999,2000) выделяют 5 категорий иммунных нарушений, являющихся причиной привычного невынашивания, неудач экстракорпорального оплодотворения и идиопатического бесплодия в супружеской паре.
1 категория
Совместимость супругов по системе HLA и связь ныне известных антигенов системы HLA с нарушением репродуктивной функции. Совместимость по HLA, по мнению авторов, ведет к неэффективному «камуфляжу» плаценты и делает ее доступной к иммунной атаке матери.
2 категория
Антифосфолипидный синдром, связанный с циркуляцией антифосфолипидных антител.
Частота встречаемости антифосфолипидного синдрома среди пациенток с привычным невынашиванием составляет 27-42%. Патогенетической основой неудачного завершения беременности при антифосфолипидном синдроме являются тромботические осложнения, возникающие на уровне маточно-плацентарного бассейна. Кроме того, фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин играют важную роль в процессе имплантации, в качестве «молекулярного клея».
3 категория
Иммунологических нарушений относят антинуклеарные, антигистоновые антитела.
При наличии этих антител могут отсутствовать какие-либо проявления аутоиммунных заболеваний, но в плаценте находят воспалительные изменения.
Полагают, что на долю этих антител приходится до 22% привычного невынашивания иммунного генеза и около 50% бесплодия неясного генеза и неудач экстракорпорального оплодотворения.
4 категория
Наличие антиспермальных антител. Эта категория иммунологических нарушений встречается у 10% пациенток с привычным невынашиванием и с бесплодием. Антиспермальные антитела обнаруживаются при наличии у женщин антифосфолипидных антител к серину или этаноламину.
5 категория
Наиболее тяжелая, к ней относят 45% женщин с неудачами экстракорпорального оплодотворения с нарушением имплантации. В этой категории выделяют несколько
форм.
1 форма связана с увеличением содержания в крови естественных киллеров CD56 свыше 12%. По данным авторов, при повышении CD56+ выше 18% — всегда происходит гибель эмбриона. Данный тип клеток определяется как в крови, так и в эндометрии. Кроме цитотоксической функции они синтезируют провоспалительные цитокины, в том числе TNF-альфа. В результате избытка провоспалительных цитокинов нарушаются процессы имплантации, происходит повреждение клеток трофобласта, с последующим развитием недостаточности трофобласта, плаценты и гибель эмбриона/плода.
2 форма связана с активацией CD19+5+ клеток. Уровень свыше 10% считается патологическим. Основное значение этих клеток связано с продукцией антител к гормонам, имеющим важнейшее значение для нормального развития беременности: эстрадиола, прогестерона, хорионического гонадотропина.
Кроме того, возможно появление антител к тиреоидным гормонам, гормону роста.
При патологической активации CD19+5+ клеток развивается недостаточность лютеиновой фазы, неадекватная реакция на стимуляцию овуляции, синдром «резистентных яичников», преждевременное «старение» яичников, преждевременная менопауза.
Помимо непосредственного влияния на перечисленные гормоны при чрезмерной активности этих клеток наблюдается недостаточность подготовительных к имплантации реакций в эндометрии и миометрии, а в дальнейшем в децидуальной ткани. Это выражается в воспалительных и некротических процессах в децидуальной ткани, в нарушении образования фибриноида, в избыточном отложении фибрина.
3 форма связана с высоким содержанием клеток CD19+5+ клеток, которые продуцируют антитела к нейротрансмиттерам, включая серотонин, эндорфины и энкефалины. Эти антитела способствуют резистентности яичников к стимуляции, влияют на развитие миометрия, способствуют снижению кровообращения в матке во время имплантации. При наличии этих антител у пациенток могут быть депрессии, фибромиалгии, нарушение сна, панические состояния.
1. Антиспермальный иммунитет.
2. HLA-идентичность.
3. Чрезмерная иммунная реакция жены на антигены мужа (спорный фактор)
Одним из иммунологических факторов, приводящих к бесплодию, является образование антиспермальных антител. Антиспермальные антитела обнаруживаются у 9-36% бесплодных пар по сравнению с 0,9-4% у пар, имеющими детей.
Антиспермальные антитела являются иммуноглобулинами изотипов IgG, IgA и/или IgM, которые направлены против антигенов мембраны сперматозоидов. Антиспермальные антитела разнообразны, что определяется наличием разных мишеней антител – антигенов. В настоящее время определены различные антигены, такие как YWK II, BE-20, rSMP-B, BS-63,BS-17, HED-2 и 75-kDa. Таким образом, иммунологическое бесплодие является следствием комбинированного воздействия различных антиспермальных антител. Антиспермальные антитела образуются в различных отделах репродуктивного тракта как мужчин (яички, придаток яичка, семявыносящие протоки), так и женщин, они направлены против разных частей сперматозоида (головка сперматозоида, хвост, средняя части или их комбинация), могут присутствовать в различных количествах и воздействовать на процессы репродукции различными путями. Обнаружение антиспермальных антител в шейке матки указывает на их наличие и в других отделах репродуктивного тракта (в полости матки и в просвете маточной трубы). Стало понятно, что антиспермальные антитела у женщины влияют не только на прохождение сперматозоидов через шейку матки, но и резко ухудшают качество оплодотворения.
О механизмах образования антиспермальных антител у мужчин и их влиянии на мужскую фертильность мы остановимся в соответствующей главе публикации. В этом разделе мы остановимся на причинах возникновения и влиянии антиспермальных антител на организм женщины при ее взаимодействии с мужским организмом.
Причины образования антиспермальных антител у женщин.
• Нарушение целостности слизистых оболочек (химические способы контрацепции).
• Высокие цифры лейкоцитов, в т. ч. лимфоцитов, в сперме.
• Сперматозоиды, связанные с антиспермальными антителами.
• Высокий процент аномальных и «старых» сперматозоидов (при редкой половой жизни).
• Оральный и анальный секс (попадание спермы в желудочно-кишечный тракт).
• Попадание большого количества сперматозоидов в брюшную полость (особенности морфологии половых путей, неправильное проведение методов внутриматочной инсеминации).
• Попытки экстракорпорального оплодотворения в прошлом (гормональный «удар» по гипоталамо-гипофизарно-яичниковой оси, травма при заборе яйцеклеток).
• Коагуляция эрозии шейки матки в прошлом.
Несмотря на присутствие «чужеродных» спермальных клеток при половом акте, продукции антиспермальных антител у женщин обычно не происходит. Подобно клеткам мужского генитального тракта, клетки, выстилающие влагалище, служат эффективным физиологическим барьером и ограничивают представление компонентов спермы для иммунной системы. Кроме того, семенная жидкость содержит высокие уровни простагландина Е2, потенциального иммунного супрессора, а также «иммуноглобулин связывающий фактор» — IBF, предотвращающий продукцию антиспермальных антител в репродуктивном тракте. При наличии персистирующей инфекции или воспалении эффективный физиологический барьер может оказаться нарушенным, что увеличит вероятность инициации иммунного распознавания спермы у женщины.
