Первые сообщения об этой болезни имеются в кодексе законов Вавилона, произведениях древних греков, в частности Аристотеля. Даже название Rabies, Lyssa отражают главный клинический признак болезни и переводится как «неистовство», безумная ярость. Врачи древности сумели определить передачу болезни через слюну «взбесившихся» собак.
В I веке до н.э. Корнелий Цельс дал болезни название, сохранившееся до наших дней, — гидрофобия, и предложил в целях лечения проводить каутеризацию (прижигание места укуса раскалённым железом).
В 1804 г. немецкий врач Г. Цинке доказал, что бешенство можно переносить от одного животного к другому путём введения в кровь или под кожу слюны бешенного животного.
Кругельштейн в 1879 г. выявил локализацию вируса бешенства в нервной ткани. Он писал: «Если ядом слюны инфицировать нервной окончание, то оно, насытившись, передаст затем яд вдоль симпатических нервов спинному мозгу, а от него он достигнет головного мозга» [2].
В 1887 году Бабеш обнаружил в протоплазме нейронов головного мозга бешеных животных особые включения. А Негри в 1903 году придал им диагностическое значение, и с 1950 года их стали называть тельцами Бабеша – Негри; они являются конгломератами скоплений вирусной и внутриклеточной материи [1].
Разработка вакцины против бешенства стала триумфом науки и сделала Луи Пастера (Pasteur L., 1822-1895) всемирно известным человеком. Ещё при жизни ему поставили памятник в Париже. Существует легенда, что в детстве будущий ученый увидел человека, укушенного бешеным волком. Маленького мальчика очень потрясла страшная картина прижигания места укуса раскаленным железом [2].
Несколько лет у Пастера ушло на безрезультатные усилия выделить возбудитель. Потерпели неудачу и попытки размножения возбудителя бешенства в условиях in vitro. Перейдя к экспериментам in vivo, Пастеру и его сотрудниками (Э. Ру, Ш. Шамберлан, Л. Пердри) удалось к 1884 году получить «фиксированный вирулентный фактор бешенства». Следующим этапом создания вакцины стал поиск приёмов, ослабляющих возбудитель бешенства. И к 1885 году вакцина против бешенства была создана и успешно предотвращала развитие заболевания у лабораторных животных.
Но когда Пастер все-таки создал вакцину, он долго не решался проверить эффективность антирабической вакцины на людях. Первые испытания антирабической вакцины на человеке произошли неожиданно: 4 июля 1885 года в лабораторию Пастера был доставлен 9-летний Жозеф Мейстер с множественными укусами бешеной собаки. Мальчик был обречён и поэтому учёный решился применить своё изобретение. Более того, после вакцинации Пастер ввёл пациенту ещё более вирулентный вирус, чем вирус бешенства уличных собак. По мнению учёного, такой приём давал возможность проверить иммунитет, вызванный вакцинацией, либо существенно ускорить смертельную агонию (если бешенство бы не удалось предотвратить). Мальчик не заболел [3].
С этого момента слава Пастера пошла по всему миру. В разных странах начали открываться пастеровские станции, где делали прививки от бешенства, сибирской язвы и куриной холеры. Об успешном начале вакцинации людей Пастер доложил на заседании Французской академии наук и Академии медицинских наук 27 октября 1885 года. Председательствующий на заседании физиолог А. Вюльпиан тут же поставил вопрос о немедленной организации сети станций для лечения бешенства с тем, чтобы каждый человек мог воспользоваться открытием Пастера.
Первоначально Пастер был убеждён в необходимости централизовать антирабическую деятельность в едином международном центре. Поэтому в его институт во Франции стали приезжать больные из разных стран мира, в том числе и из России. Первая половина 1886 года стала самой тяжёлой для Пастера, поскольку смертность пациентов, прибывших в Париж из российских губерний, была удручающей и доходила до 82%, несмотря на интенсивный курс вакцинотерапии. Ближайшие соратники и ученики Пастера (Э. Ру, Ш. Шамберлан, Л. Пердри) прекратили своё участие в прививочной деятельности, считая, что вакцина против бешенства ещё недостаточно изучена [3].
Отсутствие у Пастера врачебного образования делало его при малейших неудачах объектом безжалостной критики. Кроме того, вакцина против бешенства Пастера входила в противоречие с общепринятыми в медицине идеями: врачам было непонятно, как вакцина, введённая уже после заражения, могла оказывать эффект.
Большую поддержку (нравственную и научную) Пастеру оказал в этот период молодой русский врач, командированный в Париж Обществом русских врачей, Николай Фёдорович Гамалея. Он добровольно подверг себя интенсивному курсу прививок против бешенства, тем самым подтвердив безопасность вакцины для человека.
Именно наш соотечественник обратил внимание Пастера на то, что все случаи смерти среди вакцинируемых статистически укладываются в срок после 14-го дня с момента укуса. Позднее Гамалея Н.Ф. писал: «Я предположил, что предохранительные прививки могут уничтожить только яд, не дошедший к нервным центрам, и бессильны против того, который уже находится в последних» [3].
Пастер увидел, что нельзя обойтись одним на вес мир пастеровским институтом, поэтому он согласился на открытие пастеровских станций в других странах и прежде всего способствовал учреждению Одесской (открыта в мае 1886 г.)
Как и любое новое биологическое средство, прививки против бешенства не были лишены некоторых недостатков и Пастеру самому пришлось столкнуться с поствакцинальными осложнениями. Пастер первым указал на ведущую роль самого организма человека (а не вакцины) в поствакцинальном осложнении, а также выделил ряд дополнительных неспецифических раздражителей: употребление алкоголя на фоне вакцинации, переутомление, инфекционные заболевания и др.
В 1903 г. сотрудник института Пастера в Париже П. Ремленже установил, что возбудителем бешенства является не бактерия, а фильтрующийся вирус, обладающий свойством облигатного паразита.
Живая Пастеровская вакцина применялась в течение многих лет. Так, например, в СССР — до 1925 г., во Франции — до 1948 г. Сам Пастер не считал живую вакцину совершенной и в 1887 г. в «Письме о бешенстве», адресованном редактору журнала «Анналы Института Пастера», говорил о перспективности разработки инактивированной вакцины [3].
О бешенстве писали поэты. Так, предположительно за 8 или 10 веков до н. э. легендарный греческий поэт Гомер в своей «Иллиаде» устами Тевкра называет Гектора бешеной собакой. В одной из своих поэм выдающийся поэт Востока Низами отмечает: «Счастлив тот, у кого сомкнуты уста, только у бешеной собаки свисает язык».
По Плутарху, бешенство и лепра появились в Италии за 100 лет до христианского летоисчисления.
