Моделирование болезни альцгеймера у крыс

Авторы исследования, опубликованного в журнале Animal Cognition, впервые нашли доказательства наличия у крыс метапамяти – способности осознавать, как функционирует собственная память, что они помнят, а что – забыли. Это открытие может стать полезным при моделировании на крысах человеческих болезней, связанных с отклонениями в метапамяти, например, болезни Альцгеймера.

У человека наличие метапамяти определить довольно просто, хотя бы потому что можно понаблюдать за принятием решения, спросить об этом и получить вербальный ответ. Например, при выполнении теста студенты часто пропускают те вопросы, которые вызывают у них затруднения, то есть они оценивают свои знания и понимают, что знают, а что – нет. У животных получить ответ на подобный вопрос сложнее и поэтому тема наличия или отсутствия у них метапамяти довольно дискуссионна, поэтому исследователям приходится полагаться исключительно на поведение. Раньше эксперименты проводились на птицах, приматах и крысах, но результаты получались неоднозначными. Поэтому в данном исследовании ученые подошли к этой проблеме очень ответственно и постарались, избежав любых недопониманий, выяснить, есть у крыс метапамять или нет.

Авторы статьи выбрали девять крыс и провели следующий эксперимент: в тестовой камере с песком были смешаны 4 пахнущих вещества – корица, тимьян, паприка и кофе. Ученые научили крыс рыть песок и зверькам нужно было запомнить запах, который они учуяли. В другой камере находились четыре тарелки с каждым запахом, и нужно было выбрать ту, которая обладала найденным в песке. Если крыса определяла эту тарелку правильно, то она получала лакомство, а если неправильно, то не получала ничего. В такой постановке эксперимента зверьки выбирали неправильную тарелку в 48% случаев. Дальше ученые решили добавить пятую тарелку – без запаха, чтобы предоставить крысам возможность выбирать её в случае, если те забыли прежде найденный запах. Если животные выбирали эту тарелку, то получали четверть лакомства. После такого расширения возможностей для выбора, крысы стали подходить к неправильным тарелкам в 39% случаев. По мнению авторов работы, это не может быть обусловлено случайностью. При этом пустую тарелку крысы стали выбирать в 20% случаев.

Ученые справедливо отмечают, что крысы выбирали пятую тарелку из-за того, что получали хоть какое-то вознаграждение. Но здесь есть нюанс – то есть зверьки забывали, какой запах учуяли при рытье песка, и, чтобы не рисковать, выбирали ту тарелку, которая бы точно обеспечила им хотя бы немного лакомства. Таким образом крысы понимали, что забыли запах, и выбирали вариант, который гарантировал им хотя бы небольшое вознаграждение. Соответственно это и является подтверждением наличия метапамяти у крыс.

У людей с болезнью Альцгеймера или деменцией зачастую наблюдаются проблемы с метапамятью и полученный в данной работе результат может в дальнейшем быть полезным в исследованиях этих заболеваний на крысах. Считается, что болезнь Альцгеймера определяется на 70% генетикой человека, а остальная часть зависит от окружающей среды, образа жизни человека, его состояния здоровья. К примеру, хронический дефицит сна связан с ухудшением памяти и может приводить к развитию этой болезни.

Память у модельных организмов изучается уже длительное время. Например, не так давно стало известно, что при инъекциях мышам плазмы из пуповинной крови человека, у мышей улучшается память и активность гиппокампа. А у кошек находили подобие эпизодической памяти.

источник

Владельцы патента RU 2532525:

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается создания модели болезни Альцгеймера. Для этого используют трансгенных мышей линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J. В кровеносную систему этих животных вводят препарат, содержащий в своем составе синтетический аналог изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида при аминокислотной последовательности DAEFRH[isoD]SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7 [isoD]. Препараты вводят в дозе 100 мкг, в объеме раствора 200 мкл/гол один раз в месяц. Способ обеспечивает возможность произвольного изменения скорости развития патологических процессов у подопытных животных в зависимости от целей конкретного исследования за счет варьирования числа инъекций и/или количества синтетического пептида в одной инъекционной дозе. 1 ил.,1 табл.

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к способу создания модели болезни Альцгеймера, отличающемуся тем, что церебральный амилоидоз у экспериментальных животных вызывается введением в их организм синтетических аналогов изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7.

Болезнь Альцгеймера (БА) является смертельной нейродегенеративной патологией, клиническое протекание которой сопровождается неуклонным упадком психомоторных функций пациента на протяжении длительного периода (1). В России число таких больных составляет около полутора миллионов человек (2). Лекарственных средств, способных остановить течение данной патологии, в настоящее время не существует нигде в мире, однако их поиску придается колоссальное значение во всех развитых странах, где с ростом числа лиц пожилого возраста увеличивается и число страдающих от болезни Альцгеймера.

Характерным молекулярным процессом болезни Альцгеймера является конформационное превращение небольшого (39-43 аминокислотных остатка) белка, бета-амилоида (3). Этот белок является нормальным компонентом крови, где присутствует в виде мономера, однако образует олигомеры и надмолекулярные агрегаты (амилоидные бляшки) у пациентов с клинически диагностированной болезнью Альцгеймера (4). Согласно широко принятой амилоидной гипотезе, именно полимеризация бета-амилоида, которая приводит к церебральному амилоидозу, является ключевым событием, запускающим весь патогенный каскад болезни Альцгеймера (5).

Церебральный амилоидоз представляет собой процесс образования плотных конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах головного мозга и является одним из важнейших нейроморфологических признаков болезни Альцгеймера (6). В настоящее время существует несколько животных моделей болезни Альцгеймера, основанных на использования трансгенных грызунов (мышей, крыс). В этих моделях церебральный амилоидоз обусловлен изменениями в геноме, которые приводят к повышенной экспрессии эндогенного человеческого бета-амилоида (Аβ) в крови (7-9). Мыши и крысы дикого типа в отличие от всех остальных млекопитающих имеют три замены в аминокислотной последовательности бета-амилоида и не подвержены болезни Альцгеймера. Введение синтетических аналогов Аβ в организм млекопитающих не вызывает у них развития церебрального амилоидоза и, соответственно, патогенеза БА. В то же время было показано, что интрацеребральные инъекции гомогенизированных амилоидных бляшек, выделенных из мозга пораженных болезнью Альцгеймера людей, приводили к развитию церебрального амилоидоза у подопытных животных (10-19). Эти данные дали основание считать, что главной движущей силой патогенеза БА является агрегирование эндогенного бета-амилоида под влиянием структурно и/или химически измененной изоформы бета-амилоида, которая содержится в экстрактах амилоидных бляшек (20-21). Тем не менее, несмотря на многочисленные исследования в течение более чем 20 лет ни одна научная группа в мире не смогла найти такую изоформу бета-амилоида. Соответственно, к моменту создания настоящего изобретения ничего не было известно о точной идентификации индуцирующего патологию болезни Альцгеймера агента и, тем более, никому не удавалось создать экзогенно-индуцированную животную модель болезни Альцгеймера

В 2008 году авторами данного изобретения было показано, что изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в положении 7 ведет к цинк-зависимой олигомеризации металл-связывающего домена бета-амилоида (22). Так как амилоидные бляшки содержат до 75% изомеризованного таким образом бета-амилоида и избыток ионов цинка, то нами — первыми и единственными в мире — было предположено, что именно цинковые комплексы этой изоформы бета-амилоида могут являться молекулярным агентом, вызывающим олигомеризацию и последующую агрегацию растворимых форм бета-амилоида, то есть тех самых процессов, которые абсолютным большинством исследователей считаются пусковыми механизмами патогенеза болезни Альцгеймера. Важно отметить, что в работе М. Meyer-Luehmann et al (14) и во всех остальных известных работах нашего времени способность предлагаемого нами агента вызывать церебральный амилоидоз не была проверена. Таким образом, к моменту создания настоящего изобретения никто не был в состоянии обосновано указать, какая изоформа бета-амилоида является инициатором возникновения церебрального амилоидоза, что безусловно указывает на совершенную неочевидность настоящего изобретения.