Выработку антиспермальных антител в женском организме также будет стимулировать дополнительное воздействие других антигенов, получающих доступ в половые пути женщины — так иммунный ответ на антигены сперматозоидов может повышаться при воспалительных и инфекционных заболеваниях влагалища.
Шейка матки является наиболее благоприятным и важным местом проявления местного иммунитета. Часто антиспермальные антитела обнаруживаются только в цервикальной жидкости и не определяются в сыворотке крови. Однако необходимо помнить, что гиперчувствительность замедленного типа к сперме и спермиммобилизирующие антитела могут встречаться и у здоровых женщин, имеющих регулярные половые сношения.
Иммунологические механизмы изоиммунизации сперматозоидами.
Антигены обрабатываются макрофагами, и информация о них доставляется в ретикулоэндотелиальную систему по афферентной ветви. Эфферентная ветвь формирование антител и клеточно-опосредованных иммунных реакций. 1- антигены сперматозоидов; 2 — иммуногенный стимул; 3 — афферентная ветвь; 4 — обработка макрофагами; 5 — ретикулоэндотелиальная система; 6 — изоиммунизация; 7- эфферентная ветвь; 8 — клеточный иммунитет; 9 — локальная выработка антител; 10 — системный иммунитет; 11 — гуморальный (антиспермальные антитела); 12 — клеточный.
Влияние антиспермальных антител на процессы репродукции:
• блокада проникновения сперматозоидов в цервикальную слизь,
• воздействие на процесс оплодотворения сперматозоидом яйцеклетки (взаимодействие сперматозоида и яйцеклетки), • влияние на процесс имплантации бластоцисты (оплодотворённой яйцеклетки),
• подавление роста и развития зародыша.
Блокада проникновения сперматозоидов в цервикальную слизь.
Тот факт, что при бесплодии одним из причинных факторов является блокада проникновения сперматозоидов в цервикальную слизь, общеизвестен. В исследованиях было показано, что при наличии антиспермальных антител нарушается или блокируется проникновение сперматозоидов в цервикальную слизь. Было описано явление «дрожания на месте» сперматозоидов покрытых антиспермальными антителами. Предполагается, что он обусловлен взаимодействием Fc-участков антител с гликопротеиновыми мицеллами цервикальной слизи. Данный признак может наблюдаться при проведении посткоитального теста in vivo (проба Шуварского-Симса-Хюнера) и in vitro (проба Курцрока-Миллера).
Влияние на оплодотворение
Антиспермальные антитела вмешиваются в процесс взаимодействия гамет (половых клеток). Они препятствуют проникновению сперматозоида в блестящую оболочку яйцеклетки. Хотя до конца не выяснены механизмы этого, но достоверно известно, что антиспермальные антитела подавляют акросомальную реакцию сперматозоидов, которая является необходимым условием успешного оплодотворения. При наличии антиспермальных антител у мужа или жены качество образующихся зародышей ухудшается, что снижает вероятность успеха лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения.
Влияние на процессы имплантации, роста и развития зародыша.
Одно время предполагалось, что АСАТ могут отрицательным образом влиять и на развитие зародыша на малых сроках. В последнее время большинство исследователей не согласны с такими взглядами.
Показаниями для проведения тестов на антиспермальные антитела являются:
1. Отклонения в посткоитальном тесте:
• малое количество сперматозоидов в цервикальной слизи;
• низкая подвижность сперматозоидов;
• явление дрожания сперматозоидов в посткоитальном тесте;
• отрицательный посткоитальный тест;
2. Отрицательный тест взаимодействия сперматозоидов и шеечной слизи в пробе Курцрока-Миллера.
3. Наличие факторов риска (см. выше);
4. Неудачи или низкие показатели при экстракорпоральном оплодотворении;
5. Идиопатическое бесплодие у обследованных супружеских пар.
У женщин следует определять антиспермальные антитела как в цервикальной слизи, так и в плазме крови.
Обязательным является определение антиспермальных антител у пар, готовящихся к экстракорпоральному оплодотворению, особенно, если женская плазма будет использована как культурная среда в экстракорпоральных технологиях.
Наиболее часто используемые методы определения антиспермальных антител основываются на определении антител, направленных против различных мембранных антигенов.
«Золотого стандарта» для определения антиспермальных антител, не существуют. Поэтому методы, используемые для их определения, взаимодополняют друг друга.
К методам диагностики иммунологических форм бесплодия, связанных с выработкой АСАТ являются:
Посткоитальный тест, или тест взаимодействия сперматозоидов со слизью шейки матки.
• Тест in vivo (проба Шуварского-Симса-Хюнера).
• Тесты in vitro (проба Курцрока-Миллера и проба Кремера).
Следует помнить, что самой частой причиной отрицательного посткоитального теста является наличие антиспермальных антител в сперме (т. е. проблема связана с мужем), а не в шейке матки. Однако очень часто наблюдается сочетание роли как мужских, так и женских факторов.
Непрямой MAR-тест.
Непрямой MAR-тест определяет титр антиспермальных антител в биологических жидкостях – семенная плазма, слизь шейки матки, плазма крови. При этом отмытые подвижные донорские сперматозоиды инкубируются с разведенной биологической жидкостью пациентки. Если биологическая жидкость содержит антиспермальные антитела класса G или А, то они покрывают донорские сперматозоиды, которые будут положительно реагировать в последующем тесте с латексными шариками.
Тест латекс-агглютинации.
Выпускается немецкой фирмой «Bioserv Diagnostics». Преимуществом теста является то, что он является прямым методом определения антиспермальных антител в различных биологических жидкостях (сперме, шейке матки, плазме крови). Тест обладает очень большой чувствительностью. Этот тест применим для выявления антиспермальных антител в цервикальной слизи. Образцы для этого теста можно замораживать. Семенную жидкость или цервикальную слизь разводят буфером, центрифугируют, из надосадочной жидкости готовят разведения 1:100, 1:200 и т.д. На специальный планшет добавляют соответственные разведения образца и латексные частицы, затем оценивают появление агглютинации. Если она появляется в разведении 1:100, тест считается положительным.
Иммуноферментный метод.
Метод для определения антиспермальных антител в плазме крови. Является дополнительным методом диагностики антиспермальных антител.
Для определения антиспермальных антител в сыворотке крови используются наборы на основе метода непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Тест-набор Spermatozoa-Antibody-ELISA производства фирмы IBL (Германия) предназначен для количественного определения антител к поверхностным антигенам сперматозоидов в сыворотке крови и семенной жидкости человека. Образцы разводят и помещают в микропланшет, ячейки которого покрыты смесью белков, способных взаимодействовать с антителами, антиспермальные антитела, находящиеся в образце связываются с этими белками и после определенной последовательности действий измеряется оптическая плотность содержимого ячеек, которая пропорциональна концентрации антиспермальных антител. Нормальные значения — это 0-60 Ед/мл, промежуточные значения 61-100 Ед/мл, повышенные значения более 100 Ед/мл.
Высокие титры антиспермальных антител, определяемых методом ELISA в крови у женщин не всегда связаны с ухудшением прогноза наступления беременности.