В XVIII и XIX столетиях, вероятно, благодаря повышению социально-экономического значения повсеместных эпизоотии бешенства наблюдается особый интерес к изучению этой болезни. За рубежом и в России до 1785 г. было опубликовано более 300 сочинений о бешенстве (Д. Самойлович, Н. Я. Озерецковский). Д. Самойлович высказывал твердое убеждение о заразительности бешенства и опровергал мнение о возможности спонтанного возникновения этого заболевания: «В условиях нашего весьма холодного климата сия болезнь отнюдь сама собой не может никогда возродиться».
До последней четверти XIX века человечество оставалось беспомощным как в предупреждении, так и в лечении этого неизбежно смертельного заболевания. Вместе с тем в литературе были сообщения примерно о 400 будто бы излечивающих средствах (Н. Ф. Гамалея). Вряд ли найдутся какие-либо лекарственные и нелекарственные средства, такие, как «русская баня» или погружение в холодную воду, которые не были бы испытаны для этой цели.
К началу XX века в ряде стран Европы (Англия, скандинавские страны, Швейцария) бешенство не регистрировалось, что было результатом успешных профилактических мероприятий. Однако в период двух мировых войн и после них заболеваемость этой инфекцией вновь повсеместно выросла [4].
Библиографический список
Груздев, К. Н. Бешенство животных [Текст]: практическое руководство / К. Н. Груздев, В. В. Недосеков – М.: Аквариум ЛТД, 2001. – 303с.
источник
Бешенство является вирусной зоонозной инфекцией, которая встречается в более 100 странах и территориях. Хотя природнымирезервуарами заболевания являются некоторые плотоядные животные и летучие мыши, бешенство собак является источником 99% случаев заражения человека и представляет собой потенциальную угрозу более чем для 3,3 миллиарда людей.
Для человека, в том случае, когда уже появились клинические симптомы, бешенство почти неотвратимо влечет за собой фатальный исход.
Вряде стран статистические данные о числе случаев смерти людей от бешенства, по-видимому, в значительной степени занижены, в особенности в отношении наиболее молодых возрастных групп. На сельские районы Азии и Африки приходится значительное большинство из 55 000 расчетных смертных случаев, ежегодно вызываемых бешенством. Только в Индии, согласно расчетам, ежегодно имеет место 20 000 смертных случаев (т.е., примерно 2 случая на 100 000 человек, подверженных риску); в Африке соответствующая цифра составляет 24 000 (примерно 4 на 100 000 человек, подверженных риску). Хотя все возрастные групп подверженыриску в одинаковой степени, заболевание бешенством наиболее часто встречается у детей в возрасте до 15 лет; 30–50% случаев лечебно-профилактического лечения приходится на детей от 5 до 14 лет, чаще всего мужского пола.
Вирус бешенства относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Согласно Международному комитету по таксономии вирусов по состоянию на 2009 г. 11 видов вирусов классифицируются как принадлежащие к виду Lyssavirus. РНКвируса бешенства состоит из 5 белков, включая гликопротеин G, содержащий основные иммунодоминантные сайты. Помимо вируса бешенства, было доказано или предполагается, что вирусы, относящиеся ко всем другим известным генотипам лиссавируса, могут вызывать у человека острый прогрессирующий энцефалит. Поэтому бешенство является энцефалитом, вызываемым лиссавирусом, а вирус бешенства является основным вирусным видом, представляющим этот род.
Заражение человека обычно происходит через кожу, поврежденную при укусе или царапине, нанесенной инфицированнымживотным. Трансмиссия может также иметь место, когда инфицированные материалы, обычно слюна, вступают в прямой контакт со слизистой оболочкой или свежими кожными ранениями человека. Трансмиссия от человека к человеку чрезвычайно редка. В исключительно редких случаях бешенством можно заразиться, вдыхая вирусосодержащие аэрозоли или при трансплантации инфицированных органов. Употребление в пищу сырого мяса или других тканей животных, зараженных бешенством, не относится к числу известных источников заражения человека.
Инкубационный период обычно составляет от 1 до 3 месяцев, однако заболевание может также развиваться менее чем за неделю или на протяжении более года. Продолжительность инкубационного периода зависит от таких факторов, как количество инокулированных вирусов, степень иннервации участка, куда попал вирус, близость укуса к центральной нервной системе (ЦНС). Инокулированный вирус попадает в ЦНС через периферические нервы. При попадании в мозг вирус размножается и быстро распространяется вновь через нервную систему во многих различных тканях, включая слюнные железы. К моменту проявления клинических симптомов вирус распространяется по всему организму, обычно не вызывая к этому моменту какой-либо ощутимой иммунной реакции.
Кпервоначальным симптомам бешенства относятся повышение температурыи нередко ощущение боли или парастезия в месте укуса. По мере распространения вируса в ЦНС развивается прогрессирующий фатальный энцефаломиелит, характеризующийся гиперактивностью и флюктуацией сознания, а в случае буйного бешенства гидрофобией и/или аэрофобией. Смерть наступает в течение нескольких дней в результате остановки сердца. Паралитическое бешенство, которое может составлять примерно 30% общего числа случаев заболевания у человека, проходит менее бурно и обычно в течение более длительного времени, чем буйная форма, однако, в конечном итоге, является по-прежнему фатальным. Паралитическая форма бешенства часто неправильно диагностируется, что объясняет заниженные данные о заболевании.
Впроцессе инфицирования организма вирусы бешенства скрыты от иммунного надзора благодаря своему нахождению в нервных тканях, и иммунная реакция в сыворотке и спинномозговой жидкости непредсказуема и в редких случаях выявляется до наступления второй недели заболевания.
К настоящему времени не имеется никаких способов диагностировать инфицирование бешенством у человека до наступления клинической формызаболевания, и клинический диагноз может оказаться затруднительным при отсутствии специфических для бешенства признаков гидро- или аэрофобии. В стадии клинических проявлений образцыслюны, мочи, экстрагированных волосяных луковиц и спинномозговой жидкости можно анализировать при помощи изоляции вируса или при помощи цепной реакции полимеразы, а сыворотку и спинномозговую жидкость анализировать на антитела к вирусу бешенства. Образцы кожи, взятые путем биопсии, можно анализировать на присутствие антигена бешенства в кожных нервах в основании волосяных луковиц.
Бешенство отличается от многих других инфекций в том, что развитие клинических проявлений заболевания может быть остановлено при помощи своевременной иммунизации даже после попадания в организм инфицирующего агента.
Со времени их создания свыше четырех десятилетий назад, антирабические вакцины доказали свою безопасность и эффективность в предупреждении бешенства. Эти вакцины предназначены как для профилактической иммунизации, так и для лечебно-профилактической иммунизации, и вводились миллионам людей во всем мире.