Настоящее изобретение состоит в экзогенном инициировании церебрального амилоидоза у млекопитающих, которые экспрессируют эндогенный человеческий бета-амилоид в физиологически обусловленных или же искусственно завышенных количествах. В качестве индуцирующего патологию болезни Альцгеймера агента в настоящем изобретении впервые в мире используются инъекции препаратов, содержащих в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида (изоАсп7-бета-амилоида) и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7. Преимуществом таких экзогенно-индуцируемых моделей болезни Альцгеймера по сравнению с существующими в настоящее время конституциональными трансгенными моделями является возможность произвольного изменения скорости развития патологических процессов у подопытных животных в зависимости от целей конкретного исследования. Дополнительным преимуществом данного изобретения является возможность использования в качестве модели болезни Альцгеймера нетрасгенных животных, так как для специалистов в данной области совершенно очевидно, что если молекулярный агент вызывает церебральный амилоидоз у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий бета-амилоид, то этот же агент, а именно — препараты, содержащие в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7, — будет с неизбежностью вызывать церебральный амилоидоз у всех остальных млекопитающих, у которых человеческий бета-амилоид присутствует конституционально.

Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в создании экзогенно-индуцируемой животной модели болезни Альцгеймера. Никаких прототипов данного изобретения не существует нигде в мире, так как лишь в рамках настоящего изобретения впервые показана роль препаратов, содержащих в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7, в качестве индуцирующих патологию болезни Альцгеймера экзогенно-вводимых агентов.

Пример осуществления изобретения.

Для создания экзогенно-индуцируемой модели болезни Альцгеймера нами была использована линия трансгенных мышей B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J (JAX® GEMM® B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J) без специфицированной патогенной микрофлоры. У мышей данной линии имеются следующие изменения в геноме (21):

— Человеческий ген, кодирующий мутированную форму («Шведский вариант», APPswe, K670N/M671L) Белка-предшественника бета-амилоида; эта форма вызывает наследственную болезнь Альцгеймера.

— Человеческий ген, кодирующий мутированную форму (А246Е) Пресенелина 1; эта форма также вызывает наследственную болезнь Альцгеймера.

Оба гена находятся под управлением промотера мышиного прионного белка. Трансгенный продукт был введен в оплодотворенные яйцеклетки мышей линии C57BL/6JXC3HeJF2, успешная линия была выделена и размножена путем обратного скрещивания с мышами линии C57BL/6J на протяжении 14 поколений.

Мыши B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J характеризуются нейропатологическими повреждениями, которые имеют близкое сходство с выявленными у пациентов с болезнью Альцгеймера (амилоидные бляшки, нейрофибриллярные клубки, гибель нейронов, психомоторные нарушения…) и являются коммерчески доступными.

На период экспериментов трансгенные мыши содержались в стерильных условиях (Пущино, филиал ИБОрХ РАН), Все работы с животными проводились с использованием индивидуальных средств защиты (технологическая одежда). Весь использованный в экспериментах расходный материал (шприцы, ампулы, марля, вата), а также трупы павших и эвтаназированных животных подвергались специализированному накоплению и дальнейшей утилизации на станции огневого уничтожения отходов ФИБХ РАН. Для накопления использованных игл применялся контейнер Шарпа. При проведении эксперимента использовались стандартные условия содержания животных в соответствии с Программой по уходу и содержанию животных в ПЛЖ, рассмотренной и одобренной Институтской Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных в июле 2009 года.

В качестве препаратов для инъекций использовались;

— «А»: раствор бета-амилоида в воде (концентрация = 100 мкМ)

— «В»: Раствор изоАсп7-бега-амилоида в воде (концентрация = 100 мкМ)

«Аβ42» (активный компонент препарата «А»): синтетический 42-членный пептид DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA. Аминокислотная последовательность данного пептида соответствует бета-амилоиду человека (Beta-amyloid protein 42, или Аβ42), который является фрагментом 672-713 Амилоидного прекурсорного протеина (Amyloid beta A4 protein, UniProtKB/Swiss-Prot P05067, A4_HUMAN). Средняя молекулярная масса: 4514 г/моль. «[isoD7]-Aβ42» (активный компонент препарата «В»): синтетический 42-членный пептид DAEFRH[isoD]SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA. Этот пептид является [isoD7]-аналогом вещества «Аβ42». Средняя молекулярная масса: 4514 г/моль.

Все используемые вещества и препараты относится к малоопасным химическим веществам (4-й класс опасности).

Учитывая, что средний объем крови у мыши равен 2 мл, а концентрация бета-амилоида в крови трансгенной альцгеймеровской мыши равна 200 нМ, то общее содержание циркулирующего бета-амилоида в этом животном составляет около 0.002·200·10-9=0.4 наномоль = 2000 нг (2 мкг). В соответствие с целью исследований количество вводимого препарата должна быть по меньшей мере в 25 раз выше количества нативного бета-амилоида и, соответственно, должно составлять 25*2000 нг = 50000 нг (50 мкг). Соответственно, концентрация изоформы бета-амилоида в 100 мкл вводимого раствора препарата может быть рассчитана из соотношения:

25·0.200 мкМ·2000 мкл = х мкМ·100 мкл,

и будет составлять 100 мкМ. При этом в 100 мкл вводимого препарата общее количество бета-амилоида составит 50 (пятьдесят) мкг, а в 200 мкл — 100 (сто) мкг.

Возраст животного к первой инъекции = 8-10 недель. Каждый препарат вводился раз в месяц внутривенно в ретроорбитальное венозное сплетение в объеме 200 мкл/гол, всего было проведено по 8 инъекций для каждого животного, последняя инъекция проводилась в возрасте 9 месяцев.

Внутривенная инъекция в ретроорбитальное венозное сплетение у мышей разрешена для проведения в отсутствие анестезии. Для проведения данной процедуры мышь захватывают за кожу шеи большим и указательным пальцами, другими пальцами надежно удерживают за кожу спины и прижимают к сетке для содержания. Иглой шприца прокалывают конъюнктиву внутреннего угла глаза и проводят ее на глубину 1-2 мм за глазное яблоко, где находиться венозное сплетение. При правильном введении в иглу из ретроорбитального сплетения самотеком поступает кровь (при сомнении можно в шприце создать небольшое отрицательное давление). Убедившись в правильности местонахождения, медленно вводится испытуемый препарат. После инъекции стерильной марлевой салфеткой слегка надавливается глазное яблоко с целью остановки кровотечения. Таким способом можно вводить препарат шприцем объемом 1 мл и иглой №27-29G½. Объем вводимого препарата 100-200 мкл/гол. В течение всего эксперимента мыши содержатся индивидуально в клетках Тип-2 с идентификационными табличками, на которых указывается количество животных, название линии, пол, вид и дата манипуляции. Для облегчения боли и стресса при внутривенной инъекции в ретроорбитальное венозное сплетение будет использоваться анестезия. Основные болевые ощущения и стресс связаны с фиксацией и внутривенной инъекцией. По окончании эксперимента в каждой группе эвтаназировались все животные и приготавливались препараты головного мозга. Эвтаназия проводилась в соответствии с Российским национальным санитарным законодательством и Американским законодательством по защите животных углекислым газом согласно утвержденному в комиссии IACUC Протоколу-заявке на манипуляции с животными №09/01.

Морфологический анализ тканей мозга трансгенных животных проводился с помощью гистохимических методов, описанных ниже.

Покрытие предметных стекол желатиной с алюмохромовыми квасцами — 2 г желатина растворялось в 400 мл дистиллированной воды, с нагреванием раствора до 55°C при постоянном помешивании. После растворения добавлялось 0,2 г алюмохромовых квасцов и раствор хорошо перемешивался. Раствор нагревался до 60°C для покрытия предметных стекол. Стекла высушивались в течение суток перед использованием.

