Техника исследования на бешенство

Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

источник

Бешенство (Rabies) – инфекционное заболевание, опасное для животных и человека. Данное заболевание встречается во всех странах мира. Характеризуется 100% летальным исходом.

Возбудитель – РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Рабдовирусов. Данный вирус имеет тропность к нервной ткани. В наибольших титрах обнаруживается в головном мозге больных животных. Кроме того, находят вирусы и в спинном мозге, слюнных и слезных железах.
Различают:

1. «дикий» вирус, который циркулирует в естественных условиях и характеризуется высокой патогенностью для человека и животных.
2. И «фиксированный», полученный в лабораторных условиях, не патогенный для животных и человека при экстраневральном введении.

Вирус бешенства не устойчив к высоким температурам: при 60С о инактивируется через 10 минут, при 100С о — почти мгновенно. Но вот в замороженном мозге может сохранять жизнеспособность до нескольких месяцев. Также сохраняется несколько месяцев в гниющих тканях. Устойчив к действию растворов йода. Но быстро инактивируется дезрастворами на основе формалина, хлорамина и щелочи.

К вирусу бешенства восприимчивы все теплокровные. Наибольшей чувствительностью обладают дикие собачьи (такие как: лисицы, песцы, волки, енотовидная собака, шакалы), куньи, грызуны кошки. Менее восприимчивы птицы.

В дикой природе резервуарами вируса бешенства являются хищные животные и летучие мыши, в городе — бродячие собаки.
Источником заражения являются больные животные, у которых вирус выделяется со слюной. Наличие вируса в слюне отмечают уже за 8-10 дней до появления признаков болезни. Заражение происходит при укусе, при попадании слюны на слизистые оболочки или на поврежденные участки кожи.

После проникновения в организм вирус начинает размножаться в месте внедрения. И через 24 часа начинает проникать в нервную ткань. В нервах он продвигается в направлении спинного и головного мозга со скоростью 7 см/день. Добравшись до мозга вирус начинает усиленно размножаться, затем по нервам вирус попадает во все органы и в первую очередь в слюнные железы и глаза. Инкубационный период (от момента заражения до появления клинических признаков) составляет в среднем 14 – 60 дней, иногда может достигать 6-12 месяцев.
Клинические признаки.

Различают 3 вида течения болезни.

1. Классическое трехэтапное течениеили буйная форма. Вначале отмечается изменение поведения животного (1 этап), оно становится очень ласковым или наоборот пугливым, необщительным. Этот этап может длиться от нескольких часов до 4 дней. Затем наступает следующий этап — возбуждения (2 этап), который продолжается 1-4 дня. Животные становятся агрессивными, склонны к блуждающим передвижениям и нападением на животных и людей. Развивается анорексия, беспокойство, слюнотечение. И за 3-4 дня до смерти развиваются паралитическая, или депрессивная, стадия, характеризующаяся прогрессирующими параличами.
2. Паралитическая, или тихая, форма. Характеризуется развитием параличей без предшествующей стадии возбуждения. При этой форме отмечают слюнотечение, отвисание нижней челюсти, затрудненное глотание, анорексию. Затем развивается паралич мышц туловища и конечностей. Смерть животного наступает через 3-4 дня.
3. «Атипичное бешенство». Это хроническое субклиническое (без развития симптомов) течение болезни, которое может длиться до 3 месяцев.

Предварительный диагноз ставят на основании анамнеза и клинических симптомов. При подозрении на бешенство после смерти животного в лабораторию направляют труп животного. При невозможности этого – голову или головной мозг. При взятии материла необходимо соблюдать строгие меры предосторожности!
Лабораторная диагностика бешенства включает в себя несколько методов исследования.

1. Обнаружение телец Бабеша-Негри. Для постановки диагноза на бешенство в лаборатории проводят гистологическое исследование головного мозга умершего животного. Отмечают наличие рабических узелков в структурах дна четвертого желудочка мозга и наличие в головном мозге телец Бабеша-Негри (цитоплазматические эозинофильные включения, состоящий из частиц вируса бешенства). Их можно обнаружить в гипокампе, корковых и стволовых структурах мозга, в мозжечке и дорсальных ганглиях спинного мозга и эпителии роговицы глаза. Однако если тельца Бабеша-Негри не обнаруживаются, бешенство не исключается.
2. Выявление антигена методом флюоресцирующих антител (МФА) или методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФА). Кроме этих реакций в настоящее время идет разработка нового метода диагностики в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
3. Биологическая проба с заражением новорожденных мышат вирусом из взвеси головного мозга, слюнных желез.