Вакцины, полученные на культуре клеток и клетках эмбрионированных яиц, на международном рынке КАВ– это вирус бешенства, размножившийся в клеточных субстратах. Из имеющихся в настоящее время антирабических вакцин ни одна не поставляется в многоразовых ампулах, а антирабические вакцины, прошедшие предварительную квалификацию ВОЗ, не содержат консервантов, таких как тимеросал. Срок хранения подобных вакцин составляет, по меньшей мере, 3 года при условии хранения при температуре от +2°Cдо +8°Cв защищенном от солнца месте.
После восстановления прилагаемым стерильным разбавителем вакцины следует использовать немедленно или в течение 6-8 часов при условии хранения при правильной температуре.
Внутримышечное и внутрикожное введение вакцины
Стоимость вакцин, полученных на культуре клеток, для внутримышечного введения ограничивает их широкое применение во многих регионах, где часто встречается бешенство у собак. Внутрикожное введение этих вакцин является в равной степени безопасной и иммуногенной альтернативой, при которой необходимы лишь 1 или 2 ампулы вакцины для завершения полного курса лечебно-профилактической иммунизации, что, тем самым, уменьшает объем и непосредственную стоимость вакцинации на 60-80% по сравнению со стандартной внутримышечной вакцинацией.
Схемы лечения на основе внутрикожного введения вакцины успешно применялись для лечебно-профилактической иммунизации в развивающихся странах, таких как Индия, Филиппины, Шри-Ланка и Таиланд.
Позиция ВОЗ по применению антирабических вакцин
Замена вакцин на основе нервных тканей на КАВ
Несмотря на разработку более дешевых КАВ и более экономных, с точки зрения расхода вакцины, методов вакцинации, в ряде стран, главным образом, в Азии и Латинской Америке, по-прежнему производятся и применяются вакцины на основе нервных тканей. Эти вакцины вызывают более тяжелые побочные последствия, и они обладают меньшей иммуногенной активностью, чем КАВ. Поэтому настоятельно необходимо, чтобы производство и применение вакцин на основе нервных тканей было прекращено как можно скорее и им на смену пришли КАВ.
Профилактическая иммунизация рекомендуется для всех, кто подвержен постоянному, частому или повышенному риску заражения вирусом бешенства либо в связи с характером места проживания или занятий (например, работники лабораторий, имеющие дело с вирусом бешенства и другими лиссавирусами, ветеринары и лица, имеющие дело с животными). Лица, путешествующие в природном окружении в сельских районах в условиях значительного риска, где незамедлительный доступ к надлежащей медицинской помощи может быть ограничен, также должны вакцинироваться, независимо от продолжительности их пребывания на природе.
Особому риску подвергаются дети, проживающие в районах, где отмечается бешенство, или посещающие их. ВОЗ стимулирует тщательно продуманные исследования в отношении осуществимости, экономической эффективности и долгосрочного влияния введения КАВ в программы иммунизации детей младшего и старшего возраста в тех регионах, где бешенство собак является проблемой общественного здравоохранения.
Внутримышечное введение вакцины при проведении профилактической иммунизации
Для профилактической иммунизации необходимы внутримышечные дозы в объеме 1 мл или 0,5 мл (объем зависит от типа вакцины), вводимых в дни 0, 7 и 21 или 28. Взрослым и детям в возрасте 2 лет и старше вакцину следует всегда вводить в дельтовидную мышцу; для детей младше 2 лет рекомендуется переднелатеральная область бедра. Антирабическую вакцину не следует вводить в ягодичную область, поскольку при этом понижается надежность достижения необходимого иммунного ответа.
Внутрикожное введение вакциныпри профилактической иммунизации
Вакцина вводится внутрикожно дозой 0,1 мл в дни 0, 7 и 21 или 28. Это является приемлемой альтернативой стандартному внутримышечному методу. Чтобы достичь значимой экономии, к сеансам внутрикожной иммунизации следует привлекать достаточное количество лиц, чтобы использовать все открытые ампулы в течение 6-8 часов.
Требования в отношении повторных прививок
Бустерные дозы антирабических вакцин не требуются для лиц, проживающих в районах значительного риска или посещающих эти районыи уже прошедших полный первичный курс профилактической или лечебно-профилактической иммунизации с применением КАВ.
Периодические бустерные инъекции рекомендуются в качестве дополнительной предосторожности только тем лицам, род занятий которых сопряжен с постоянным и частым риском заражения бешенством.
Показания к лечебно-профилактической иммунизации зависят от типа контакта с животным, у которого подозревается бешенство:
Категория I – прикасание к животным или кормление их, ослюнение животным неповрежденной кожи человека (т.е. заражения не произошло);
Категория II – мелкие укусы непокрытых участков кожи, незначительные царапины или ссадины без кровотечения, ослюнение поврежденных кожных покровов;
Категория III – укус или царапина или множественные укусыили царапины с повреждением кожи, попадание слюныживотного на слизистые оболочки, контакт с летучими мышами.
При контакте категории I профилактика не требуется; при контакте категории II рекомендуется незамедлительная вакцинация, и при контакте категории III
незамедлительная вакцинация и введение антирабического иммуноглобулина. При контактах категории II и III следует незамедлительно или как можно скорее произвести тщательное (по возможности примерно 15 минут) промывание моющим или очищающим средством и обильным количеством воды всех ранений, укусов и царапин.
По возможности раны следует обработать настойкой йода или схожим вироцидным препаратом. Втех случаях, когда завершение лечебно-профилактической иммунизации с использованием одной и той же КАВ не представляется возможным, следует использовать другую КАВ. Однако, поскольку еще не проводилось никаких исследований по поводу иммуногенной активности вакцины и изменения метода ее введения (например, перехода от внутримышечного к внутрикожному введению), в процессе лечебно-профилактической иммунизации подобная практика должна являться исключением.
Лечебно-профилактическую иммунизацию следует прекратить, если в отношении подозреваемого животного соответствующим лабораторным путем установлено, что оно не заражено бешенством, или в случае домашних собак, кошек или хорьков животное остается здоровым, находясь под наблюдением в течение 10 дней, начиная с момента укуса.
Факторы, которые следует принимать во внимание, принимая решение о том, следует или нет приступать к лечебно-профилактической иммунизации, включают в себя эпидемиологическую вероятность того, что данноеживотное является носителем бешенства, категорию контакта (I–III), клинические данные о животном, а также возможность наблюдать животное и провести лабораторное обследование. Во многих ситуациях в развивающихся странах один лишь статус по вакцинации участвовавшего в инциденте животного не должен приниматься во внимание в качестве основания воздержаться от иммунизации.