Фиксация мозга — Мозг мыши вынимается из черепной коробки и помещается в свежеприготовленный раствор 4% параформальдегида в фосфатном буфере (pH 7,4) на шесть суток с трех разовый сменой раствора через двое суток. На седьмые сутки, непосредственно перед изготовлением срезов, мозг помещается на шестеро суток в 30% раствор сахарозы с трехразовой сменой раствора через двое суток.

Изготовление срезов — Мозг мыши извлекается из раствора сахарозы, промакивается фильтровальной бумагой и покрывается средой для заморозки (например Tissue-Tek® ОСТ Compound, компании Thermo). Далее мозг замораживался либо на элементе Пельтье, которым снабжен криотом фирмы Thermo, либо в жидком азоте. После заморозки мозг помещался в криотом и делались срезы толщиной в 30 микрон. Срезы помещались на предметное стекло, покрытое желатином, и подвергались гистологическому окрашиванию.

(1) Окрашивание гематоксилиом по Майеру: Срезы последовательно по 2 минуты дегидратируют в 100%, 96% и 70% спирте и помещаит на 2 минуты в воду. Затем препараты помещают на 30 мин в раствор гематоксилина, примывают водой и проявляют в ТАР воде до появления синего окрашивания.

(2) Окрашивание амилоидных бляшек спиртовым раствором Конго-красным; Срезы, предварительно дегидратированные в спиртовых растворах и окрашенные гематоксилином по Майеру, инкубируются в насыщенном 80% спиртовом растворе NaCl, содержащим 1% одного процентного NaOH, в течение 20 минут. Затем Препарат помещается в раствор Конго-красного, содержащего 1% одного процентного NaOH, в течение 20 минут. Препараты два раза по 5 минут дегидратируют в 100% спирте, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Визуализация амилоидных бляшек розового цвета проводится в проходящем свете и подтверждается в поляризационном. Для одновременного окрашивания амилоидных и клеточных структур был применен подход с окрашиванием клеток гематоксилином по Майеру и бляшек Конго-красным.

Число конгофильных амилоидных бляшек подсчитывалось вручную с помощью светового микроскопа в поляризованном свете. Результаты сравнительного анализа показали (Таблица 1, Рисунок 1), что число бляшек у мышей, инъецированных препаратом синтетического аналога изомеризованного по аспратату-7 человеческого бета-амилоида значительно превышает число бляшек у контрольных животных, которым вкалывался препарат, содержащий интактный бета-амилоид, что однозначно свидетельствует о способности изомеризованного по аспратату-7 человеческого бета-амилоида вызывать церебральный амилоидоз у соответствующим образом обработанных животных.

Способ создания модели болезни Альцгеймера, заключающийся во введении в кровеносную систему трансгенным мышам линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J препарата, содержащего в своем составе синтетический аналог изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида при аминокислотной последовательности DAEFRH[isoD]SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) и/или его фрагмент, включающий остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7 [isoD], в дозе 100 мкг, вводимой в объеме раствора 200 мкл/гол один раз в месяц.

источник

Гость Редактор: Б. О. Попеску

Эти авторы внесли одинаковый вклад.

В качестве модели болезни лабораторная крыса в течение многих лет внесла огромный вклад в исследования нейронауки. Он также был популярной моделью животного для болезни Альцгеймера, но ее популярность уменьшилась в течение последнего десятилетия, поскольку методы генетической манипуляции у крыс отставали от мышей. В последние годы крыса делает возвращение в качестве модели болезни Альцгеймера, и появление растущего числа трансгенных крыс станет долгожданным и ценным дополнением к существующим моделям мыши. В этом обзоре обобщены вклад и текущий статус крысы в ​​качестве животной модели болезни Альцгеймера.

Крысиные модели холинергической функции

Тройная трансгенная крыса

Трансгенные крысы APP21 и APP31

Трансгенные крысы — сводка

Вирулярно индуцированные модели AD

Болезнь Альцгеймера (AD) характеризуется прогрессирующим когнитивным снижением, когда память о последних фактах, пространственной ориентации, внимания и исполнительных функциях являются первыми затронутыми. За этим следуют речевые и поведенческие проблемы, которые влияют на повседневную жизнь [1]. Патологические изменения в головном мозге, которые определяют заболевание, представляют собой обильные внеклеточные амилоидные бляшки и внутриклеточные нейрофибриллярные клубочки (NFT), сопровождающиеся синаптической и нейронной потерей и воспалением головного мозга [2-5]. Амилоидные бляшки состоят в основном из агрегированного амилоида-β-пептида (Aβ) [6, 7], который получают путем протеолитического расщепления из белка предшественника амилоида (APP) [8]. Пептид Aβ может состоять из 39-43 аминокислотных остатков, но две основные формы: Aβ40, составляющие

90% всех Aβ, высвобождаемых из клеток, и более длинный Ap42 составляет всего

10%. Ap42 является более гидрофобным и более склонным к агрегации, чем Aβ40 [9], и является преобладающей формой, обнаруженной в амилоидных бляшках AD [10]. NFT состоят из агрегированной формы гиперфосфорилированного микро-tubule-ассоциированного белка, tau [11].

Хотя причина AD по-прежнему является предметом значительных дебатов, так называемая гипотеза амилоидного каскада остается наиболее определенной и наиболее изученной концептуальной основой болезни [12]. Эта гипотеза основана на патологических характеристиках и генетике болезни [13, 14]. На сегодняшний день в генах, кодирующих APP, пресенилин 1 (PS1) и пресенилин 2 (http://www.molgen.ua.ac), обнаружено около 200 мутаций, вызывающих наследственную раннюю начальную форму AD (семейный AD; FAD) . be / ADMutations). Пресенилины участвуют в обработке APP, и мутации во всех трех белках приводят к изменению продуцирования Aβ. Хотя детали гипотезы амилоидного каскада развивались с момента ее первого предложения, ее основной принцип остается по существу неизменным в том, что Ap-пептиды являются основной причиной AD. Поэтому неудивительно, что многие антиамилоидные и другие нейропротекторные терапевтические подходы в настоящее время изучаются [15].

Модели животных предлагают ценные инструменты для оценки новых терапевтических стратегий лечения заболеваний человека, а также для изучения патологических механизмов, связанных с болезненными процессами. Из-за отсутствия полного понимания этиологии AD все имеющиеся модели имеют ограничения, которые необходимо тщательно учитывать при их использовании. Нет никаких естественных моделей AD, поэтому большая часть исследований проводится с использованием моделей, имитирующих фенотипы болезни путем активных манипуляций с животными, или совсем недавно с использованием трансгенных моделей животных. Для моделирования различных аспектов АД использовались многочисленные виды животных. Первоначально крыса была предпочтительным видом, но в течение последнего десятилетия растущее знание передовых генетических методов, разработанных у мышей, в дополнение к обнаружению генных мутаций, вызывающих семейные формы AD, позволило генерировать все большее число трансгенных мышь. Достаточно полный список моделей трансгенных мышей, актуальных для AD, постоянно обновляется на домашней странице Исследовательского форума Alzheimer (http://www.alzforum.org/res/com/tra/default.asp). Но в последние годы крыса возвращается в качестве модели AD. Этому есть несколько причин. секвенирование генома крысы, последние разработки в области технологий для борьбы с геномом крыс и слабой прогностической мощи моделей мыши для эффективности лекарств у людей.

Крыса была первым видом млекопитающих, одомашненным для научных исследований более 180 лет назад [16]. С тех пор он был одним из наиболее изученных модельных организмов, особенно в исследованиях сердечно-сосудистой, онкологической, токсикологической, поведенческой, нейродегенерации и старения [17]. Селективное размножение привело к созданию более 200 инбредных штаммов крыс, моделирующих различные аспекты заболеваний человека [18]. Вклад крысы в ​​здоровье человека нельзя переоценить [16], и он был организмом выбора для большинства физиологических и поведенческих исследований на протяжении десятилетий. Поведенческие ученые предпочитают крысу, потому что это умный и быстрый ученик, тогда как физиологи используют тот факт, что физиологические процессы похожи на крыс и людей. Кроме того, крысы достаточно велики для удобных физиологических измерений [19]. Генетики, с другой стороны, предпочитают мышь, которая меньше и легче манипулирует генетически [20]. Поскольку мышь оказалась легче манипулировать генетически, чем крыса, она стала наиболее распространенным модельным организмом млекопитающих в области трансгенных исследований. Но, что мышь генетически генетически, они часто испытывают недостаток в физиологическом понимании, причем исследователи часто экстраполируют данные крыс [21].