Согласно законодательству РФ, в случаях покусов людей собаками или другими животными (кроме явно больных бешенством) пострадавшие должны немедленно обратиться в медицинские учреждения. А покусавшие их животные должны быть доставлены в ближайшее государственное ветеринарное учреждение для осмотра специалистами и карантина в течение 10 дней.

Для профилактики распространения бешенства предусмотрена ежегодная обязательная вакцинация собак и кошек антирабическими вакцинами.

В настоящее время для ввоза животных в ряд стран требуется документ подтверждающий количество валидных антител к вирусу бешенства. Для эффективной защиты от бешенства минимальный уровень вируснейтрализующих антител в крови должен составлять не менее 0,5 МЕ/мл. Данный вид исследования не является диагностическим и предназначен только для определения напряженности иммунитета против бешенства.
В Москве сдать кровь для определения титра антител к вирусу бешенства можно в Центре Молекулярной Диагностики, расположенном на Звенигородском шоссе, д.5. ЦДМ получил международную аккредитацию на проведение данного теста и выдает Международные сертификаты, действительные в течение всей жизни животного при соблюдении сроков ревакцинации.

Определение титров антител проводят не ранее чем через 30 дней после вакцинации. Поэтому если Вы планируете выезжать со своими питомцами в страны ЕС или другие страны, то необходимо заранее позаботиться о вакцинации и сдаче крови на этот тест (результаты выдаются через 7-14 дней).

Врач-лаборант ветеринарной лаборатории
«БиоВетЛаб» Лазарева Н.В.

Инфекционные заболевания: Герпесвирус кошек (ринотрахеит), Панлейкопения кошек, Кальцивирусная инфекция (Кальцивироз кошек) и Бешенство.

Пиометра – достаточно распространенная патология, характеризующаяся заполнением полости матки гноем. Данное гинекологическое заболевание очень часто обусловлено гормональными нарушениями половой системы самок, а так же кистами яичников. Как правило, в группе риска находятся животные старше 6 лет не имеющие потомства, либо снятые с воспроизведения. Но как показала ветеринарная практика, группа животных, имеющих данную патологию, в последнее время «омолаживается» до 2-х лет. Было так же замечено, что у многих животных пиометра начинает развиваться после курса терапии такими препаратами как «контрасекс», «секс-барьер» и другими препаратами, ингибирующими половую активность.

источник

Бешенство — острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с леталь­ным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие жи­вотные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфек­ции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от ме­ста и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1—3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основ­ном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у со­бак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (па­ралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бе­шенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения мо­жет не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Про­никая с периферии (место укуса) по нервным стволам в централь­ную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae,родуLyssavirus. Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион виру­са — РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5—10 мин, солнечный свет — за 5—7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5—10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наруж­ный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих анти­тел, а нуклеокапсидный — комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в централь­ной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культи­вируется на мышах, кроликах, морских свинках и других живот­ных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предваритель­ной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуци­рует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они переда­ют вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основ­ным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, име­ющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным мате­риалом необходимо строго соблюдать меры личной безопаснос­ти: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, ре­зиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защит­ные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством жи­вотных в полевых условиях запрещено.

Получение пат.материала. Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных — голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектици­дами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые меш­ки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика. Она включает: обнаружение вирус­ного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуо­ресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ. На обезжиренных предметных стек­лах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов голов­ного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воз­духе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влаж­ную камеру при 37 °С на 25—30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, спо­ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, нано­сят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуорес­цирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицатель­ным считают результат при отсутствии специфической флуоресцен­ции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, име­ющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве ан­тител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспери­ментальной инфекции (биопроба).