Посткоитальный тест — это исследование взаимодействия сперматозоидов и цервикальной слизи шейки матки, проводится для определения иммунологической совместимости партнеров. Тест проводится в случае бесплодного брака, когда оба половых партнера здоровы, но беременность не наступает.
Нередко это связано с их иммунологической несовместимостью, когда в организме женщины вырабатываются антитела против сперматозоидов мужа, которые подавляют подвиж¬ность сперматозоидов и их способность к оплодотворению яйцеклетки.
Физиология взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью.
Для встречи с яйцеклеткой сперматозоиды должны пройти по репродуктивному тракту женщины, включающему канал шейки матки, полость матки и маточных труб. И на каждом этапе происходит взаимодействие сперматозоидов с секретами женского репродуктивного тракта, и это взаимодействие является важным этапом естественного отбора и запуска реакций, необходимых для оплодотворения яйцеклетки. К сожалению, практических методов, позволяющих оценить влияние секрета слизистой матки, трубной жидкости на сперматозоиды, не существует. Но достаточно легки и доступны методы оценки взаимодействия сперматозоидов со слизью цервикального канала.
Впервые подвижность сперматозоидов в цервикальной слизи была обнаружена в 1866 году ученым М. Симсом. Однако длительное время это открытие оставалось без внимания, и только в 1913 году Хунер повторил исследование, и с тех пор посткоитальный тест вошел в практику обследования супружеских пар с бесплодием.
Способность сперматозоидов проникать через цервикальную слизь зависит, как от подвижности и морфологии сперматозоидов, так и от характеристик цервикальной слизи.
Канал шейки матки является первым этапом, который должны преодолеть сперматозоиды. Канал шейки матки выстлан различными типами эпителиальных клеток. Характер и содержание секреторных гранул в эпителиальных клетках разных отделов цервикального канала отличается, а их секрет является одним из компонентов цервикальной слизи. Образование цервикальной слизи в эпителии канала шейки матки находится под контролем гормонов яичников, и ее качественные и количественные характеристики подвергаются циклическим изменениям соответственно фазам менструального цикла. Эстрогены — гормоны первой фазы цикла — стимулируют образование обильной цервикальной слизи, в то время как прогестерон – гормон второй фазы цикла — секреторную активность желез шейки матки подавляет.
У здоровых женщин репродуктивного возраста ежедневное образование цервикальной слизи варьирует от 500 мкл в середине цикла до менее чем 100 мкл в другие периоды цикла. Помимо секрета желез шейки матки в состав цервикальной слизи может входить незначительное количество эндометриальной, трубной и, возможно, фолликулярной жидкости. Кроме этого, цервикальная слизь включает в себя лейкоциты, погибшие клетки эндометрия и эпителия канала шейки матки. И, таким образом, представляет собой гетерогенную субстанцию. Около 50% цервикальной слизи представлено водой.
Консистенция, вязкость — определяется молекулярным составом цервикальной слизи и зависит от концентрации белков и ионов. В различные периоды менструального цикла консистенция цервикальной слизи различна, достигая наибольшей плотности перед менструацией (за счет увеличения количества клеточных элементов) и наименьшей (водянистой) в середине цикла перед овуляцией. После овуляции вязкость цервикальной слизи вновь начинает возрастать.
Растяжимость — характеризует эластические качества цервикальной слизи. В периовуляторный период растяжимость достигает 12-14 см, в то время как в другие периоды цикла составляет всего лишь 3-4 см.
Кристаллизация — свойство цервикальной слизи, наблюдаемое в период высыхания на стекле. В периовуляторный период цервикальная слизь образует на стекле узоры, напоминающие листья папоротника.
По своему составу цервикальная слизь представляет собой гидрогель, включающий компоненты высокой и низкой плотности: электролиты, органические составляющие и растворимые белки. Компоненты высокой плотности — макромолекулы муцина, во многом определяющие реологические характеристики слизи. Цервикальная слизь это фибриллярная система, включающая подгруппы пептидов в центре и цепи олигосахаридов по краям. Циклические изменения в структуре цервикальной слизи оказывают влияние на жизнеспособность и подвижность сперматозоидов в канале шейки матки.
Благоприятные для сперматозоидов изменения в цервикальной слизи наступают приблизительно с 9-го дня нормального 28-дневного менструального цикла и постепенно возрастают, достигая, пика в период овуляции, а увеличение вязкости в лютеиновой фазе цикла создает для сперматозоидов труднопреодолимый барьер. Помимо изменения вязкости цервикальной слизи миграции сперматозоидов препятствуют лейкоциты и погибшие клетки эпителия (что особенно выражено при воспалительном процессе в цервикальном канале). Индивидуальные особенности цервикальной слизи и сперматозоидов приводят к различиям во времени и способности сперматозоидов проходить через цервикальный канал в полость матки. Подвижные сперматозоиды могут задерживаться в цервикальной слизи крипт шейки матки, где они длительно сохраняют жизнеспособность и постепенно медленно проникают в полость матки.
Для осуществления репродуктивной функции наиболее важны некоторые свойства шейки матки и цервикальной слизи:
• Создание благоприятных условий для проникновения сперматозоидов в период овуляции и наоборот препятствия в другие периоды менструального цикла.
• Защита сперматозоидов от «враждебной» среды во влагалище.
• Создание необходимых условий для энергии сперматозоидов
• Осуществление естественного отбора сперматозоидов на основании их подвижности и морфологии
• Создание на короткий промежуток времени резервуара сперматозоидов
• Запуск реакции капацитации сперматозоидов
Важный момент, необходимый для правильной оценки взаимодействия сперматозоидов и цервикальной слизи, — выбор дня цикла для проведения теста. Это связано с изменениями цервикальной слизи и необходимостью проведения теста именно в периовуляторный период, когда наблюдаются наиболее благоприятные условия для сперматозоидов.
Благоприятные для сперматозоидов изменения в цервикальной слизи наступают приблизительно с 9-го дня нормального 28-дневного менструального цикла и постепенно возрастают, достигая, пика в период овуляции, а увеличение вязкости в лютеиновой фазе цикла создает для сперматозоидов труднопреодолимый барьер. У некоторых женщин посткоитальный тест становится положительным только в течение 1-2 дней периовуляторного периода.
Оценка состояния цервикальной слизи.
Перед проведением теста обязательно оценивают состояние цервикальной слизи, что подразумевает оценку вязкости, растяжимости, кристаллизации и pH.
По рекомендациям ВОЗ (2000г) для оценки свойств цервикальной слизи используют бальную систему, разработанную Moghissi в 1976 году.
• Максимальное число баллов равно 15.
• Хорошее состояние цервикальной слизи и благоприятные условия для пенетрации сперматозоидов соответствует 10 баллам и более.
• Неудовлетворительное состояние цервикальной слизи соответствует сумме баллов менее 10.
Количество баллов зависит от объема собранной цервикальной слизи, консистенции, кристаллизации и растяжимости.
При проведении теста цервикальная слизь собирается специальной пипеткой.