Одной из важнейших особенностей животной модели AD является способность анализировать память и познание в поведенческих тестах. Различия между поведением крыс и мышей намного больше, чем многие люди понимают, хотя большинство задач могут выполняться обоими видами [22]. По сравнению с крысой мышь демонстрирует более простой поведенческий репертуар и гораздо меньшую гибкость при работе с новыми ситуациями. Поэтому мышь создает проблему для нейроповеденческих исследований, так как это вид, функционирующий на низком уровне сложности по сравнению с крысой [23]. Недавно было показано, что крысы могут принимать адаптивные решения о будущем поведении, зависящем от имеющихся в настоящее время знаний. Эта способность, чтобы отразиться на собственных психических процессах, называется метапознанием и ранее считалась уникальной для приматов [24, 25]. В исследованиях нейронауки крыса предлагает хорошие технологические возможности для нейрохирургических / стереотаксических манипуляций, нейровизуализации, гистопатологии, электрофизиологических записей или серийного отбора проб спинномозговой жидкости. Было показано, что в случае гипертонии, атеросклероза, патологии ВИЧ, болезни Хантингтона или моделирования активации системы комплемента, модели крысы более точно представляют человеческую патологию, чем аналогичные модели мыши [26-30].

Некоторые из вкладок, которые сделала крыса в область исследований AD, приведены ниже, и обсуждаются недавно доступные трансгенные крысы.

Ранние открытия 1960-х годов, демонстрирующие вредные эффекты лекарств, которые блокируют холинергическую активность, такие как атропин и скополамин, на память у крыс, а также параллельные доказательства холинергической дисфункции в AD, впоследствии привели к формулировке «холинергической гипотезы о гериатрической дисфункции памяти» [31, 32]. С того времени для изучения роли холинергической системы в когнитивной функции использовались различные подходы к индуцированию холинергических поражений у крыс [33, 34]. Наиболее часто используемые нейротоксины включают в себя нейротрансмиттеры возбуждающих аминокислот, такие как глутамат и его аналоги (иботенат, N-метил-d-аспартат [NMDA], каинат, квинквалат и альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изокс- азопропионовая кислота [AMPA]), токсин AF64A, специфичный для холинергических нейронов, или антагонисты мускариновых рецепторов скополамина и атропина [35]. В 1990 году для моделирования медленной эволюции нейродегенеративных заболеваний, в том числе AD [36, 37], была разработана хроническая модель крысы с непрерывным внутричерепно-мозговым вливанием хинолиновой кислоты. Непрерывная инфузия хинолиновой кислоты при низких дозах в боковой желудочек вызывает снижение активности гиппокампа и кортикальной холиновой ацетилтрансферазы у крыс. Поскольку некоторые из ранних пораженных нейронов в головном мозге AD являются холинергическими нейронами базального переднего мозга [38, 39], генерация иммунотоксина 192IgG-сапорина, который специфически нацеливается на рецептор с низким сродством нейротропина крысы p75, экспрессирующий холинергические клетки базального ядра Meynert (или крысиное эквивалентное ядро ​​basalis magnocellularis) и медиальная перегородка, позволили более адекватное моделирование заболевания [40, 41]. Аналогичным образом, выборочное разрушение зависимых от холинергических нейронов перегородки нервного роста (NGF), обусловленное холинергическими нейронами перегородки, достигалось путем прямой интрасекционной инфузии антител против NGF [42]. Дефицит памяти, полученный во всех этих моделях, был аналогичен дефициту памяти, наблюдаемому в AD, поддерживая представление о том, что функциональные холинергические пути важны для памяти и познания и прокладывают путь для лечения холинергической терапии для AD. После первоначальных неудачных испытаний с предшественниками ацетилхолина холин и лецитин ингибиторами ацетилхолинэстеразы (донепезил, ривастигмин, галантамин) стали широко используемые препараты для симптоматического лечения этого заболевания [32, 43].

Открытие того, что Aβ является основной составляющей характерных амилоидных бляшек в мозге пациентов с АД [6, 7] и токсично для нейронов [44, 45], привело к in vivo исследованиям влияния Aβ в головном мозге. Острый нейродегенеративный эффект Aβ и амилоидных сердечников из головного мозга пациентов с AD был продемонстрирован in vivo уже в 1991 году, когда эти вещества были введены в мозг двух разных моделей крыс [46, 47]. В обоих случаях значительная индукция аномального тау-фосфорилирования наблюдалась в непосредственной близости от иммунореактивных сайтов Aβ. В последующие годы несколько лабораторий сообщали о противоречивых результатах острой инъекции или непрерывных вливаниях Aβ непосредственно в мозг крысы. В то время как многие группы продемонстрировали нейротоксичность, AD-подобный астроглиоз, гиперфосфорилирование тау [48-53] и / или снижение памяти в экспериментальных моделях [51, 53-57], другие не показали значительного влияния пептидов [58-60]. Аналогичным образом, противоречивые результаты были получены в аналогичных экспериментах, выполненных на макаках-резусах [61, 62]. Большая часть дисперсии полученных результатов зависела от природы пептида (фибриллированного или растворимого А) или используемого растворителя, концентрации раствора и способа введения (одиночные инъекции или непрерывные вливания в разные периоды времени в желудочки крыс, гиппокамп или септум), возраст обработанных животных (молодые против старых) и временные рамки, когда оценивались эффекты (немедленные или долгосрочные эффекты). Больше моделей, демонстрирующих ухудшающееся действие Aβin vivo, последовало в 2000-х годах, доказывая, что это по-прежнему жизнеспособный подход для моделирования различных аспектов патологии AD. Эти модели, например, использовались для тестирования защитных эффектов экстрактов гинкго билоба, докозагексаеновой кислоты (ДГК), женьшеня, эстрадиолов, зеленого чая, синтетических когнитивных энхансеров или антиоксидантов [63-70] и ухудшающихся эффектов хронического стресса [ 71] на память у крыс, которым вводили / инфузировали Aβ. В 2007 году Takata и др. [72] показали, что экзогенные микроглии, трансплантированные в мозг крыс, микроинъектированных Aβ, участвуют в очистке Aβ.

Недавно сообщалось об изменении модели инфузии Aβ [73]. В этой модели Аβ объединяли с индукторами окислительного стресса, чтобы индуцировать гибель нейронов, отложения амилоидов, глиоз и нарушение памяти после 4-недельного внутрибрюшечно-желудочкового вливания. Окислительный стресс индуцировали с использованием прооксидативного катиона Fe2 + и ингибитора синтеза глутатиона бутионинсульфоксимина (BSO). Эта модель теперь доступна через коммерческого поставщика.

Первые трансгенные модели AD, укрывающие человеческий APP с FAD-каузативными мутациями, появились более десяти лет назад [74, 75]. Эти модели были созданы у мышей, но одновременно были предприняты безуспешные попытки разработать AD-трансгенных крыс [76, 77]. Сегодня многие линии трансгенных мышей показывают присутствие амилоидных отложений, которые прогрессируют с возрастом. Synaptic и потеря нейронов значительно отличаются между различными линиями и поведенческим тестированием также подвергаются различной степени дефицита в ссылках и задачу работе памяти [78, 79]. Общей чертой этих моделей является отсутствие NFT; только мыши, выражающие мутированный человеческий тау, развивают патологию путаницы. Несмотря на то, что у пациентов с AD не было зарегистрировано никаких тау-мутаций, они также вызывают другие нарушения деменции, такие как лобно-временная деменция, связанная с хромосомой 17 (FTDP-17), доказывая, что тау-дисфункция может вызвать ухудшение памяти. Данные этих моделей позволили лучше понять биофизические и патологические свойства тау-полимеров при деменции [80, 81]. В целом, модели трансгенных мышей внесли большой вклад в наше понимание патогенеза AD и исследований возможных терапевтических стратегий.