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

источник

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БЕШЕНСТВА

(утверждены 27 февраля 1970 г., б/н)

1. Диагноз на бешенство ставят на основании комплекса эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и главным образом — на основании лабораторных исследований.

2. Для исследования направляют в лабораторию с нарочным: свежий труп или голову от собаки (кошки, лисицы, песца, овцы, теленка и др.), от крупных животных — голову или головной мозг (свежий или консервированный в 30 — 50 %-ном растворе глицерина). Для серологических исследований пригоден только неконсервированный мозг.

3. Лабораторная диагностика бешенства заключается в микроскопическом исследовании головного мозга (с целью обнаружения телец Бабеша-Негри), серологическом (обнаружение специфического рабического антигена), а также в постановке биологической пробы на белых мышах или кроликах.

4. Из головного мозга, поступившего для исследования, делают сначала засев на питательные среды. Часть мозга сразу же помещают в холодильник и сохраняют на случай необходимости повторного исследования. Из оставшейся части мозга берут материал для микроскопического исследования, серологических реакций и биологической пробы.

Примечание . Вскрытие трупа, изъятие мозга и другие работы проводят в стерильных условиях при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, защита рук двумя парами перчаток: хирургическими и анатомическими; для защиты глаз надевают очки, а нос и рот закрывают марлевой повязкой).

5. Для микроскопического исследования делают отпечатки и мазки из разных участков головного мозга.

6. Для приготовления отпечатка кусочки головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в 4 — 6 слоев. К поверхности среза несколько раз (3 — 4) подряд прикасаются чистым предметным стеклом, слегка надавливая, чтобы на стекле получился тонкий отпечаток.

7. Мазки делают из тех же участков головного мозга. Для этого кусочки мозга растирают в фарфоровой ступке пестиком или в пробирке стеклянной палочкой до образования гомогенной массы, из которой делают грубые мазки на обезжиренном предметном стекле.

Можно делать мазки и другим способом. Для этого небольшой кусочек мозга кладут на край предметного стекла, а другим стеклом раздавливают его и размазывают от одного края до другого, в результате чего на поверхности стекла получается тонкий равномерный мазок.

8. Полученные мазки или отпечатки окрашивают одним из следующих способов:

а) окраска по Муромцеву. Изготовленные, еще влажные мазки или отпечатки сразу же фиксируют в этиловом или метиловом спирте или в смеси спирта пополам с эфиром или ацетоном (химически чистым) в течение 1 — 2 ч и после этого промывают водой. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После промывания водой влажные мазки помещают на 5 — 10 мин в раствор краски Мансона, разведенной водой 1:40. Затем краску сливают и тут же мазки погружают в 10 %-ный водный раствор танина на 8 — 10 мин до появления голубоватой окраски. После этого мазки промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном (химически чистым) или спирта с ксилолом й снова высушивают фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон, при этом ядра нервных клеток окрашиваются в синий цвет, а тельца Бабеша-Негри — в бледно-фиолетовый с темными включениями;

б) окраска по Селлерсу. На приготовленный влажный отпечаток или мазок наносят на 4 — с смесь реактива «А» (метиленовый синий — 2 г, метиловый спирт без ацетона — 100 мл) и реактива «Б» (основной фуксин — 0,5 г, этиловый спирт без следов ацетона — 100 мл). Рабочий раствор красителя состоит из 15 мл реактива «А», 2 — 4 мл реактива «Б» и 25 мл метилового спирта. После окраски препарат промывают проточной водой и высушивают. В окрашенном мазке цитоплазма нейронов ярко-синяя, ядрышки темно-синие, эритроциты кирпично-красные, тельца Бабеша-Негри пурпурно-красные с отчетливо видной базофильной структурой телец;

в) окраска по Михину. Мазки или отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира (поровну) в течение 5 — 10 мин, после чего их просушивают фильтровальной бумагой и окрашивают в течение 30 — 40 мин краской Гимза (1 — 2 капли на 1 мл дистиллированной воды), быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96°-ного спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и подвергают исследованию. Если материал был в глицерине, то его предварительно хорошо прополаскивают в воде и просушивают фильтровальной бумагой.