Объем цервикальной слизи оценивается:
• 0 баллов — 0 мл;
• 1 балл — 0.1 мл;
• 2 балла — 0.2 мл;
• 3 балла — 0.3 мл и более.
Консистенция цервикальной слизи.
Наименьшая резистентность к проникновению сперматозоидов наблюдается в середине цикла, когда вязкость слизи минимальна, а повышенная вязкость в лютеиновую фазу создает труднопреодолимый барьер для сперматозоидов. Отмершие клетки и лейкоциты создают дополнительное препятствие для миграции сперматозоидов. Так, выраженный эндоцервицит часто сопровождается снижением фертильности. Консистенция оценивается, как:
• 0 баллов — при наличии плотной, высокой вязкости предменструальной слизи;
• 1 балл — слизь средней вязкости;
• 2 балла — незначительной вязкости;
• 3 балла — водянистая, минимальной вязкости преовуляторная слизь.
Кристаллизация цервикальной слизи.
Кристаллизация — это свойство цервикальной слизи, обнаруживаемое при исследовании под микроскопом. При нанесении на предметное стекло в периовуляторный период цервикальная слизь высыхает в виде структуры, подобной листу папоротника. В зависимости от состава слизи фигуры на стекле могут, представлены только в виде стебля папоротника, либо иметь вторичные, третичные и четвертичные ответвления.
Шеечная слизь — феномен арборизации
Шеечная слизь в лютеиновую фазу цикла
Кристаллизация оценивается как:
• 0 баллов — нет кристаллизации;
• 1 балл — атипичная кристаллизация;
• 2 балла — первичная или вторичная структура папоротника;
• 3 балла — четвертичная и более структура.
Растяжимость цервикальной слизи.
Растяжимость оценивается в сантиметрах при помощи специальных инструментов:
• 0 баллов — растяжимость менее 1 см;
• 1 балл — 1-4 см;
• 2 балла — 5-8 см;
• 3 балла — 9 и более см.
Дополнительно при микроскопии цервикальной слизи оценивается количество клеток (лейкоцитов, погибших клеток эпителия) в 1 мл цервикальной слизи.
pH цервикальной слизи оценивается с помощью специальной тест-полоски сразу после сбора или непосредственно в цервикальном канале. В норме pH составляет 6.4-8.0. При проведении исследования важно исключить попадание слизи, содержащейся во влагалище, т.к. pH содержимого влагалища ниже, чем эндоцервикальной слизи. На подвижность сперматозоидов изменения pH цервикальной слизи оказывают большое влияние. Кислая среда делает сперматозоиды неподвижными, в то время как щелочная увеличивает их подвижность. Тем не менее, чрезмерное защелачивание цервикальной слизи (pH более 8.5) может также оказывать неблагоприятное влияние на подвижность сперматозоидов. Оптимальное pH 7.0-8.0 наблюдается в периовуляторный период менструального цикла. Хотя, и pH 6.0-7.0 может быть совместимо с пенетрацией сперматозоидами. Значительное снижение pH цервикальной слизи зачастую связано с бактериальными инфекциями.
Дополнительно для определения качества цервикальной слизи и периода менструального цикла оценивается симптом «зрачка». Под термином симптом «зрачка» понимают вид цервикальной слизи в наружном зеве канала шейки матки. Симптом оценивается при осмотре врача. В периовуляторный период, когда цервикальной слизи много, и она имеет прозрачный и водянистый характер, симптом «зрачка» оценивается, как положительный.
Таким образом, цервикальная слизь доступна для пенетрации сперматозоидов в течение ограниченного периода времени. Длительность этого промежутка времени у каждой женщины индивидуальна, и может отличаться в разных циклах. Поэтому важный момент — правильный выбор времени проведения теста.
Посткоитальный тест in vivo (проба Шуварского-Симса-Хюнера)
Классический посткоитальный тест (проба Шуварского) рекомендуется проводить через 4-6 часов после полового акта. По рекомендациям ВОЗ от 2000г для проведения теста рекомендуется промежуток времени от 9 до 24 часов.
Памятка для пациентов.
Время (день цикла) проведения посткоитального теста определяется индивидуально в зависимости от продолжительности цикла, результатов измерения базальной температуры, тестов на овуляцию, изменений цервикальной слизи по данным осмотра.
• Вы и Ваш партнер должны воздержаться от половой жизни в течение 2-3 дней перед проведением посткоитального теста.
• Перед половым актом выполните свой обычный туалет, во время полового акта нельзя использовать любриканты и влагалищные формы лекарств, перед посещением врача нельзя спринцеваться, вводить во влагалище тампоны, принимать ванну.
• После полового акта отдохните, лежа в кровати, около 30 минут.
• Подложите гигиеническую салфетку обычным образом, чтобы избежать потери семенной жидкости.
• Не удаляйте салфетку до момента осмотра врачом.
Необходимые обследования перед проведением посткоитального теста.
• Исследование на наличие инфекций, передаваемых половым путем.
• Ультразвуковой мониторинг для определения времени, благоприятного для проведения посткоитального теста или график ректальной температуры.
Техника проведения посткоитального теста и интерпретация полученных данных.
Женщин обследуют не позднее чем через 8 ч после совокупления при предшествующем 48-часовом воздержании; шеечную слизь берут пинцетом для удаления носовых полипов из цервикального канала и заднего свода влагалища. Образцы слизи наносят на предметное стекло и изучают под микроскопом.
Во влагалище сперматозоиды обычно погибают в течение 2 часов после коитуса. Обнаружение погибших или подвижных сперматозоидов в пробе из влагалища гарантирует то, что сперма попала во влагалище. При исследовании цервикальной слизи оценивают число и подвижность сперматозоидов в поле зрения.
Количество сперматозоидов в нижней части цервикального канала изменяется в зависимости от времени, прошедшего после полового акта.
Наибольшее количество сперматозоидов в нижней части цервикального канала наблюдается через 2-3 часа после коитуса.
В зависимости от подвижности выделяют:
• быстрые прогрессивно подвижные сперматозоиды (класс А),
• медленные прогрессивно подвижные сперматозоиды (класс В),
• сперматозоиды с неправильным движением (класс С),
• неподвижные сперматозоиды (класс D).
Наиболее важный критерий нормального проникновения сперматозоидов в цервикальную слизь — обнаружение сперматозоидов класса А.
• Хороший результат наблюдается при обнаружении более чем 25 подвижных сперматозоидов (с категорией подвижности «А» и «Б»).
• Удовлетворительный результат — при обнаружении десяти и более сперматозоидов с прямолинейной подвижностью (категория «А»)
• Неудовлетворительный результат – при обнаружении менее чем пяти сперматозоидов (категория «Б»), что свидетельствует об уменьшении количества и подвижности сперматозоидов или патологическом состоянии цервикальной слизи.
Цель посткоитального теста — не только определить число активно-подвижных сперматозоидов, но и оценить выживание сперматозоидов через длительное время после коитуса (роль резервуара). Таким образом, тест проведенный через 9-24 часа после коитуса характеризует именно выживаемость сперматозоидов. При этом обнаружение единичных подвижных сперматозоидов в эндоцервиксе свидетельствует против возможного шеечного фактора, как причины бесплодия.