В последние годы были созданы несколько генетически манипулируемых линий мыши: не только трансгенные, но и нокаутированные, нокаутированные и условные мутантные штаммы (в которых гены могут быть удобно отключены и включены). До недавнего времени это было невозможно для крыс из-за невозможности выделения эмбриональных стволовых клеток крыс, которые обычно использовались для генетических манипуляций [19]. Тем не менее, возрастающая эволюция методов трансгенного, целевого мутагенеза и клонирования открыла путь для генерации генетически управляемых линий крыс [82, 83]. В то время как первая трансгенная крыса появилась уже в 1990 году, трансгенные модели крыс нейродегенеративных заболеваний человека начали появляться только в 2000-х годах, и первое заражение нокаутом крыс было зарегистрировано в 2003 году [30, 84-87]. В течение последних нескольких лет появились несколько моделей с одним и несколькими трансгенами крысы (таблица 1). Будучи доступным в течение более короткого времени, трансгенные модели крыс AD еще не так хорошо характеризуются как многие линии мыши в отношении патологии и ухудшения памяти, но они предлагают многообещающую новую эру для фармакологических исследований AD. Ниже приведен краткий обзор моделей трансгенной крысы APP, которые были опубликованы до настоящего времени.

Модели трансгенных крыс болезни Альцгеймера

APPswe, APP с «шведской» мутацией K670N / M671L; APPind, мутация V717F ‘Индиана’; PS1 Finn, PS1 с финской мутацией M146L; hTau усечен, человеческий тау усечен в положениях аминокислот 151-391; PDGF, фактор роста тромбоцитов; PrP, промотор прионов; Thy1, промотор антигена 1 дифференцировки тимоцитов; P-тау, фосфорилированная тау иммунореактивность; SHR, спонтанно гипертензивная крыса; Nr, не сообщается.

Первой трансгенной крысой APP, которая должна быть опубликована, была крыса TgAPPswe от Ruiz-Opazo et al. в 2004 году [88]. Эти крысы Fisher-344 чрезмерно экспрессировали конструкцию миниген-кДНК с человеческим APP, содержащим шведскую мутацию AD (K670N, M671L), приводимую промотором фактора роста тромбоцитов (PDGF). Увеличение экспрессии APP было низким, только 56,8% на уровне мРНК. Уровни Aβ в головном мозге были увеличены на 21% для Aβ42 и 6% для Aβ40 в возрасте 12 месяцев. У этих животных не было обнаружено патологий, связанных с AD, до возраста 18 месяцев. Удивительно, но крысы TgAPPswe значительно улучшились в водном лабиринте Морриса, чем контрольные группы в возрасте 6 и 12 месяцев. Хотя крысы TgAPPswe не являются образцом AD, результаты, несомненно, вызывают вопросы, касающиеся физиологической роли APP и его производных в учебе и функциях памяти.

В том же году, что и крыса TgAPPswe, была опубликована серия статей о двойной трансгенной линии крыс Wistar UKUR25 [89-92]. Крысы UKUR25 выражают человеческий APP, содержащий мутации в Швеции и Индиане (V717F), и мутировали PS1 (M146L). Обе конструкции были инициированы промотором PDGF. Главным патологическим признаком в мозге этих животных, видимым после 6-месячного возраста, было накопление Aβ внутриклеточно в нейронах гиппокампа и коры. Однако уровни Aβ в головном мозге не сообщаются. У этих животных до 24-месячного возраста не наблюдалось внеклеточного амилоида. Поведенческий анализ 7- и 16-месячных крыс UKUR25 показал умеренное ухудшение в обучении по приобретению у 16-месячных самцов крыс. После изучения обучения платформа была перемещена, и крысы должны были изучить новое место. Не было существенной разницы между трансгенциями и элементами управления в этой задаче. В возрасте 9 месяцев наблюдалось увеличение активного фосфо-ERK2 в мозге крысы UKUR25, что сопровождалось увеличением уровней тау-фосфорилирования на сайтах S396 и S404 ERK2 (признанных антителом PHF-1). Отсутствие какой-либо внеклеточной патологии вместе с мягким поведенческим фенотипом может ограничить использование этой трансгенной крысы в ​​исследовании AD.

В 2007 году Folkesson et al. [93], опубликованном на трансгенной линии крыс Tg6590, которая экспрессирует APP человека с помощью шведской мутации, вызванной промотором ubiquitin. Линия крыла Tg6590 показывает главным образом нейронную экспрессию белка APP человека с самыми высокими уровнями, обнаруженными в коре, гиппокампе и мозжечке. Эти крысы развивали умеренную внеклеточную иммунореактивность Aβ, но не имели компактных зрелых амилоидных отложений. Уровни Ap42 и Aβ40 увеличены до такой же степени, как и ожидалось из-за используемой мутации [94]. Уровни обоих видов Aβ увеличены на 65% в гиппокампе и 40% в коре 11-месячных животных. Крысы Tg6590 демонстрируют дефицит обучения и памяти в водном лабиринте Морриса в возрасте 9 месяцев и изменяют спонтанное поведение, измеряемое в открытом поле [94]. Как и в некоторых моделях мыши APP, эти изменения поведения наблюдаются до появления каких-либо амилоидных отложений. Подобно линии UKUR25, наблюдается очевидное увеличение фосфорилированного тау на участке PHF-1 в мозге крысы Tg6590, но увеличение не достигает статистической значимости. Культурные первичные нейроны гиппокампа из этой линии показывают сложные изменения гомеостаза кальция, которые потенциально могут играть роль в нарушениях обучения и памяти, наблюдаемых у этих животных [95, 96]. Хотя линию Tg6590 необходимо охарактеризовать в терминах возникновения и прогрессирования поведенческих фенотипов, она представляет собой перспективную модель для передовых исследований поведения.

К концу 2007 года Flood et al. [97] опубликовал статью о новых линиях трансгенных крыс, которые были разработаны в Cephalon, Inc. и впервые были описаны в реферате в 2003 году [98]. В этой статье были скрещены две линии крыс Sprague-Dawley с трансгенами, экспрессирующими APP человека. Линия Tg478 выражает человеческий APP со шведской мутацией, управляемой промотором синапсина крысы. Линия Tg1116 выражает человеческий APG-миниген, содержащий мутацию со шведской мутацией и семейными мутациями AD. Полученные двойные гомозиготные крысы продуцируют достаточное количество Aβ для осаждения амилоида в возрасте 17-18 месяцев. Это уменьшалось до 7-месячного возраста путем скрещивания в третьей линии трансгенных крыс с переносчиком PS-1 человека с семейной мутацией AD M146V (Tg11587). Тройную гомозиготную трансгенную крысу Tg478 / Tg1116 / Tg11587 также называют крысой PSAPP Tg [99]. Амилоидные отложения в этой модели аналогичны тем, которые наблюдаются в некоторых моделях мыши, и обнаруженные компактные амилоидные отложения связаны с активированными микроглиями, реактивными астроцитами и фосфорилированной тау-иммунореактивностью [99]. Эти тройные трансгенные животные проявляли дефицит в задачах лабиринта Морриса с 7-месячного возраста, но как в поведенческих тестах с открытым полем, так и при повышении плюс лабиринта тройная трансгенция не отличалась от контролей [99]. Это первая трансгенная крыса для развития обширных амилоидных отложений, но грубая избыточная экспрессия нескольких трансгенов ставит чрезмерную нагрузку на организм, и эта линия крысы, как было показано, подвержена преждевременной смерти из-за проблем со здоровьем, таких как хронические заболевания почек, гипертония и иммуносупрессия [100].