В окрашенном препарате при микроскопическом исследовании основной фон должен быть красным с фиолетовым оттенком. При преобладании синего тона мазок снова обмывают подкисленным спиртом и промывают водой. Пирамидальные нервные клетки имеют синеватый цвет с интенсивно черным ядром, а тельца Бабеша-Негри — розово-красный с точечными включениями темно-синего цвета;

г) окраска по Борману-Гайнуллиной. Тонкие мазки или отпечатки в течение 5 мин фиксируют в смеси следующего состава: спирта и эфира (поровну) — 98 мл, ледяной уксусной кислоты — 2 мл; после фиксации их погружают на 5 мин в 10 % -ный раствор кристаллической соды, а затем промывают водой и просушивают на воздухе. Зафиксированные мазки в течение 2 мин окрашивают краской, приготовленной перед ее употреблением (насыщенного водного раствора метиленовой сини — 3 капли, насыщенного основного раствора фуксина — 2 капли, водопроводной воды — 20 мл). Раствор краски наливают на мазок, фиксируют над пламенем горелки, затем краску оставляют еще на одну минуту, после чего промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. В окрашенном мазке основной фон должен быть ярко-красным, протоплазма нервных клеток окрашивается в красновато-синий цвет, а их ядра — в темно-синий, тельца Бабеша-Негри окрашиваются в землянично-красный цвет с типично гранулярной структурой. Эритроциты имеют вид неокрашенных кружочков.

9. Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Реакция применяется для обнаружения специфического рабического антигена в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, а также у животных, на которых ставилась биопроба. Для реакции можно использовать несвежий (до 1 мес.) головной мозг.

Реакцию выполняют на предметных обезжиренных стеклах, на которые наносят 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 60 °С агарового геля, приготовленного по прописи: сухой агар-агар — 12 — 15 г; химически чистый хлористый натрий — 8,6 г; 1 %-ный раствор (фильтрованный) метилоранжа на 50°-ном спирте — 5 — 10 мл; мертиолят — 0,01 г; вода дистиллированная — 1 л.

Примечание . Для постановки реакции лучше употреблять агар-агар фирмы «Дифко», он полностью растворяется, фильтрование среды не требуется. Другие сорта агар-агара требуют тщательной фильтрации.

После застывания агара в нем делают лунки с помощью тонкостенной металлической или стеклянной трубочки с внутренним диаметром 4 — 5 мм, располагая их согласно трафарету (см. рис. 4 — 7).

Для реакции у крупных животных используют кусочки головного мозга — аммонов рог, кору полушарий, мозжечок, продолговатый мозг; у крыс, сусликов, морских свинок, хомяков и др. — три каких-либо отдела мозга; у мышей — весь головной мозг.

Схема постановки микропреципитации:
А — кора (левое полушарие); В — кора (правое полушарие); С — аммонов рог (левый);
Д — аммонов рог (правый); Е — мозжечок; Ж — продолговатый мозг;
1, 2, 3, 4 — разведений глобулина, соответственно 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Положительная РП со всеми разведениями глобулина
(кора головного мозга овцы, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:4; 1:8, 1:16
(аммонов рог собаки, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:16,
отсутствуют линии преципитации с разведениями 1:2, 1:4,
(продолговатый мозг собаки, уличное бешенство)

Мозг растирают в фарфоровой ступке пестиком или в самой черепной коробке в «пасту», которой заполняют луночки для антигена. Остальные луночки заполняют преципитирующим антирабическим глобулином в разведении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Объем используемых ингредиентов составляет 0,02 мл.

Контроли с положительными и отрицательными антигенами ставят одновременно на отдельном стекле с использованием того же агара по тому же трафарету.

После того как ингредиенты реакции помещены в соответствующие луночки, предметные стекла переносят во влажную камеру (чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой или ватой) и ставят в термостат на 6 ч при температуре 37 — 38 °С. Затем чашки оставляют при комнатной температуре еще на 18 ч.

Учет реакции проводят через 3, 6 и 24 ч после ее постановки. Во избежание высыхания агара стекла с реакцией после каждого просмотра помещают в те же чашки Петри, содержащие увлажненную вату.