Причины отрицательного результата посткоитального теста:
• Отсутствие сперматозоидов во влагалище и цервикальной слизи, связанные с нарушением эяку¬ляции и непопаданием сперматозоидов в половые пути женщины
• Неправильное время проведения теста (слишком раннее или слишком позднее время проведе¬ние исследования)
• Местные воспалительные процессы
• Повышение вязкости цервикальной слизи, связанное с низким уровнем эстрогенов перед овуля¬цией в цикле исследования – гормональные нарушения.
Посткоитальный тест является одним из самых «капризных» методов обследования при бесплодии. Очень часто причиной отрицательного посткоитального теста становится слишком раннее или слишком позднее проведение исследования, местные воспалительные процессы, повышение вязкости цервикальной слизи, связанное с низким уровнем эстрогенов перед овуляцией в цикле исследования. Однократный отрицательный посткоитальный тест не указывает достоверно на наличие шеечного фактора бесплодия, т.к. может быть связан с неправильным проведением. В случае отрицательного результата рекомендуется повторное проведение теста в следующем цикле, а в ряде случаев проведение теста in vitro.
Проба Курцрока-Миллера проводится в периовуляторный период. Обычно эти тесты проводят в случае получения отрицательного результата посткоитального теста, и они наиболее информативны при перекрестном тестировании с использованием сперматозоидов и цервикальной слизи от доноров.
Если целью проведения теста взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью является сравнение качества различных образцов цервикальной слизи, то следует использовать один образец эякулята с оптимальными характеристиками концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов.
Если необходимо оценить качество различных образцов эякулята, то следует использовать один и тот же образец цервикальной слизи, чтобы иметь представление о способности сперматозоидов к пенетрации этой слизи.
Если при использовании эякулята мужа и слизи жены мы получили отрицательный результат теста, то можно провести перекрестное тестирование со сперматозоидами и цервикальной слизью донора, чтобы определить сперматозоиды и/ или цервикальная слизь ответственны за патологический результат. Донорскую цервикальную слизь можно получить от женщин, которым проводят искусственную инсеминацию в середине менструального цикла. Цервикальную слизь следует собирать перед инсеминацией в естественном цикле или в цикле стимуляции овуляции гонадотропинами. Женщин, которым проводят стимуляцию овуляции кломифенцитратом, не следует использовать в качестве доноров цервикальной слизи в связи с возможным отрицательным эффектом антиэстрогена на шеечную слизь.
Тесты in vitro проводят в течение часа после получения образца эякулята. Использовать следует только цервикальную слизь, полученную от женщин в середине менструального цикла. На предметное стекло помещают каплю, спермы и каплю цервикальной слизи. Капли покрывают покровным стеклом. Под микроскопом оценивают проникновение сперматозоидов на границе спермы и цервикальной слизи.
Интерпретация результатов:
• Нормальный результат — сперматозоиды пенетрируют в слизь и более 90% из них имеют отчетливую прогрессивную подвижность
• Плохой результат — сперматозоиды пенетрируют в слизь, но большинство не продвигается дальше, чем на 500 микрон (т. е. около десяти длин сперматозоида) от поверхности соприкосновения эякулята со слизью
• Неблагоприятный результат — сперматозоиды пенетрируют в слизь, но быстро теряют подвижность или их движения становятся « колебательными»
• Очень неблагоприятный результат — пенетрация сперматозоидов в слизь не происходит, фаланги не образуются или могут и образовываться, но сперматозоиды скапливаются вдоль границы соприкосновения с цервикальной слизью.
Проба Кремера (капиллярный тест).
Слизь помещают в плоский капилляр, который с одного конца запаивают. Открытый конец капилляра погружают горизонтально в сперму. После двухчасовой инкубации при температуре 37С измеряют расстояние, пройденное в слизи самыми быстрыми сперматозоидами, и их плотность в 1 см и 4,5 см длины капилляра.
Пенетрацию оценивают в баллах: «хорошо», «удовлетворительно», «плохо», «отсутствует».
Если тест демонстрирует нарушение пенетрирующей способности сперматозоидов, проводят перекрестные исследования, заменяя либо эякулят, либо слизь испытуемых эякулятом или слизью доноров.
Лечение супружеских пар с выявленным повышением уровня антиспермальных антител проводится в зависимости от всего комплекса данных обследования.
Начинают обычно с применения барьерного метода (презерватив) в постоянном режиме сроком на 3-6 месяцев или в прерывистом режиме (половая жизнь без презерватива только в дни, благоприятные для наступления беременности). Уменьшение поступления спермы в организм женщины снижает продукцию антител и повышает шансы наступления беременности.
Параллельно может назначаться терапия, снижающая вязкость слизи шейки матки – гуайфенезин. Гуайфенезин относится к отхаркивающим средствам, препарат стимулирует секрецию компонентов слизи с низкой вязкостью, деполимеризует кислые мукополисахариды и повышает активность ресничек мерцательного эпителия. Гуайфенезин также уменьшает поверхностное натяжение и адгезивные свойства слизи, что снижает ее вязкость и облегчает эвакуацию из дыхательных путей. Это единственное отхаркивающее средство, классифицированное Управлением по контролю лекарственных средств и продуктов питания США (FDA) как препарат первой категории (общепризнанное эффективное и безопасное средство).
Возможно использование средств подавляющих продукцию антиспермальных антител у супругов – глюкокортикоидов и иммунодепрессантов.
При неудаче консервативной терапии проводятся курсы внутриматочной инсеминации спермой мужа или экстракорпоральное оплодотворение.
Противопоказанием для внутриматочной инсеминации спермой мужа является наличие антиспермальных антител у мужа, направленных против головки сперматозоидов и не поддающихся лечению консервативными методами.
При безуспешности данных методов следует переходить к ICSI.
На поверхности практически всех клеток организма представлены белки, которые носят название антигенов главного комплекса гистосовместимости — HLA — антигены. Название HLA — антигены было дано в связи с тем, что эти молекулы наиболее полно представлены именно на поверхности лейкоцитов. Каждый человек обладает индивидуальным набором HLA — антигенов.
Молекулы HLA выполняют роль своеобразных «антенн» на поверхности клеток, позволяющих организму распознавать собственные и чужие клетки (бактерии, вирусы, раковые клетки и т.д.) и при необходимости запускать иммунный ответ, обеспечивающий выработку специфических антител и удаление чужеродного агента из организма.
Состав каждого антигена HLA кодируется соответствующим HLA-геном 6-й хромосомы. Иначе говоря, индивидуальное сочетание HLA-антигенов у конкретного человека определяется индивидуальным сочетанием HLA-генов. Сочетание HLA генов, получаемое от родителей, столь же индивидуально, как и отпечатки пальцев.