В прошлом году сообщалось о двух дополнительных трансгенных крысах APP [101]. Эти линии были получены путем лентивирусной векторной инфекции зиготов Фишера 344. Полученные трансгенные линии крыс, APP21 и APP31, экспрессируют человеческую APP двойную мутантную конструкцию, содержащую мутанты AD из Швеции и Индианы, приводимые в действие промотором ubiquitin-C. Сообщается, что трансген APP экспрессируется в мозге, в нейронных, но не глиальных клетках. Патологические или поведенческие исследования еще не опубликованы.

Подобно моделям AD для мыши, трансгенные крысы APP или APP / PS1 не показывают NFT. Единственной моделью грызунов с тау-патологией, специально относящейся к AD, является трансгенная крыса, разработанная группой Новака [102]. В отличие от многих моделей мышиного тау, которые переносят tau мутации, характерные для других заболеваний деменции, чем AD, эта трансгенная крыса выражает усеченную форму белка тау человека (усеченного в положениях аминокислоты 151-391), который находится в мозге спорадических пациентов с АД. Интересно, что усеченный тау индуцирует нейрофибриллярную агрегацию и уменьшает продолжительность жизни животных, не вызывая каких-либо измеримых потерь нейронов в гиппокампе или стволе головного мозга [102, 103]. Это отсутствие потери нейронов может быть объяснено неадекватно долгой продолжительностью жизни животного. Эти трансгенные крысы показывают измененную пространственную навигацию в водном лабиринте Морриса, в то время как спонтанная двигательная активность и беспокойство в открытом поле не затрагиваются. Тем не менее, испытание лучевой ходьбы указывает на развитие прогрессирующих сенсомоторных нарушений, связанных с возрастом животного [104]. Насколько нам известно, интересный крест между этими трансгенными крысами тау и трансгенной крысой APP еще не сделан.

В общем, линии трансгенных крыс APP показывают более низкие уровни экспрессии трансгена APP, чем мышиные AD-модели, и в большинстве случаев только умеренное или отсутствие отложения Aβ в головном мозге, что может указывать на то, что обработка APP под более строгим контролем у крыс по сравнению для мыши, и, возможно, более эффективный клиренс Aβ. Чтобы получить обширные внеклеточные амилоидные отложения в модели крысы, было необходимо введение двух мутантных APP-конструкций и одного мутированного PS1 [97]. Как и у мышей, отложение амилоида, по-видимому, не является необходимым условием нарушения памяти у трансгенных крыс. Как UKUR25, так и двойные трансгенные APP / PS1 [91] и одиночные APP трансгенные линии Tg6590 крысы [93] показывают ухудшение обучения и памяти в отсутствие грубой патологии амилоидов (таблица 1). Даже упомянутая выше тройная трансгенная крыса показывает нарушения памяти до появления амилоидных бляшек [99]. Эти результаты согласуются с растущим представлением о том, что олигомеры Aβ могут быть злодеем в процессе болезни; также растворимый Aβ лучше коррелирует с ухудшением памяти в AD, чем его агрегированные формы [105].

Независимость от деления Aβ и дефицита памяти Aβ была рассмотрена в двух новых моделях крыс AD, в которых вирус-опосредованный перенос генов был использован для индукции экспрессии APP со шведской мутацией или фрагментами Aβ выборочно в гиппокампе взрослых крыс. Гонг и др. [106] продемонстрировали, что шведские мутированные APP трансфецированные крысы, демонстрирующие иммунореактивность Aβ42 в непосредственной близости к местам инъекции, но без бляшек или признаков нейротоксичности до 15 месяцев после трансфекции, нарушали удержание памяти в пробной фазе задачи Морского водного лабиринта. В другой вирально индуцированной модели крысы кДНК, кодирующие слияние между человеческим Aβ40 или Aβ42 и белком BRI, который участвует в отложении амилоида в британской и датской семейной деменции, были введены в гиппокамп взрослых животных [107]. Только введенные животные BRI-Aβ42 показали диффузные структуры, подобные бляшке, в гиппокампе через 3 месяца после инфузии, но не выявили ухудшения в тестах на открытом поле или в лабиринте воды. С другой стороны, животные, введенные как BRI-Aβ42, так и BRI-Aβ40, проявляли умеренные изменения поведения, но не показали внеклеточных отложений Aβ, подтверждающих данные, показывающие, что осаждение Aβ не требуется для поведенческих нарушений в моделях грызунов.

Крыса является одним из наиболее часто используемых экспериментальных видов животных в биомедицинских исследованиях, и из-за ее значимости для физиологии человека крыса может обеспечить очень предсказуемые модели исследований и фармацевтической промышленности [108]. Наличие новых генетических исследовательских инструментов у крыс дает значительные успехи в областях, где широко используются крысы. В исследовании AD крыса десятилетиями была очень важной моделью, например, в исследованиях по холинергической дисфункции и нарушениях памяти, которые сыграли решающую роль в разработке препаратов ингибитора холинэстеразы, которые в настоящее время используются. Привлекательность крысы как экспериментальной модели на животных была еще более увеличена за счет наличия данных генома крыс и технологий, позволяющих генетическую манипуляцию у крыс. В последние годы сообщается о нескольких трансгенных крысах в качестве моделей для AD и разрабатываются новые модели. Мы считаем, что в ближайшие годы трансгенные крысы станут долгожданным и ценным дополнением к доступным моделям мыши в исследованиях AD.

источник

Фотографии Ильнара Салахиева

Болезнь Альцгеймера не претендует на звание чумы XXI века, тем не менее в мире насчитывается более двадцати пяти миллионов больных. А к середине столетия их число может увеличиться вчетверо. Старший научный сотрудник сектора молекулярных механизмов старения Института цитологии и генетики СО РАН Наталья Стефанова рассказала корреспонденту Сиб.фм о гипотезах развития болезни Альцгеймера, сложностях постановки диагноза, особенностях выведенной модели крыс OXYS, комплексе признаков старческих заболеваний у них и перспективах исследований в этой области.

Несмотря на огромное количество новостей о болезни Альцгеймера, в том числе около- или псевдонаучных, в России ей пока уделяют недостаточное внимание. А количество больных увеличивается с каждым годом. Пока механизмы заболевания до конца не изучены, гипотез появляется много — но это в научных кругах. Если с болезнью сталкиваются родственники, то возникают этические сложности.

Примеров вокруг, оказывается, достаточно, но не все готовы об этом говорить. Что вполне понятно.

Исследования, которые ведутся для поиска причины развития болезни, разработки эффективных методов диагностики на ранних стадиях и лечения, дорогостоящи и трудоёмки. Больше возможностей имеют зарубежные учёные. Но и в Новосибирске есть небольшая группа учёных, которая изучает механизмы развития болезни Альцгеймера на крысах и получает впечатляющие результаты, наравне с коллегами из других стран.

Коллектив сектора молекулярных механизмов старения Института цитологии и генетики СО РАН любит своё дело и своих уникальных крыс.

Это видно по тому, как они ласково называют их «крысиками». Именно «крысики» помогают людям в поисках причин развития болезни Альцгеймера.

О работе сектора рассказала Наталья Стефанова. Её докторская диссертация как раз была посвящена характеристике крыс OXYS как модели болезни Альцгеймера.

Деменция — приобретённое слабоумие: снижение познавательной деятельности, утрата усвоенных знаний и затруднение или невозможность приобретения новых

Болезнь Альцгеймера по сути можно назвать одним из видов старческой деменции. Именно из-за этого сейчас, как и в начале XX века, когда болезнь только установили, иногда возникают сложности с постановкой диагноза?

Да. Немецкий психиатр и невропатолог Алоис Альцгеймер в 1907 году выступил со знаменитой лекцией о том, что у одной из его пациенток развивалась странная форма деменции, которая сопровождалась не только потерей памяти, но и дезориентацией, галлюцинациями, агрессией и в конечном счёте привела к смерти. Постмортальное исследование её мозга показало наличие «особенной субстанции» в виде бляшек и нейрофибриллярных клубков.