При положительной реакции преципитации в агаре между лунками с глобулином и антигеном могут образовываться одна, две и очень редко три параллельно расположенные линии преципитации. Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом приблизительно 45°.

При отрицательных показаниях реакции преципитации ставят биопробу.

10. Реакция иммунофлуоресценции. Основана на выявлении специальными микроскопами (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 и др.) вирусного антигена, вступившего в реакцию со специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующим красителем.

Для реакции делают тонкие и равнослойные отпечатки на тщательно обезжиренных стеклах из свежего или свежемороженого головного мозга. Отпечатки готовят из кусочков головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) так же, как и для микроскопического исследования. От каждого кусочка мозга готовят не менее 4 препаратов. Для контроля аналогично делают препараты из мозга здорового животного.

После высушивания на воздухе препараты фиксируют в ацетоне в течение 4 ч при температуре не выше 4 °С. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После фиксации ацетоном наносят на препараты несколько капель конъюгата (флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин) в рабочем разведении. Затем их помещают во влажную камеру (чашку Петри или закрытый эмалированный кювет с увлажненным дном) на 20 — 30 мин при температуре 25 °С.

После этого препараты промывают водой или фосфатным буферным раствором (pH 7,2 — 7,4) в течение 1 ч, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и подвергают исследованию. Препараты просматривают под иммерсионной системой. Для иммерсии используют нелюминесцирующее масло.

В окрашенном препарате при люминесцентной микроскопии мозговая ткань флуоресцирует (светится) тусклым серовато-желтым цветом. Антиген вируса бешенства выявляется в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины — от едва заметных до имеющих 15 — 20 мкм в диаметре.

В контрольном препарате желто-зеленых интенсивно светящихся гранул не отмечается.

При исследовании с помощью метода флуоресцирующих антител диагноз бешенства считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленоватым свечением различной величины. В контроле подобных образований не должно быть.

При отсутствии положительной флуоресценции ставят биологическую пробу.

11. Биологическую пробу на бешенство ставят, если получен отрицательный результат при микроскопическом исследовании (тельца Бабеша-Негри не обнаружены), при серологических реакциях (специфический рабический антиген не выявлен), а также при выявлении атипичных включений. Биологическую пробу проводят на белых мышах или кроликах.

12. Опытных мышей или кроликов заражают 10 %-ной суспензией из исследуемого мозга на физиологическом растворе или мясопептонном бульоне с pH 7,2 — 7,4. Для приготовления суспензии используются те же участки головного мозга, из которых брали материал для микроскопического и серологического исследований.

Вырезанные участки головного мозга собирают в стерильную пробирку и взвешивают, а затем тщательно растирают в ступке пестиком, после чего добавляют физиологический раствор или мясопептонный бульон из расчета получения 10 %-ной суспензии. Полученную суспензию отстаивают в течение 10 мин и для заражения используют надосадочную жидкость.

Если патологический материал был загрязнен, то надосадочную жидкость сливают в другой сосуд (пробирку) и к ней добавляют по 500 — 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл жидкости, после чего отстаивают еще 30 мин при комнатной температуре и затем используют для заражения. Суспензию необходимо готовить в стерильных условиях и при строгом выполнении правил личной профилактики.

Биологическая проба на белых мышах. Для заражения используют белых мышей массой 8 — 10 г. Для каждого исследования берут 6 мышей, из которых 3 заражают в головной мозг, а 3 — подкожно. При заражении в мозг иглу вводят в точке за линией, соединяющей задние углы и немного в стороне от линии, проходящей посередине головы. Место заражения протирают спиртом. Суспензию вводят в дозе 0,03 мл. Для предупреждения глубокого проникновения иглы в мозг на ее кончик надевают ограничитель — небольшой кусочек резиновой трубки, который укрепляют на расстоянии 2 — 3 мм от конца иглы. При подкожном заражении суспензию вводят в область кончика носа (в верхнюю губу) в дозе 0,05 мл. На месте введения суспензии образуется небольшая припухлость. Зараженных мышей помещают в стеклянные банки и наблюдают за ними в течение 30 сут. При положительном результате биологической пробы у мышей обычно на 7 — 15-й день после заражения развивается клиника паралитического бешенства.