Гены, кодирующие HLA расположены в семи локусах 6-ой хромосомы:
• HLA-A,
• HLA-B,
• HLA-C,
• HLA-D — фактически, состоит из 4 локусов:
собственно HLA-D
HLA-DP,
HLA-DQ,
HLA-DR
Каждый из генов может иметь многие десятки вариантов — аллелей — их разнообразные сочетания и формируют множество комбинаций генов.
Выделяют 2 класса антигенов HLA:
• К классу I относятся антигены локусов A, B и C.
• К классу II — антигены локусов DR, DP и DQ.
Антигены класса I присутствуют на поверхности всех клеток (а также — тромбоцитов). Антигены класса II — на поверхности клеток, участвующих в иммунологических реакциях (B-лимфоцитов, активированных T-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и дендритных клеток).
Главный комплекс гистосовместимости и беременность.
При наследовании антигенов тканевой совместимости ребенок получает по одному гену каждого локуса от обоих родителей, т.е. половина антигенов тканевой совместимости наследуется от матери и половина от отца. Таким образом, ребенок является наполовину чужеродным для организма матери. Эта «чужеродность» является нормальным физиологическим явлением, запускающим иммунологические реакции, направленные на сохранение беременности. Формируется клон иммунных клеток, вырабатывающий специальные блокирующие антитела. Вне беременности иммунные клетки, циркулирующие в организме как разведчики, выслеживают на поверхности всех без исключения клеток организма белковый код — белки главного комплекса тканевой совместимости (HLA). И если обнаруживаются клетки с измененной структурой, например, занесенные микробы или раковые клетки самого организма, иммунная система немедленно выдает адекватный ответ — атипичные клетки уничтожаются. При беременности, если бы процесс был таким же однозначным, плод неизбежно погибал бы, ведь для иммунной системы это обозначает, что внутри «чужие» клетки! Но во время беременности плод и его клеточные структуры неразличимы для иммунной системы материнского организма.
В-лимфоциты иммунной системы отвечают за гуморальное звено иммунного ответа и продуцируют разнообразные антитела. При наступлении беременности, В-лимфоциты эндометрия вырабатывают «защитные» антитела против отцовских HLA-антигенов. Эти антитела блокируют HLA-антигены отца плода от клеток-разведчиков иммунной системы матери, которые не могут передать информацию материнским естественным киллерам. В конечном счете, иммунная реакция к HLA-антигенам отца плода не активируется и отторжение эмбриона не возникнет.
Неидентичность супругов по HLA-антигенам и антигенное отличие плода от материнского организма является важным моментом, необходимым для сохранения и вынашивания беременности. При нормальном развитии беременности «блокирующие» антитела к отцовским антигенам появляются с самых ранних сроков беременности.
Сходство супругов по антигенам тканевой совместимости приводит к «похожести» плода на организм матери, что является причиной недостаточной антигенной стимуляции В-клеток материнского эндометрия, и необходимые для сохранения беременности иммунные реакции не запускаются. Большое число совпадающих антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA) у супругов приводит к тому, что плод не распознается организмом матери как плод, а воспринимается как измененная клетка собственного организма, против которой начинает работать система уничтожения.
HLA-идентичности, как одна из причин привычного невынашивания и идиопатического бесплодия в супружеской паре.
HLA-типирование супружеской пары в последнее время стало нормой при обследовании по поводу семейного бесплодия. Ребенок получает от родителей по половине их генетического набора – в том числе, и антигенов главного комплекса гистосовместимости. Получается, что он наполовину «чужой» для организма матери – и это хорошо. Только в таком случае запускаются механизмы образования APLA (антител, блокирующих HLA-антигены отца), направленных на сохранение беременности. При этом в самые ранние сроки беременности начинают вырабатываться специфические антитела, в первую очередь к антигенам П класса гистосовместимости. А если у супругов слишком большое сходство HLA-антигенов — антитела, блокирующие HLA-антигены отца не нарабатываются, клетки разведчики распознают плод как инородное тело и презентуют их клеткам — киллерам для уничтожения – то есть запускается процесс выкидыша. Поэтому HLA-типирование проводится, когда в анамнезе уже были прерывания беременности или длительное отсутствие зачатия. Основное внимание при анализе обращают на HLA-антигены I класса HLA-B, П класса по HLA-DR и HLA-DQ антигенам.
HLA-DR
Особое внимание к этим антигенам связано с тем, что они представлены на клетках организма в несравненно большем количестве, чем другие антигены и являются наиболее иммунологически активными. По данным многочисленных исследований частота совпадений супругов по антигену HLA – DR в семьях с привычным невынашиванием составляет от 49 – 100 %. Если у жены и мужа имеется один общий антиген HLA – DR, то вероятность развития совпадения у матери и плода составляет 50%, если два антигена – то 100%.
Большое значение имеет общность супругов по определенным антигенам HLA – DR. В семейных парах с привычным невынашиванием наиболее часто встречается HLA – DR2, который является основным, ассоциированным с привычным невынашиванием, антигеном.
Общие HLA – DR у супругов, а также HLA – DR2 или HLA – DR6 у женщины, являются прогностически неблагоприятными критериями для развития будущих беременностей.
HLA-DQ
DQ-альфа-201 и DQ-бета-201.
Каждый человек получает два гена DQ от своих родителей. Каждый антиген DQ имеет альфа — и бета — цепи. Если у мужчины и женщины обнаруживаются DQ-альфа-4 или у мужчины DQ-альфа-2, обязательно должно выполняться DQ-бета тестирование.
По новой терминологии мужчины с DQ-альфа-2 считаются с DQ-альфа-201. В 2% случаев мужчина, имеющий DQ-альфа-201, имеет и DQ-бета-201. При оплодотворении яйцеклетки сперматозоидом с таким генотипом происходит гибель зиготы в 50%. Если только один DQ-антиген (альфа — или бета -) является 201, вероятность образования такой зиготы в два раза меньше. Когда гены DQ-альфа-201 и бета-201 к эмбриону попадают от матери, эмбрион развивается нормально. Однако если эти оба гена приходят от отца, зигота гибнет.
DQ-альфа-4
У 89% женщин с антителами к фосфолипидам либо имеется DQ-альфа-4, либо близко совпадают значения DQ-альфа у партнеров. Совпадение матери и ребенка по DQ-альфа наблюдается при невынашивании беременности и при неудачных экстракорпоральных оплодотворениях. Если у обоих родителей имеется DQ-4, у ребенка получается генотип DQ 4, 4. При этом первая DQ-4, 4 – беременность активирует киллерные клетки материнского организма и снижает уровень блокирующих антител. В результате вынашивание второй и последующих беременностей становится невозможным без применения лимфоцитоиммунотерапии для повышения уровня защитных антител и внутривенного введения гамма-глобулина для снижения уровня киллерных клеток.
HLA-ассоциированные заболевания.
Уточнение аллельного полиморфизма генов HLA способствует установлению их ассоциированности с заболеваниями. Например, еще в 1973 году выявлено увеличение частоты встречаемости антигена HLA-B27 у больных анкилозирующим спондилоартритом. В дальнейшем было установлено, что целый ряд тяжелых заболеваний человека ассоциирован с наличием в его геноме тех или иных аллельных вариантов HLA-генов: аутоиммунные заболевания, хронический вирусный гепатит В, сахарный диабет I типа, лейкозы, рассеянный склероз и многие другие. Кроме того, был доказан высокий риск врожденных пороков развития плода ассоциированный с HLA – DR5. Ниже представлена таблица хорошо изученных НLA-ассоциированных заболеваний.