Лечебно-профилактическая иммунизация внутримышечным путем
Схема вакцинации при лечебно-профилактической иммунизации предусматривает внутримышечные дозы 1 мл или 0,5 мл (объем зависит от типа вакцины). В отношении контактов категорий II и III рекомендуемый курс предусматривает 5 доз в дни 0, 3, 7, 14 и 28.
В качестве альтернативы для здоровых, полностью иммунокомпетентных, подвергшихся заражению лиц, у которых обработаны раны, плюс введен высококачественный антирабический иммуноглобулин, плюс антирабическая вакцина, прошедшая предварительную квалификацию ВОЗ, может использоваться курс лечебно-профилактической иммунизации, состоящий из четырех доз, вводимых внутримышечно в дни 0, 3, 7 и 14.
Во всех других случаях, включая определяемый ВОЗ контакт категории II, когда применения антирабического иммуноглобулина не требуется, следует продолжить проведение курса из пяти доз в дни 0, 3, 7, 14 и 28.
Лечебно-профилактическая иммунизация внутрикожным путем
Курс вакцинации в 2 точках предусматривает инъекцию 0,1 мл в 2 точках (по одной инъекции в каждую из дельтовидных мышц/в каждое бедро) в дни 0, 3, 7 и 28. Этот курс может использоваться при контактах категории II и III в странах, где внутрикожный метод утвержден национальными органами здравоохранения.
Лечебно-профилактическая иммунизация для лиц, вакцинированных ранее
Для подвергнувшихся заражению пациентов, которые могут документально подтвердить проведенный ранее полный курс профилактической иммунизации или
полный курс лечебно-профилактической иммунизации с применением КАВ, достаточно введения одной дозывнутримышечно или вакцины, полученной на
культуре клеток, введенной внутрикожно в дни 0 и 3. В этих случаях применение антирабического иммуноглобулина не рекомендуется. Подобный двухдневный режим вакцинации в одной точке внутрикожно или внутримышечно также применяется к лицам, прошедшим вакцинацию против бешенства и у которых обнаружен титр антител, нейтрализующих вирус бешенства ≥0,5 МЕ/мл. В качестве альтернативы указанной схеме, пациенту можно предложить режим внутрикожной вакцинации в 4 точках в ходе одноразового посещения. Этот режим состоит из 4 внутрикожных инъекций 0,1 мл, равным образом распределенных на левую и правую дельтовидные мышцыили области бедер.
Прививочные карты, в которых тщательно регистрируются предыдущие иммунизации, имеют большое значение для принятия правильного решения
источник
К началу 1870-х Луи Пастер уже совершил львиную долю своих медицинских открытий. За прошедшие 30 лет он внес значительный вклад в открытие микробной теории своими работами в области ферментации, пастеризации, спасения шелкопрядильной промышленности и окончательного развенчания теории самопроизвольного зарождения жизни.
К началу 1870-х Луи Пастер уже совершил львиную долю своих медицинских открытий. За прошедшие 30 лет он внес значительный вклад в открытие микробной теории своими работами в области ферментации, пастеризации, спасения шелкопрядильной промышленности и окончательного развенчания теории самопроизвольного зарождения жизни.
Но в конце 1870-х Пастера ждало еще одно эпохальное открытие, поводом к которому послужил на этот раз довольно зловещий подарок: куриная голова. Нет, это была не угроза и не жестокая шутка. Курица умерла от птичьей холеры — серьезного инфекционного заболевания, разгул которого уничтожал до 90% куриного поголовья в стране.
Ветеринар, приславший Пастеру куриную голову, полагал, что болезнь вызвана специфическим микробом. Вскоре ученый подтвердил его теорию: взяв образец с мертвой куриной головы, он вырастил в лаборатории аналогичную микробную культуру и ввел ее здоровым курицам. Те вскоре умерли от птичьей холеры. Это послужило еще одним подтверждением состоятельности микробной теории, но выращенная Пастером болезнетворная культура вскоре сыграла в истории намного более важную роль. В этом ей помогли рассеянность ученого и счастливая случайность.
Летом 1879 г. Пастер отправился в долгую поездку, совершенно забыв об оставленной в открытой пробирке в лаборатории культуре птичьей холеры. Вернувшись из поездки, он ввел эту культуру нескольким курицам и обнаружил, что вирус во многом утратил свои смертоносные свойства: птицы, которым ввели ослабленные, или аттенуированные, бактерии, заболели, но не умерли.
Однако вслед за этим Пастера ждало еще более важное открытие. Он подождал, когда курицы оправятся от болезни, ввел им смертельные бактерии птичьей холеры и обнаружил, что теперь они совершенно невосприимчивы к заболеванию.
Пастер немедленно осознал, что открыл новый способ изготовления вакцин: введение ослабленных бактерий наделяло организм способностью сражаться и с активными смертельными формами.
Обсуждая это открытие в 1881 г. в своей статье, напечатанной в журнале The British Medical Journal, Пастер писал:
«Мы затронули основной принцип вакцинации. Переболев вирусом в ослабленной форме, птицы затем не пострадали и после заражения вирулентным вирусом, и оказались надежно защищены от птичьей холеры».
Вдохновившись этим открытием, Пастер начал исследовать возможности применения нового подхода в изготовлении вакцин от других болезней. Его следующий успех был связан с сибирской язвой.
Это заболевание наносило серьезный урон сельскому хозяйству, унося жизни 10-20% поголовья овец. Ранее Роберт Кох уже доказал, что сибирскую язву вызывают бактерии. Пастер хотел выяснить, можно ли ослабить их, сделать безвредными, но так, чтобы они сохранили способность стимулировать защитные силы организма, в который будут введены в виде вакцины.
Он добился нужного результата, выращивая бактерии при повышенной температуре. Когда некоторые современники усомнились в его находках, Пастер решил доказать свою правоту, поставив весьма эффектный публичный эксперимент.
5 мая 1881 г. Пастер ввел 25 овцам свою вакцину — новый ослабленный вирус сибирской язвы. 17 мая он снова ввел им более вирулентный, но все еще ослабленный вирус. Наконец, 31 мая он ввел смертоносные бактерии сибирской язвы 25 привитым овцам и еще 25 непривитым. Через два дня толпа зрителей, среди которых были члены парламента, ученые и репортеры, собралась посмотреть, чем закончится эксперимент. Итог говорил сам за себя: из привитой группы умерла лишь одна беременная овца, из непривитой же 23 умерли и две были близки к смерти.
Но, возможно, самым знаменитым достижением Пастера в этой области стало открытие антирабической вакцины (против бешенства) — первой его вакцины, предназначенной для человека. В то время бешенство было страшной болезнью и неизменно заканчивалось смертью.