Позже по фамилии этого психиатра назвали заболевание, которое развивалось у людей рано — до 65 лет, чаще до 40–50 лет; случаи заболеваемости этой формы деменции были крайне редки. Если люди были старше этого возраста, то говорили просто о старческой деменции. Только в 1976 году из-за сходности клинических и нейропатологических проявлений было предложено объединить эти две формы заболевания в одно и назвать болезнью Альцгеймера, несмотря на возраст больных.

Но всё равно и сейчас из-за сложности диагностирования болезни такой диагноз ставят в редких случаях, наиболее распространено понятие старческой деменции.

Принципиально важно, что в отличие от многих других нейродегенеративных заболеваний, проблемы раннего диагностирования болезни Альцгеймера обусловлены прежде всего сходством проявлений снижения памяти у людей при нормальном старении и при наличии заболевания. Так, незначительные нарушения памяти на недавние события, трудности в запоминании новой информации — это ранние симптоматические проявления болезни Альцгеймера. Прогрессирующее ухудшение памяти, интеллекта в течение последующих лет, протекающие на фоне атрофии мозга, приводят к полному распаду личности и фатальному исходу, как правило, от различного рода осложнений, например, лёгочной пневмонии.

Количество людей с болезнью Альцгеймера с каждым годом растёт, но, к сожалению, пока наука немного отстаёт. Причины заболевания всё ещё не известны, верно?

Да, это самое распространённое нейродегенеративное заболевание в мире. Эффективных способов профилактики и лечения болезни Альцгеймера нет, заболеваемость растёт по мере увеличения продолжительности жизни и старения населения развитых и развивающихся стран. К концу первой декады этого века, по данным ВОЗ, болезнью Альцгеймера в мире болели более 35 миллионов человек, в 2015 году — уже 51 миллион.

И, по прогнозам, к 2050 году количество таких больных удвоится.

66 лет прожил писатель Терри Пратчетт. В 2007 году ему диагностировали редкую форму болезни Альцгеймера — заднюю кортикальную атрофию, от которой он впоследствии и скончался

Механизмы болезни стали исследовать не так давно — в начале 90-х годов, когда были выявлены мутации сначала в одном гене, потом ещё в двух.

Различают две формы заболевания — наследственную и спорадическую. На сегодня известно, что мутации в трёх генах становятся причиной развития наследственной формы. 95 % случаев в мире — это спорадическая форма, а моделей, которые бы позволяли её изучать, нет. Принципиальным фактором риска в таком случае становится пожилой возраст, но причины появления спорадической формы остаются не известны.

Известно, за что отвечают три гена, мутации в которых являются причиной появления наследственной формы болезни?

О накоплении «особенной субстанции» в виде бляшек в мозге, в частности на стенках мозговых сосудов, людей с деменцией было известно с конца 20-х годов XX века, однако вплоть до 80-х неизвестному пептиду отводили лишь роль вторичного продукта при нарушениях функций иммуноглобулинов.

Только в 1984 году было обнаружено, что основными в составе «особенной субстанции» становятся маленькие пептиды.

Учёные предположили, что пептид, названный бета-амилоидом, является продуктом большого белка предшественника, который вскоре был идентифицирован (amyloid precursor protein, АРР).

Было обнаружено, что уровень и молекулярный состав бета-амилоида в мозге людей с болезнью Альцгеймера и когнитивно здоровых людей различен. На основании этого было выдвинуто предположение, что изменение содержания бета-амилоида в мозге может быть ассоциировано с болезнью Альцгеймера. Прорывом в понимании этиологии заболевания явилось использование генетических подходов. В 1991 году было обнаружено, что раннее наследственное развитие болезни Альцгеймера у пациентов из шести семей характеризуется наличием мутации гена на хромосоме 21. Было выявлено, что этот ген кодирует белок АРР, маленькие белки которого (бета-амилоид) составляют основу сенильных бляшек.

Пресенилины — семейство белков, составляющих часть протеазного комплекса γ-секретазы. В геноме позвоночных содержатся два гена, кодирующих пресенилины. Оба гена эволюционно консервативны — отмечены лишь небольшие отличия между пресенилинами крысы и человека

Не менее значительным событием в начале 90-х годов стало обнаружение также у больных с ранним началом наследственной формы заболевания — мутаций в генах, получивших название генов-пресенилинов, PSENs, которые становятся причиной увеличения продукции бета-амилоида и развития болезни. Физиологические функции белка АРР до сих пор остаются недостаточно изученными, однако считается, что он необходим для нормального развития нервной системы млекопитающих, выживания и восстановления нейронов после повреждений. Функции белков пресенилинов в норме и в результате мутаций кодирующих их генов остаются мало изученными.

Мутации в генах изучали на мышах и крысах?

На основании выявленных генетических факторов развития болезни Альцгеймера для раскрытия молекулярно-генетических механизмов заболевания в течение 90-х годов начали интенсивно создаваться линии трансгенных мышей — моделей наследственной формы заболевания с мутациями в трёх генах. У этих животных развивались амилоидные бляшки в мозге, нарастающие с возрастом нарушения поведения и снижение популяции нейронов в гиппокампе. На крысах такие исследования практически не проводились.

Моделей спорадической формы болезни Альцгеймера практически нет, а наша линия крыс именно такая. Это очень важно.

Как была создана линия крыс, с которой вы работаете?

Линию крыс OXYS создали в нашем Институте цитологии и генетики СО РАН. Её история берёт начало в 70-е годы ХХ века, когда у крыс с нормальным темпом старения моделировали наследственную галактоземию. Для этого в пяти первых поколениях развитие катаракты вызывали обогащённой галактозой диетой. В дальнейшем уже без нагрузки галактозой, сыгравшей, по-видимому, роль мутагена, у крыс, помимо катаракты, спонтанно развивались кардиомиопатия, сколиоз, эмфиземы, предраковые состояния и некоторые биохимические признаки галактоземии. Но анализ развития этих признаков был выполнен в основном на фоне нагрузки галактозой в ближайших либо последующих поколениях животных.

Интерес к линии возрос в 90-х, в том числе благодаря тому, что руководителем нашей группы стала Наталия Гориславовна Колосова, и уже под её началом были выявлены нарастающие с возрастом дисфункции митохондрий, которые рассматриваются как одна из наиболее вероятных причин преждевременного старения крыс OXYS. В то же время оказалось, что не все заявленные ранее свойства у крыс OXYS проявляются.

В первый раз крысы-альбиносы попали в лаборатории и были использованы в 1828 году в экспериментах по изучению голодания. Следующие 30 лет крысы участвовали в нескольких других экспериментах и в итоге стали первыми животными, одомашненными исключительно для исследовательских целей

Так, не было обнаружено признаков галактоземии, достаточно поздно развивалась катаракта. Для стабилизации фенотипических признаков нами в 58-м—63-м поколениях крыс OXYS было проведено усиление отбора по признаку ранней спонтанной катаракты, что привело к её развитию уже в молодом возрасте. Результатом усиления отбора явилось устойчивое спонтанное проявление комплекса признаков преждевременного старения в последующих поколениях. Сегодня мы имеем 112-е поколение крыс OXYS.

То есть отбор этой линии ведётся только по катаракте, а вообще у этих крыс развивается целый комплекс старческих заболеваний?

Да, у этих крыс развивается целый комплекс старческих заболеваний: например, помимо катаракты, развиваются ретинопатия, аналогичная возрастной макулярной дегенерации у людей, остеопороз, артериальная гипертензия, ускоренное старение мозга с развитием ключевых признаков болезни Альцгеймера — одно из них. Ещё раз подчеркну: именно спорадическая форма, по которой мы получаем ряд крайне интересных результатов на наших крысах.