Связь антигенов системы HLA с внутренними болезнями.
Лабораторная диагностика или HLA типирование.
HLA типирование предполагает анализ полиморфизма HLA и проводится двумя методами:
• Классический серологический метод HLA типирования основан на микролимфоцитотоксическом тесте
• Молекулярно-генетическим использует проведение ПЦР (полимеразную цепную реакцию).
Серологическое HLA типирование проводится на выделенных клеточных популяциях. Антигены главного комплекса гистосовместимости несут на себе в основном лимфоциты. Поэтому суспензию Т-лимфоцитов используют в качестве основных носителей антигенов I класса, и суспензию В-лимфоцитов для определения антигенов HLA II класса. Для выделения необходимых клеточных популяций из цельной крови используют либо центрифугирование, либо иммуномагнитную сепарацию. Считается, что первый способ может привести к ложноположительным данным, так как при этом происходит гибель части клеток. Второй способ признан более специфичным — при этом более 95% клеток остаются жизнеспособными.
Основой постановки лимфоцитотоксического теста HLA типирования является специфическая сыворотка, содержащая антитела к различным аллельным вариантам антигенов HLA I и II классов. Серологический тест позволяет определить HLA-тип путем изучения того, какие из сывороток реагируют с лимфоцитами, а какие — нет.
Если между клетками и сывороткой происходит реакция, в результате на поверхности клетки образуется комплекс антиген-антитело. После добавления раствора, содержащего комплемент, происходит лизис и гибель клетки.
Оценивают серологический тест HLA типирования с помощью флуоресцентной микроскопии по оценке позитивной (красная флуоресценция) и негативной (зеленая флуоресценция) реакций, или фазово-контрастной микроскопии по окраске ядер погибших клеток.
Результат HLA типирования выводят с учетом специфичности прореагировавших сывороток и перекрестно реагирующих групп антигенов, интенсивности реакции цитотоксичности.
Недостатками серологического HLA типирования являются:
• наличие перекрестных реакций
• слабое сродство антител или низкая экспрессия HLA-антигенов
• отсутствие белковых продуктов у ряда HLA-генов
Молекулярные методы HLA типирования используют уже стандартизованные синтетические образцы, которые реагируют не с антигенами на поверхности лейкоцитов, а с ДНК и прямо указывают на то, какие антигены присутствуют в пробе. Молекулярные методы не требуют живых лейкоцитов, любая человеческая клетка может быть подвержена изучению, и для работы достаточно несколько микролитров крови или можно ограничиться соскобом со слизистой оболочки рта.
Молекулярно-генетическое HLA типирование использует метод ПЦР, первым этапом которой является получение чистой геномной ДНК из цельной крови, лейкоцитарной суспензии или тканей. Затем образец ДНК копируется — амплифицируется в пробирке с использованием праймеров (коротких одноцепочечных ДНК), специфичных к определенному HLA -локусу. Концы каждого из пары праймеров должны быть строго комплементарны уникальной последовательности, соответствующей конкретному аллелю, в противном случае амплификация не осуществляется.
После ПЦР, в ходе многократного копирования, получается большое количество фрагментов ДНК, которое можно оценить визуально. Для этого реакционные смеси подвергают электролизу или гибридизации, и определяют, произошла ли специфическая амплификация, при помощи программы или таблицы.
Результат HLA типирования представляется в форме всестороннего отчета на генном и аллельном уровнях.
Из-за стандартизованности используемых образцов, молекулярное HLA типирование точнее серологического. Кроме того, оно дает больше информации (новых аллелей ДНК) и более высокий уровень ее детализации, поскольку позволяет идентифицировать не только антигены, но и сами аллели, обуславливающие, какой именно антиген присутствует на клетке.
Для преодоления проблемы привычного невынашивания и HLA-идентичности супружеской пары существует несколько видов терапии:
— Иммунизация жены лимфоцитами мужа таким образом, чтобы антигенная нагрузка на иммунную систему женщины увеличивается в 10000 раз по сравнению с нормой;
— Иммунотерапия препаратами гамма-глобулина человека
Иммунизация жены аллогенными лимфоцитами мужа.
Метод используется с конца 1970-х годов, на Западе впервые стал использоваться Фольком, у нас был впервые предложен Говалло и начал внедряться Сидельниковой.
(Говалло В.И., Сидельникова В.М. Иммунизация беременных женщин аллогенными лимфоцитами мужа как метод профилактики самопроизвольных выкидышей // Акуш. и гин. – 1983. – №12. – С. 25-27.) Метод заменил подсадку кожного лоскута мужа жене при невынашивании беременности ранее предложенный тем же автором.
Суть иммунизации.
Суть иммунизации жены аллогенными лимфоцитами мужа в том, что в результате сенсибилизации повышается эффективность узнавания HLA-антигенов мужа специфическими В-клетками эндометрия, которые начинают в достаточном количестве вырабатывать антитела против отцовских лейкоцитов (APLA) в процессе планцентации, что позволяет вовремя запустить механизмы сохранения беременности.
Показания к иммунизации жены аллогенными лимфоцитами мужа:
— Привычное невынашивание, угрожающие выкидыши и спонтанные аборты
— Идиопатическое бесплодие в супружеской паре с HLA-идентичностью (совпадение по 2-3 и более антигенам)
Регламент выполнения процедуры.
— Подготовка мужа к процедуре такая же, как донора крови.
— Работа только с такой кровью, которая проходит по критериям донорства.
Техника процедуры иммунизации.
1. Классическая процедура иммунизации по Говалло В.И..
Процедура была предложена для лечения привычного невынашивания у беременных женщин. Лимфоциты получали из венозной крови мужа в день введения. Для этого 100-150 мл крови забирали во флакон с нетоксичным для лимфоцитов гепарином, разливали кровь по пробиркам по 20 мл и на 30-45 минут оставляли в термостате при 37С в наклонном положении. Затем плазму с лейкоцитами отсасывали пастеровской пипеткой, помещали ее в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 минут при 1500 об/минуту. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок лейкоцитов, в котором было 90% лимфоцитов, ресуспендировали в 2 мл стерильного физиологического раствора. Пипеткой Сали забирали 0,02 мл взвеси клеток для подсчета количества лимфоцитов. Окончательная концентрация лимфоцитов в физиологическом растворе составляла 40-50 млн в 1 мл, процент живых лимфоцитов был не ниже 95. Клетки вводили сразу после приготовления суспензии в дозе 30-120 млн в 2 мл физиологического раствора подкожно в несколько точек (по 0,1 мл суспензии в 20 точек межлопаточной области) однократно в сроки от 5 до 9 недель беременности.