Причиной заболевания обычно становился укус бешеной собаки, а методы лечения были один другого ужаснее: больному в рану предлагали ввести длинную раскаленную иглу или посыпать место укуса порохом и поджечь. Никто не знал, что именно вызывает бешенство: болезнетворный вирус был слишком мал для тогдашних микроскопов, и его нельзя было вырастить в виде отдельной культуры.
Но Пастер все же был убежден, что болезнь возбуждает какой-то микроорганизм, поражающий центральную нервную систему. Чтобы создать вакцину, Пастер культивировал неизвестного возбудителя в мозге кролика, ослабил его, высушив фрагменты ткани, и использовал их для изготовления вакцины.
Первоначально Пастер не собирался испытывать экспериментальную вакцину на человеке, однако 6 июля 1885 г. ему пришлось изменить свое решение. В тот день к нему доставили девятилетнего Джозефа Мейстера со следами 14 укусов бешеной собаки на теле. Мать мальчика умоляла Пастера о помощи, и, сдавшись под ее напором, тот согласился ввести ребенку новую вакцину. Курс лечения (13 инъекций за 10 дней) оказался успешным, мальчик выжил.
После этого, хотя введение смертельного агента человеку и вызвало в обществе протесты, в течение 15 месяцев прививку от бешенства получили еще 1500 человек.
Итак, всего за восемь лет Луи Пастер не только совершил первый крупный прорыв в истории вакцинации со времен Дженнера, открыв способы аттенуации вирусов, но и создал эффективную вакцину против птичьей холеры, сибирской язвы и бешенства.
Однако в его передовой работе скрывался еще один неожиданный поворот: дело было не только в снижении вирулентности вирусов.
Как позже понял Пастер, вирусы, из которых состояла его антирабическая вакцина, были не просто ослабленными, а погибшими.
Именно в этом заключалось зерно следующего великого открытия.
источник
6 июля 1885 г., трое мужчин в Париже подготавливались к проведению терапевтических процедур Джозефу Мейстеру, мальчику девяти лет из Эльзаса, который был укушен несколько раз бешеной собакой. Двое из них имели медицинское образование, а третий был терапевтом, химиком, переквалифицирующимся в микробиолога по имени Луи Пастер.
Несмотря на то, что это было сравнительно редкое заболевание, бешенство (или водобоязнь, как тогда это называли) привлекало настороженное внимание в Европе, его жертвы погибали болезненно и внезапно, дико с пеной у рта. Инкубационный период заболевания (время для размножения вируса после заражения) делало его привлекательным для Пастера, уже тогда известным ученым во Франции, в качестве кандидата для создания нового типа вакцины.
«Время от укуса до болезни было довольно долго, как правило, около месяца или дольше», – объясняет Кендалл Смит, иммунолог Уилл Корнел Медицинского
колледжа (Weill Cornell Medical College), – «Здесь есть время, чтобы вмешаться в ситуацию с терапевтической вакциной».
К 1885 году, через пять лет после начала работы над бешенством, Пастер и его коллеги разработали живую вирусную вакцину, которая, как утверждал Пастер, не только защищает собак от заражения бешенством, но и предотвращает развитие симптомов заболевания, и может вводиться постэкспозиционно.
Тем не менее, не обошлось и без эксцессов, беспокойства своих коллег о том, что он согласился предпринять серию вирусных инъекций бессимптомному молодому Мейстеру. «Это будет еще одна плохая ночь для вашего отца», – написал Пастер жене Мари и своим детям во время лечения, – «Я не могу смириться с идеей применения такой крайней меры к ребенку».
Но, казалось, предпринятые меры сработали, у Мейстера бешенство не развилось. И после начала лечения уже другого мальчика в октябре Пастер объявил об успехе создания вакцины перед Французской национальной академией медицины. История стала международной новостью, даже пациенты из Америки вскоре были отправлены в Европу, чтобы получить чудо-лекарство.
Конечно, были и критики. «Для того чтобы сделать вывод о том, что вакцина является успешной, вы должны сравнить пробную группу против контрольной группы», – говорит Смит. Скептики утверждали, что, поскольку болезнь не всегда становится симптоматической (не всегда происходит развитие болезни после заражения), эффективность вакцины не может быть подтверждена. Они обвиняли Пастера в том, что он рискует жизнью ребенка.
Также скрытное поведение Пастера подпитывало его противников. «Его работы были всего лишь три или четыре страницы длинной», – говорит Смит, – «Там не было никаких подробностей, и вы не могли бы воспроизвести, что-либо из них».
Почти столетие спустя, уже в 1970-е годы, лабораторные записи Пастера (которые до сих пор во владении его наследников) были обнародованы. Они выявили большие расхождения между исследованиями Пастера и его утверждениями, хотя он испытал вакцину на собаках, но то, что он вводил Меистеру, было сделано с использованием различных методов, в основном непроверенных на животных. Это был успех? Возможно, но он был результатом догадки.
Но внешнее проявление тогда имело большее значение, чем прозрачность. В 1888 году был открыт Институт Пастера, и хотя его вакцина была вскоре заменена химически инактивированной альтернативной вакциной, а Пастер упоминается, справедливо или ошибочно, как революционный ученый и экспериментатор.
«Позвольте мне рассказать вам секрет, который привел меня к моей цели», – говорит он в своей широко известной цитате, – «Моя сила лежит исключительно в моем упорстве».
источник
В чем же заключается метод создания вакцины против бешенства? Какими путями шел Пастер, чтобы ослабить возбудителя бешенства? Как он добился успеха на этом трудном и опасном пути? Наконец, были ли у Пастера предшественники в создании вакцин против заразных болезней, когда он начинал свои исследования по бешенству? Конечно, были, и прежде всего Эдуард Дженнер, создатель вакцины против оспы.
Но главным предшественником Пастера при разработке вакцины против бешенства был он сам, до этого впервые создавший вакцины против куриной холеры и сибирской язвы, пользуясь известным уже читателю методом аттенуации. Но создание вакцины против бешенства не могло быть простым продолжением прежних его работ.
Не говоря уже о том, что бешенство совершенно иное заболевание, протекающее по иным закономерностям, с иным возбудителем и имеющее особые свойства, были и другие условия, осложнявшие и без того трудную работу. Когда Пастер создавал вакцины против куриной холеры и сибирской язвы, в руках у ученого были чистые культуры, с которыми он ставил опыты. Но еще никому не удавалось не только получить, но даже увидеть микроба бешенства. Как же изучать бешенство? С чего начать? Как получать экспериментально заболевание у животных? Ведь для изучения его всегда надо иметь под руками больных животных.