Вначале отмечаются вялость, взъерошенность шерсти и своеобразная горбатость, а также нарушение координации движений. Затем наступает паралич задних конечностей, а позднее — передних, переходящих в общий паралич, заканчивающийся смертью. Продолжительность болезни 2 — 3 сут.

С развитием общего паралича мышей умерщвляют при помощи эфирного или хлороформенного наркоза. У павших и убитых мышей вскрывают черепную полость, делают засев из мозга на питательные среды, после чего извлекают головной мозг, из которого готовят препараты для микроскопического и иммунобиологических исследований.

При отсутствии клинических проявлений бешенства у зараженных мышей в течение 30 сут их уничтожают. Банки, в которых они содержались, тщательно дезинфицируют.

Биологическая проба на кроликах. Для постановки биологической пробы берут 4 кроликов массой не менее 1,5 кг каждый. 2 кроликов заражают в мозг и 2 внутримышечно в области бедра. Суспензию вводят интрацеребрально в дозе 0,2 мл, а внутримышечно — в дозе 2 мл.

При положительном результате биологической пробы кролики заболевают в течение 16 — 21 дня. Заболевание бешенством протекает у кроликов в тихой паралитической форме со смертельным исходом. У павших кроликов извлекают головной мозг и дальнейшее исследование проводят так же, как и при заражении мышей. Наблюдение за кроликами ведут в течение 45 — 50 сут. По истечении указанного срока кроликов уничтожают. Клетки, в которых содержались подопытные животные, дезинфицируют.

1 Гистологическое исследование используют в качестве дополнительного метода

Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога, коры полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и фиксируют в одной или двух порциях ацетона так, чтобы продолжительность фиксации была в пределах 6 — 18 ч.

Лучше фиксацию в ацетоне оставлять на ночь. Затем патматериал проводят через две порции ксилола, выдерживая по 30 мин в каждой, и через две порции парафина — по 1 ч в каждой. Готовые срезы депарафинируют обычным методом и окрашивают по Ленцу или Туревичу:

— окраска по Ленцу. Срезы окрашивают раствором эозина 1 — 3 мин (0,5 г эозина растворяют в 100 мл 60°-ного этилового спирта). Эозин быстро смывают водой и в течение 1 мин окрашивают метиленовой синькой Лефлера, промывают водой, осторожно подсушивают фильтровальной бумагой и дифференцируют раствором ед. кого натра в абсолютном спирте (5 капель едкого натра на 30 мл спирта) до бледно-розового цвета. На препарат наливают раствор уксусной кислоты (1 капля ледяной уксусной кислоты на 60 мл абсолютного спирта) и держат до появления слабо-синей окраски, быстро смывают спиртом и просветляют ксилолом в течение 4 — 5 мин. Тельца Бабеша-Негри окрашиваются в ярко-красный цвет с синими включениями, цитоплазма ганглиозных клеток — в бледно-голубой;

— окраска по Туревичу. Депарафинированные срезы сразу после проводки через спирты и дистиллированную воду окрашивают гематоксилином Вейгерта или Эрлиха, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1 %-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дистиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После промывки обрабатывают смесью (в равных частях) насыщенного водного раствора пикриновой кислоты (на 1 л горячей дистиллированной воды 25 — 30 г пикриновой кислоты) и 96°-ного спирта. При обработке наблюдают отхождение облачков красной краски, и срезы через 10 — 20 с приобретают желтый оттенок. Срезы быстро прополаскивают в воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой. Затем так же быстро проводят через абсолютный или 96°-ный спирт, карбол-ксилол, чистый ксилол и заключают в бальзам. Тельца Бабеша-Негри — вишнево-красного цвета, ядра клеток — черные или синие в зависимости от того, каким гематоксилином они окрашены. По форме и величине тельца Бабеша-Негри весьма разнообразны, находятся в цитоплазме и отростках нервных клеток в виде многочисленных или одиночных экземпляров. Чаще тельца Бабеша-Негри обнаруживают в крупных ганглиозных клетках, причем клетки, содержащие их, не имеют выраженных признаков дегенерации.