2. Процедура иммунизации по материалам W.Matzner, P.Chong, G.Xu, W.Ching (Am J Reprod Immunol; vol. 33, 1995; pp 10-13)
Процедура предложена для лечения HLA-идентичности у супружеских пар с идиопатическим бесплодием, а также для профилактики привычного невынашивания у небеременных женщин. Производили забор венозной крови мужа. Добавляли буферный раствор Ficoll-Hypaque и центрифугировали. Мононуклеарные лейкоциты отделяли и обрабатывали раствором хлорида аммония для лизиса оставшихся эритроцитов. Тромбоциты вымывали (троекратно) с помощью солевого раствора Hank’s Balance.
Самое главное при процедуре иммунизации лимфоцитами мужа – это качество отмывки лимфоцитов. Важно, чтобы не было примеси эритроцитов и тромбоцитов в приготовленной суспензии.
Методики лечения.
1. Классическая методика по Говалло предполагает однократную процедуру.
2. 40 миллионов клеток вводили внутрикожно в шесть точек предплечья. Иммунизация лимфоцитами мужа развивается обычно в течение 4 недель, и процедуру повторяют. Через месяц после второй иммунизации измеряют уровень APLA для оценки ответа материнского организма. Если он значительно повышается перед зачатием, то успешное вынашивание достигает 80%. Если ответ был ниже ожидаемого, вводили еще 80 миллионов отцовских клеток. Пары были предупреждены о возможности отмены контрацепции только при положительном уровне антител. При необходимости иммунизацию повторяли в середине второго триместра.
3. По другой методике количество вводимых лимфоцитов должно быть не менее 250 миллионов. Сроки проведения процедур те же.
4. Курс плановых иммунизаций вне беременности включает 5-6 введений лимфоцитов мужа с интервалами в 2-3 недели. Эффективность иммунизации оценивается по нарастанию в крови женщины факторов, блокирующих реакции клеточного иммунитета.
Осложнения иммунизации.
— Развитие анафилактических реакций на лимфоциты.
— Инфицирование вирусами ВИЧ, ЦМВ, ВПГ, гепатита В и С
В последнее время для иммунизации женщин стали использовать иммуноглобулин для внутривенного введения, которые блокируют киллерные клетки матери в отношении плода.
Три вида антител в организме беременной женщины важны для вынашивания беременности:
• материнские антитела против отцовских лейкоцитов — APLA, блокирующие антитела
• антифосфолипидные антитела — АРА
• антинуклеарные антитела — АNА
APLA – антитела, блокирующие HLA-антигены отца, экспрессируются плодом, от эффекторных клеток иммунной системы матери. У многорожавших женщин обнаруживают циркуляцию APLA и вне беременности, в то время как у женщин с привычным невынашиванием уровень антител низкий или вовсе не определяется.
Индукция материнским организмом антител, направленных против лейкоцитарных антигенов отца, как ответ на аллостимуляцию является известным феноменом у млекопитающих. Серологические исследования показывают, что эти антитела часто обладают цитотоксическими свойствами и направлены против отцовских аллоантигенов. Из этого был сделан вывод об отрицательном действии этих антител на имплантацию и вынашивание, однако доказательств этого предположения не существует. В настоящее время есть мнение, что присутствие лимфоцитотоксических антител является прогностическим фактором благоприятного исхода беременности. У фертильных женщин лимфоцитотоксические антитела против антигенов отца обнаруживаются чаще, чем у бесплодных.
Уровни лимфоцитотоксических антител в порядке убывания:
• у фертильных женщин
• женщин с вторичным невынашиванием
• первичным невынашиванием
• вторичным бесплодием
• первичным бесплодием.
Частота встречаемости лимфоцитотоксических антител возрастала параллельно с общей продолжительностью беременности за жизнь. Взаимосвязь между уровнем антител и общей продолжительностью и числом беременностей подтверждает концепцию благоприятного влияния лимфоцитотоксических антител на исход беременности.
Методы определения материнских антител против отцовских лейкоцитов – APLA.
1. Проточная цитофлоуметрия.
Преимущества в том, что проточная цитофлоуметрия идентифицирует как комплементсвязывающие, так и не связывающие антитела.
Лимфоциты мужа смешивают с сывороткой жены и инкубируют с иммунофлюоресцентными метками. Образец помещают в цитофлоуриметр. Под излучением аргонового лазера клетки с прикрепившимся к ним APLA начинают флюоресцировать. Компьютер улавливает и измеряет интенсивность свечения.
Положительной считалась продукция антител, если они покрывали 30% и более Т- и В-лимфоцитов мужа.
2. Анализ микролимфоцитотоксичности.
Недостатком этой методики является то, что она определяет только те антитела, которые фиксирует комплемент.
Методики:
• стандартный визуальный анализ лимфоцитотоксичности с окрашиванием эозином
• модифицированное исследование цитотоксичности, основанное на выделении Сr51.
Мишенями для всех тестов были использованы лимфоциты мужа, антитела брали из сыворотки жены.
Цитотоксичность более 20% методом окрашивания эозином, выделение Cr51 на 10% больше, чем спонтанное, рассматривались как положительные результаты тестов на цитотоксичность.
3. Реакция смешанных лимфоцитов (РСЛ или MLR)
Недостатком этой методики является то, что она зависит от свойств культуры.
Для изучения способности моноцитов периферической крови жены реагировать с клетками мужа в РСЛ проводили следующие тесты: взаимодействие клеток жены с клетками мужа (А), с клетками пациентов контрольной группы (В), взаимодействие клеток пациентов контрольной группы с клетками жен и с клетками мужей. Каждая культура состояла из 100000 клеток реципиента в 0,1 мл питательной среды, смешанной со 100000 клетками донора в 0,1 мл питательной среды. Культуры культивировали в инкубаторе в присутствии воздуха с 5% диоксида углерода при температуре 37 градусов в течение 6 дней. За 18 часов до окончания культивирования в каждую культуру добавляли по 2мкКи тимидина, меченного тритием. Затем подсчитывали степень захвата тимидина в минуту. Рассчитываются относительные величины — ответ лимфоцитов жены на лимфоциты мужа (уровень захвата в минуту) и ответ лимфоцитов жены на лимфоциты пациента контрольной группы в процентах.
Исследования показывают, что лимфоциты жен из группы с невынашиванием отвечают на клетки мужей слабее, чем на лимфоциты пациентов контрольной группы. Ответ лимфоцитов жены на клетки мужа составляет 1000 захватов в минуту, а на клетки пациентов из группы контроля — 10000 захватов в минуту. Относительная величина составляет 10%, т.е. лимфоциты жен отвечают на клетки мужа в 10 раз слабее, чем на клетки пациентов из группы контроля.
Сравнение различных методик.
Преимущества использования проточной цитофлуометрии по сравнению с микроцитотоксичностью в определении APLA заключаются в большей чувствительности первой методики, позволяющей определять антитела, не фиксирующие комплемент.
Метод микроцитотоксичности недостаточно чувствителен и не подходит для определения необходимости и эффективности иммунизации лимфоцитами мужа. Диагностическим методом выбора в данном случае является проточная цитофлурометрия.
источник