Жизнь подсказывала метод и в сущности очень простой. Достаточно было бросить бешеную собаку в клетку к здоровым, чтобы, покусанные, они заболели бешенством. Можно было ввести шприцем в кожу животных слюну бешеной собаки и таким путем также получить заболевание.
Да, такие методы допускали возможность заражения животных, но они были недостаточно надежными для экспериментов. Одни собаки заболевали после инкубационного периода 1 в 14 дней, другие — через 60 дней, третьи — через несколько месяцев после заражения. Были собаки, которые совсем не заболевали. По-видимому, в тех каплях слюны, которые попадали в рану, возбудителей бешенства не оказалось.
Таким образом, возникновение бешенства зависело от количества возбудителя, попадавшего в рану, от силы его болезнетворных свойств — вирулентности, от обширности и глубины ран при укусах, от места укусов и свойств организма, в который попадал вирус бешенства, а также от многих других причин.
То, что было известно Пастеру о поражении нервной системы при бешенстве, натолкнуло его на мысль использовать мозг больного животного. Но будет ли мозг бешеных животных более надежным материалом для экспериментов, чем слюна? Но куда вводить его, чтобы вызывать закономерное возникновение экспериментального бешенства? Обязательно ли нужно заражать собак или можно пользоваться другими более удобными лабораторными животными, например кроликами? Как добиться постоянства силы возбудителя, чтобы при определенной дозе вызывать бешенство через определенное количество дней? Ведь если нет культуры микробов бешенства, надо чтобы материал для опытов, т. е. мозг зараженных животных, содержал вирус всегда определенной силы. Эти и многие другие вопросы требовали разрешения.
Опыт подсказывал, что растертый мозг в виде взвеси в бульоне или физиологическом растворе можно вводить под кожу или, что еще лучше, непосредственно в мозг. Но как это сделать? Химик по образованию, Пастер опасался, что такое грубое внедрение в мозг грозит параличом и гибелью животных и был против такой методики. Работа зашла в тупик. Судьба величайшего открытия висела на волоске.
Но ближайший помощник Пастера, врач по образованию, Эмиль нашел выход.
источник
Изобретение предназначено для изготовления средств специфической профилактики бешенства всех видов сельскохозяйственных и домашних животных. Фиксированный вирус бешенства (ВБ) культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при 35-37°С в течение 96-144 ч. По окончании репродукции ВБ в вируссодержащую суспензию вносят сначала в качестве стабилизатора полиакриловую кислоту (ПАК) или феракрил (ФА) до концентрации 0,7-1,0%. Затем вносят в качестве инактиванта димер этиленимина (ДЭИ) до концентрации 0,1-0,3%. Смесь инкубируют при 35-37°С в течение 20-24 ч. Полученную вакцину используют как в жидком, так и в сухом виде. Для получения сухого препарата жидкую вакцину высушивают сублимацией. Изобретение повышает специфическую безопасность, иммуногенную активность, стабильность и безвредность вакцины, а также снижает ее реактогенность и аллергенность. 7 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики бешенства всех видов сельскохозяйственных и домашних животных.
Бешенство животных относится к заболеваниям, неизбежно приводящим к гибели и, безусловно, является одной из самых страшных болезней, передаваемых человеку от животных. Поэтому борьба с ним представляется не только экономической, но социальной проблемой, успешное решение которой в значительной мере зависит от качества антирабических вакцин, применяемых с профилактической целью. Проблемы с созданием эффективной вакцины против бешенства животных обусловлены прежде всего трудностями, связанными с наработкой качественной биомассы вируса бешенства (ВБ).
Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ, штамм «овечий» ВГНКИ, в мозговой ткани овец, внесение в вируссодержащую суспензию 1 % раствора фенола в качестве инактиванта, инкубацию смеси при 22 o C в течение 48 часов, ее соединение со средой высушивания, расфасовку препарата и его высушивание. Среда высушивания содержит 90 мл дистиллированной воды, 10 г сахарозы и 1,5 г желатины (1).
Недостатки данного способа заключаются в низкой иммуногенной активности полученной вакцины, высокой токсичности фенола и значительном содержании в препарате остаточного вируса, что способствует проявлению поствакцинальных осложнений у привитых животных, особенно у крупного рогатого скота и декоративных пород собак. Кроме того, содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации сахарозы и желатины увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины. Данный способ допускает выпуск нестерильного препарата.
Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных с использованием инактиванта гидроксиламина (2).
Недостаток данного способа состоит в том, что используемый гидроксиламин не инактивирует микрофлору, присутствующую в вирусной суспензии.
Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ, штамм «овечий» ВГНКИ, в мозговой ткани овец, внесение в вируссодержащую суспензию 20-21% раствора этанола в качестве инактиванта, инкубацию смеси при 30-31 o C в течение 12-14 суток, ее соединение со средой высушивания, расфасовку препарата и его высушивание. Среда высушивания включает 22.5 г сахарозы и 3 г желатины на 100 мл дистиллированной воды (3).
Недостатки данного способа заключаются в низкой иммуногенной активности полученного препарата, высокой трудоемкости его изготовления и нестерильности целевого продукта. Кроме того, содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации сахарозы и желатины увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины.
Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ в культуре клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию в качестве инактиванта бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при 4-6 o C в течение 2-4 часов с последующим добавлением гидроокиси алюминия и сапонина в качестве адъювантов (4).
Недостатками данного способа являются нестабильность полученной вакцины, поскольку она выпускается в жидком виде, высокая себестоимость препарата, так как готовится из концентрированного антигена, наличие в вирусной суспензии контаминирующих вирусов и микрофлоры, попавших с сывороткой, клетками ВНК и из окружающей среды, так как использование бета-пропиолактона для инактивации инфекционности ВБ не обеспечивает стерильность вирусной суспензии.
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ в культуре клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию в качестве инактиванта бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при 4-6 o C в течение 2-4 часов, добавление в нее стабилизатора, адьюванта и лиофилизацию целевого продукта. Стабилизатор содержит, мас.%: пептон (7,5-15), сахарозу (7,5-150), желатину (3-6), воду — остальное. В качестве адъюванта используют сапонин (5, 6).
Недостатки способа — прототипа: 1) низкая иммуногенная активность полученной вакцины; 2) использование бета-пропиолактона в режиме инактивации инфекционности ВБ не обеспечивает стерильность вирусной суспензии от контаминирующих агентов, попавших в нее с сывороткой, клетками ВНК и из окружающей среды; 3) содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации пептона, сахарозы, желатины и сапонина увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины.