Самое интересное: сегодня результаты исследований в мире находят всё больше и больше подтверждений тому, что механизмы наследственной и спорадической форм болезни Альцгеймера развиваются по-разному. Если для наследственной формы инициирующими факторами становятся именно мутации в трёх названных генах, которые приводят к чрезмерной продукции токсических форм бета-амилоида, то у спорадической формы, скорее всего, — нарушение межнейронных взаимоотношений, передача токсических белков от нейрона к нейрону, то есть такое распространение патологии.

Алоис Альцгеймер — немецкий психиатр и невролог, автор множества статей по таким проблемам, как алкогольный психоз, шизофрения, эпилепсия, сифилис мозга, хорея Хантингтона, артериосклеротическая атрофия мозга, пресенильный психоз

В потоке гипотез, публикаций и новостей, связанных с болезнью Альцгеймера, сложно не заблудиться. Это происходит из-за того, что область остаётся до конца не исследованной. Вы постоянно следите за зарубежными исследованиями?

Конечно. Гипотез развития заболевания достаточно много. Зачастую встречаются нетривиальные, неординарные. Я, помню, была на зарубежной конференции в Чехии в 2014 году, на которой выступал докладчик, говоривший не в ключе общего мышления, видения этого заболевания и его развития. Это связано с постепенно прогрессирующим с возрастом снижением функций иммунной системы центральной нервной системы. Он говорил о том, что нейродегенеративные изменения при болезни Альцгеймера являются результатом потери нейропротекторных свойств микроглии — ключевого клеточного элемента иммунной системы мозга.

После моего возвращения мы начали исследовать этот вопрос. Сделали первые наработки: действительно, так оно и есть.

Ваши исследования механизмов болезни Альцгеймера на крысах полезны в первую очередь для какого этапа: диагностики, лечения или предотвращения?

На всех этапах. Конечно же, главная цель — выявление предикторов. Нужно разобраться, что предшествует заболеванию. Болезнь Альцгеймера по сути — спящее заболевание. Некоторые исследователи говорят, что оно появляется раньше — за 10 или даже 20 лет до симптоматики. Кроме того, очень важно диагностирование на самых ранних сроках развития заболевания и способы замедлить или остановить его с помощью эффективной терапии, когда болезнь уже прогрессирует.

Какой предиктор наиболее вероятен, на ваш взгляд?

Линия крыс OXYS отличается преждевременным старением. Для них характерны ускоренная инволюция тимуса, сниженная реактивность клеточного звена иммунной системы, повышенное артериальное давление, раннее развитие остеопороза и изменения в когнитивной и эмоциональной сферах

До того, как мы стали прицельно изучать ускоренное старение мозга на наших крысах, уже было известно, что одним из наиболее ранних событий в развитии их преждевременного старения становится дисфункция митохондрий, которая была обнаружена в сетчатке, мышцах, миокарде. Теперь мы уже знаем, что, конечно же, и в мозге. Cейчас всё больше и больше появляется работ, убедительно доказывающих, что дисфункция митохондрий может становиться одним из ключевых факторов риска развития болезни Альцгеймера, а также ряда других нейродегенеративных заболеваний, что очень важно.

С чем может быть связана дисфункция митохондрий — какие есть версии?

Не знаю. Я могу только предполагать. Когда мы приступили к исследованиям, связанным с болезнью Альцгеймера, работали на взрослых и старых крысах, поскольку главный фактор риска развития этого заболевания — пожилой возраст. В ходе наших исследований было обнаружено, что симптоматическому периоду проявлений признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS предшествуют изменения функций митохондрий.

Поэтому сейчас мы начинаем работать, в том числе, с ранним периодом.

И, кстати, в мире это направление набирает обороты.

Очень многие заболевания связывают с различными неблагоприятными факторами, которые происходили в раннем возрасте, в том числе перенесённые инфекции.

Среди тестируемых вами препаратов есть важные при болезни Альцгеймера?

— На самом деле эффективных препаратов от Альцгеймера собственно и нет.

Но в то же время последние несколько лет мы изучаем мелатонин — препарат «Мелаксен». По мелатонину у нас интересные результаты получаются: действительно работает. Замедляет развитие и прогрессию признаков болезни, в том числе и за счёт восстановления функций митохондрий.

Мелатонин не только при Альцгеймере хорошо себя показал, а также при ретинопатии, возрастной макулярной дегенерации. Большая часть этих данных нами опубликована. Сейчас готовится к публикации ещё ряд интересных результатов.

В исследованиях по катаракте и ретинопатии вы сотрудничаете с офтальмологом, а по болезни Альцгеймера предполагается взаимодействие с кем-то?

Мне бы хотелось, конечно. Особенно хотелось бы иметь доступ к исследованиям на человеческих образцах мозга. К сожалению, в России это слабо развито — во всяком случае, в Сибири. Даже по этическим соображениям: родственники не дают согласия, чтобы образцы мозга умерших с болезнью Альцгеймера использовали в исследованиях.

Плюс ко всему — сложность с диагностированием. До сих пор ставят диагноз «старческая деменция», а 100-процентный диагноз «болезнь Альцгеймера» могут поставить только постмортально — по наличию патоморфологических признаков, если такие исследования будут проводиться.

За рубежом финансирование по нейродегенеративным заболеваниям, особенно по Альцгеймеру, очень мощное, поэтому там активно работают с человеческими образцами. Забор образцов происходит максимально быстро. Всё оперативно, налажено.

Я надеюсь, что и у нас появится возможность проводить клинико-экспериментальные исследования.

Пока у этой группы учёных нет таких возможностей, как у зарубежных коллег, но с ограниченными ресурсами они получают ценные результаты. Учёные делают всё возможное, чтобы понять механизмы развития болезни Альцгеймера и предотвратить её. После интервью Наталья показала нам виварий, в котором содержатся лабораторные крысы.

30 линий мышей, восемь линий крыс и одну линию хомяков использует ИЦиГ СО РАН для лабораторных исследований

В виварии нас встречает бригадир Галина Петрова, которая ухаживает за животными и кормит их.

Самое главное — крыс сфотографировать. Меня не надо, я не фотогеничная, — сразу предупреждает Галина и выбирает модель для нас, рассказывая о крысах с особым трепетом. — Когда глаза закапываем, они ведут себя очень спокойно, уже знают, чего хотим. Крысы очень умные.

Крысы OXYS — небольшие по размеру, — держа в руке одного представителя, говорит Наталья. — Маленькие, деликатные, красивые. Жёлтые метки на шерсти у каждого индивидуальные — это их фамилия, имя и отчество. Чтобы знать и отслеживать, что и как с ними происходило в ходе эксперимента.

Ну что вы одного фотографируете? Давай большого, Наташа, покажем? — спрашивает Галина и достаёт нам более крупную модель.

Ещё нам показывают крыс Вистар, от которых произошла линия крыс OXYS и которых используют в качестве контроля в исследованиях. Они намного крупнее, восьмимесячных самцов Галина сравнивает с кроликами.

У наших крыс в этом возрасте масса меньше на треть — не 600, а 400 граммов, — поясняет Наталья и продолжает. — Галина Николаевна, давай ещё деток покажем, как матери гнёзда делают.

Сейчас не делают — тепло, — поясняет Галина.

— Видите, просто сложила всех в кучу. В клетке здесь папа с мамой и дети. Не будем их пугать.

Новорождённые крысы ещё слепые. Услышав щелчки затвора объектива, мамочка начинает прятать своих детёнышей. Все крысы в виварии — альбиносы: у них красные глаза.

Их кормят специальной едой для грызунов, а мамочек подкармливают кашей.

Я туда творожок кладу, капусту, морковку, пшеничку проращиваю, а основа — это перловая каша, — делится своим рецептом Галина.

Когда проводят эксперименты, — а они могут длиться месяцами — кормить крыс или давать им препараты нужно в определённое время, поэтому сотрудники вивария могут прийти и в восемь вечера, и в выходные дни, и в праздничные. Наверное, эти любовь и забота играют не последнюю роль в научной деятельности, которая приносит хорошие результаты.

источник