В задачу создания изобретения входила разработка способа изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, обеспечивающего унифицированное производство специфически безопасной, высокоиммуногенной, стабильной, безвредной, свободной от контаминирующих агентов вакцины как в жидком, так и сухом виде. Применение препарата должно гарантировать эффективную профилактику бешенства у всех видов сельскохозяйственных и домашних животных.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении специфической безопасности, иммуногенной активности, стабильности и безвредности вакцины, а также в снижении ее реакгогенности и аллергенности.
Указанный технический результат достигается созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных; 2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток; 3) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21; 4) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант; 5) в качестве стабилизатора используют полиакриловую кислоту (ПАК) или ее соль; 6) в качестве соли ПАК используют феракрил (ФА);
7) ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
8) в качестве инактиванта вируса используют димер этиленимина (ДЭИ);
9) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
10) смесь вируссодержащей суспензии, ПАК или ФА с ДЭИ инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
11) полученный препарат используют в жидком виде;
12) полученный препарат высушивают сублимацией.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных;
2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток;
3) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант;
4) использование ПАК или ее соли в качестве стабилизатора;
5) использование ДЭИ в качестве инактиванта ВБ.
Предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) в качестве соли ПАК используют феракрил (ФА);
3) стабилизатор ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
4) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
5) смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
6) полученный препарат используют в жидком виде;
7) полученный препарат высушивают сублимацией.
Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения можно объяснить следующим образом.
Повышение специфической безопасности препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет инактивации ВБ и контаминирующих агентов смесью ПАК или ФА с ДЭИ.
Повышение иммуногенной активности препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет присутствия в вакцине смеси ПАК или ФА с ДЭИ.
Повышение стабильности вакцины, полученной предлагаемым способом, достигается за счет иммобилизации органических веществ в вируссодержащей суспензии с помощью ПАК или ФА.
Снижение реактогенности и аллергенности сухого препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет исключения сапонина и среды высушивания, включающей пептон, сахарозу и желатину, а жидкой вакцины — за счет исключения гидроокиси алюминия и сапонина. ПАК и ФА не являются антигенами.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных;
2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток;
3) внесение инактиванта в вируссодержащую суспензию для инактивации полученного вируса;
4) инкубация смеси;
5) внесение стабилизатора.
По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант;
2) использование ПАК или ее соли в качестве стабилизатора;
3) использование ДЭИ в качестве инактиванта ВБ.
Предлагаемый способ характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) в качестве соли ПАК используют ФА;
3) ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
4) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
5) смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
6) полученный препарат используют в жидком виде;
7) полученный препарат высушивают сублимацией.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого способа, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого способа. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемом способе, изложенных в формуле изобретения.
Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности «новизна».
Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности «изобретательский уровень» заявителем проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.
Известно использование ПАК в качестве стимулятора иммунитета (7, 8).
Известно использование ФА (неполная железная соль полиакриловой кислоты) в качестве гемостатика, обезболивающего средства, а также препарата, обладающего бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микробов (9, 10).
Авторами изобретения установлены новые, ранее не известные свойства ПАК и ее соли ФА повышать вирулицидную и бактерицидную активность ДЭИ при их добавлении в вирусную суспензию перед внесением в нее инактиванта и одновременно служить стимуляторами иммуногенности и стабилизаторами вакцины при ее высушивании или хранении в жидком виде. Последовательное внесение ПАК или ФА и ДЭИ в вирусную суспензию позволили получить стерильную суспензию инактивированного ВБ. В этом случае инактивацию микрофлоры обеспечивает в три раза меньшая концентрация ДЭИ. При использовании каждого препарата в отдельности или порядка их внесения в вирусную суспензию не удалось добиться ее стерильности и стабильности.
Авторами установлено также, что при высушивании ПАК или ФА формируют прочную строму, предотвращающую потери препарата в процессе сушки. Сохранность иммуногенности жидкой вакцины проверена в течении 12 месяцев при температуре 4-8 o C с положительным результатом.
Известно также использование ДЭИ для инактивации вируса ящура (II).
Для инактивации ВБ ДЭИ использован авторами впервые. ДЭИ инактивирует ВБ по реакции первого порядка. Однако исследования по инактивации контаминирующей микрофлоры в образцах суспензии ВБ с помощью ДЭИ показали, что при 37 o C в течение 24 часов концентрация ДЭИ вплоть до 0,3% не всегда обеспечивала стерильность специально контаминированной суспензии. Вопрос получения стерильной суспензии ВБ был решен с помощью ПАК или ФА при добавлении их в вирусную суспензию перед внесением в нее ДЭИ. При этом от использования ПАК и ФА получены одинаковые результаты.
Результаты поиска показывают, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого способа), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого способа преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Для изготовления вакцины против бешенства животных используют фиксированный ВБ штамм «Щелково-51», репродуцированный в суспензионной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в среде Игла, содержащей 5-10% сыворотки и 0,25% гемогидролизата. Культивирование вируса ведут в течение 96-144 часов при температуре 35-37 o C, получая вирусную суспензию с титром инфекционности 5,5-6,5 lg ЛД50/мл. Накопление ВБ в среде культивирования и клетках ВНК-21 происходит без признаков цитопатического действия вируса. По окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию вносят сначала в качестве стабилизатора ПАК м.м.
1.000.000 или ФА до концентрации 0,7-1,0%, а затем — в качестве инактиванта ДЭИ до концентрации 0,1-0,3%. Смесь инкубируют при 37 o C в течение 20-24 часов. Полученную вакцину расфасовывают в 10 мл флаконы для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде. В жидком виде вакцина имеет следующее соотношение компонентов, об.%:
ПАК или ФА — 14-20
ДЭИ — 0,5-1,5
вируссодержащая суспензия — остальное.
Для приготовления сухого препарата жидкую вакцину высушивают сублимацией. Готовую вакцину контролируют на физические свойства, стерильность, иммуногенность, безвредность, авирулентность.
Инактивацию инфекционности ВБ изучали по методике определения величины К50 и в динамике снижения титра инфекционности, используя для этого мышат массой 10-12 г.
К50 — это выраженная в % концентрация ДЭИ, снижающая инфекционность ВБ до уровня 1 ЛД50/0,03 мл в течение 24 часов при температуре 37 o C. К50 рассчитывают по формуле Кербера-Ашмарина
K50= lgDm-lgd(
Li-0,5),
где Dm — концентрация ДЭИ в образце суспензии, обеспечивающая авирулентность ВБ;
d — кратность испытанных концентраций ДЭИ;
L — отношение числа живых мышей к числу зараженных по каждому образцу вирусной суспензии;
i — номер образца суспензии.
Результаты опытов приведены в таблице 1.
Из приведенных в таблице 1 данных следует, что авирулентность суспензий обеспечивала концентрация ДЭИ ниже 0,009-0,012%. Расчетная концентрация ДЭИ, равная 0,004%, снижала инфекционность ВБ до одной ЛД50/0,03 мл.
Известно, что олигомеры этиленимина, к которым относится ДЭИ, инактивируют все вирусы по реакции первого порядка. Для проверки этого факта сняли динамику инактивации ВБ, используя 0,2% концентрацию ДЭИ при 37 o C. Проба суспензии, взятая через час инактивации, имела титр инфекционности o C в течение 24 часов концентрация ДЭИ вплоть до 0,3% не всегда обеспечивала стерильность специально контаминированной суспензии. Контроль стерильности проводили по ГОСТ 28085-89. Вопрос получения стерильной суспензии ВБ был решен с помощью ПАК или ФА при добавлении их в вирусную суспензию до оптимальной концентрации 0,7-1,0% перед внесением в нее ДЭИ. В такой последовательности внесения в вирусную суспензию вышеуказанных препаратов инактивацию микрофлоры обеспечивала в три раза меньшая концентрация ДЭИ.
Различия в количестве ДЭИ, обеспечивающем авирулентность суспензии ВБ (0,009-0,012%) и инактивацию микрофлоры в вирусной суспензии (0,2-0,3%) требовали проведения исследований по влиянию высоких концентраций ДЭИ на иммуногенную активность жидкой и сухой вакцины против бешенства.
Установлено, что иммуногенная активность указанных препаратов не снижалась при увеличении концентрации ДЭИ от 0 до 0,5% (пределы исследований). Следовательно, ДЭИ можно использовать в концентрации 50-кратно превышающей минимально необходимую для инактивации инфекционности ВБ, обеспечивая высочайшую степень специфической безопасности вакцины.
ПАК и ФА, кроме повышения активности ДЭИ, являются стимуляторами иммунитета. При этом они проявляют одинаковую активность. При изготовлении сухой вакцины ПАК и ФА формируют прочную строму, предотвращающую потери препарата в процессе его высушивания сублимацией.
Сохраняемость иммуногенной активности жидкой вакцины проверена в течение 12 месяцев при 4-8 o C с положительным результатом.
Результаты контроля иммуногенной активности на мышах жидких и сухих вакцин против бешенства, изготовленных предлагаемым способом, приведены в таблице 2.
Из приведенных в таблице 2 данных следует, что ФА и ПАК, являясь стимуляторами бактерицидности ДЭИ, существенно повышают иммуногенность как жидких, так и сухих вакцин.
Экономическая эффективность от использования предлагаемого способа будет обусловлена следующими факторами:
1) отсутствием в готовом препарате биологических контаминирующих агентов, способных к репродукции в благоприятных условиях;
2) отсутствием дополнительных органических или неорганических примесей в виде пептона, желатины и сахарозы в сухой вакцине или гидроокиси алюминия и сапонина в жидком препарате;
3) унификацией производства жидкой и сухой вакцины.
Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемого способа следующей совокупности условий:
— способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в области ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
— для предлагаемого способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
— способ, воплощающий предлагаемое изобретение при его осуществлении, обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата: повышение специфической безопасности, иммуногенной активности, стабильности и безвредности вакцины, а также снижение ее реактогенности и аллергенности.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».
1. Авт. свид. СССР N 117464, A 61 K 39/205, 21.11.58 г.
2. Вагабов P. M. Разработка и экспериментальное изучение сухой антирабической вакцины, инактивированной гидроксиламином. Канд. дис. М., 1969, 44-60.
3. Авт. свид. СССР N 770196; C 12 N 7/00, A 61 K 39/205; 23.05.79 г.
4. Лихачев Н.В. Вакцины против бешенства. В кн. Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. М., 1963, 28-38.
5. Пат. РФ N 955577, A 61 K 39/205, 03.03.81 г. (прототип).
6. Временная инструкция по изготовлению и контролю сухой инактивированной культуральной антирабической вакцины. Утверждена ГУБ МСХ СССР 16.09.76 г.
7. Петров Р.В., Хаитов P.M. и др. Иммуногенетика и искусственные антигены. М., Медицина, 1983, 255 с.
8. Химическая энциклопедия. М., БРЭ, 1992, 3, 602 (ПАК).
9. Регистр лекарственных средств России. М. Инфармхим, 1993, 876-877 (ФА).
10. Авт. свид. СССР N 698622, A 61 K 33/26, 22.02.74 г. (ФА).
11. Пат. РФ N 594771, A 61 K 39/12, C 12 N 7/04; 07.05.73 г.
12. ГОСТ 28085-89. Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности.
13. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В. и др. Динамика вирусных болезней животных. Справочник. М., Агропромиздат, 1991, 255-270.
14. Иванов B. C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных инактивированных антирабических вакцин. Вирусные болезни с.-х. животных. Владимир, 1995, 203.
15. Иванов B.C., Скичко Н.Д. Разработка и внедрение в промышленное производство и ветеринарную практику России культуральных инактивированных вакцин против бешенства. Курской биофабрике и агробиологической промышленности России — 100 лет. Тез. докл. науч.-прооизвод. конф., 27-30 августа 1996 г., Курск, 1996, 126-128.
16. Пат. Великобритании N 1551437, C 12 N 7/00, 30.08.79 г.
17. Пат. Великобритании N 1596653, A 61 K 39/205, 26.08.81 г.
18. Пат. США N 4347239, A 61 K 39/205, 31.08.82 г.
19. Пат. США N 4584194, A 61 K 39/205, 22.04.86 г.
20. Пат. США N 4649049, A 61 K 39/205, 10.03.87 г.
21. Пат. США N 4664912, A 61 K 39/205, 12.05.87 г.
22. Пат. США N 4726946, A 61 K 39/12, 23.02.88 г.
23. Пат. Румынии N 87856, A 61 K 39/12, 30.11.85 г.
24. Пат. ЧССР N 238794, A 61 K 39/205, 16.12.85 г.
25. Пат. Швейцарии N 658192, A 61 K 39/205, 31.10.86 г.
1. Способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного вируса бешенства в культуре клеток, внесение инактиванта в вируссодержащую суспензию, инкубацию смеси и внесение в нее стабилизатора, отличающийся тем, что по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант, при этом в качестве стабилизатора используют полиакриловую кислоту или ее соль, а в качестве инактиванта — димер этиленимина.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру перевиваемых клеток ВНК-21.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве соли полиакриловой кислоты используют феракрил.
4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что полиакриловую кислоту или феракрил вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что димер этиленимина вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%.
6. Способ по пп.1-5, отличающийся тем, что смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 ч.
7. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что полученный препарат используют в жидком виде.
8. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что полученный препарат высушивают сублимацией.
источник