Нередко обнаруживают другие включения, которые из-за ряда сходных признаков иногда принимают за тельца Негри. Следует иметь в виду, что в мозге здоровых кошек и белых мышей иногда содержатся неспецифические ацидофильные тельца-включения. Эти тельца можно отдифференцировать от телец Негри по отсутствию внутренних гранул и гомогенности основной субстанции.

Для бешенства также характерны признаки острого энцефаломиелита: преимущественно вокруг мелких вен обнаруживают периваскулярные инфильтраты, состоящие в основном из лимфоидных клеток, имеющих вид клеточных муфт.

В ганглиозных клетках головного мозга могут быть хроматолиз, вакуолизация и острое набухание клеток, а также гибель отдельных клеток. В области поврежденных нервных клеток довольно постоянна пролиферативная реакция глии, принимающая форму истинной нейронофагии с последующим замещением нервных клеток элементами размножившейся глии. Такое скопление клеток пролиферата на месте распавшейся нервной клетки носит название «узелка бешенства» — на срезе иногда можно проследить процесс развития узелка (1).

источник

В настоящее время прижизненный лабораторный анализ на бешенство у собак не разработан. Точный диагноз ставят только после вскрытия животного и обнаружения в головном мозге вирусного антигена и специфических телец Бабеша – Негри. Это обусловлено тем, что возбудитель не проникает в кровь, поэтому найти его методом гематологического исследования невозможно.

Многие владельцы домашних питомцев достаточно поверхностно знают о том, что такое бешенство у собак, каковы первые настораживающие симптомы заболевания и чем грозит укус зараженного животного.

Чаще всего беспечность проявляют жители мегаполисов, наивно полагая, что в условиях города заразиться бешенством невозможно из-за отсутствия в нем представителей дикой природы. Однако такое мнение является ошибочным, так как в данном случае основными переносчиками возбудителя являются бродячие собаки и кошки, крысы и летучие мыши, населяющие свалки, подвалы, чердаки и заброшенные здания.

Бешенство представляет собой смертельно опасное заболевание, протекающее с поражением центральной нервной системы. Больное животное представляет собой угрозу для людей, так как в период развития клинических признаков проявляет неконтролируемую агрессию. После укуса спасти человека может только своевременное введение антирабической вакцины, так как лечение противовирусными препаратами не дает эффекта и болезнь заканчивается летальным исходом.

Распознать больное животное можно по характерным клиническим признакам. Но опасность заключается в том, что у бешенства существует латентный период, длящийся от двух недель до полугода, во время которого собака может заразить человека или другое животное.

Важно! Вирус бешенства выделяется со слюной, и определенное время может сохраняться во внешней среде. Поэтому инфицирование может произойти даже без наличия укуса при соприкосновении с зараженными предметами.

Клиническая картина заболевания может значительно варьировать в зависимости от стадии и формы бешенства. Владельцам стоит знать, что первым симптомом является кардинальное изменение поведения животного. Общительный и ласковый питомец может стать замкнутым, обидчивым, избегающим контакта и отказывающимся от корма. И, наоборот, сдержанный ранее пес может проявлять чрезмерную ласковость и общительность.

Для начальной стадии тихой формы бешенства характерны резкие смены настроения, когда добродушный питомец начинает проявлять беспричинную неконтролируемую агрессию. По мере поражения головного мозга развивается водобоязнь. Собака ищет уединения, скрывается от света, резко реагирует на знакомые звуки и запахи. В результате обильного и постоянного слюнотечения на губах появляется пена.

На заключительной стадии появляются:

Летальный исход наступает через 2-3 суток от блокировки дыхательного центра.

Наиболее часто встречающаяся буйная форма бешенства характеризуется наличием трех фаз развития.

Продромальная стадия:

• частое чередование периодов спокойствия и возбуждения;
• повышение температуры более чем на 1 © от нормы;
• поедание несъедобных предметов;
• стремление к уединению в темном месте;
• клонические судороги;
• водобоязнь;
• охота за мнимыми насекомыми.

Маниакальная стадия:

• неконтролируемая беспричинная агрессия;
• частые приступы рвоты;
• косоглазие;
• обильное слюнотечение;
• параличи;
• изменение тембра лая;
• постоянно отвисшая челюсть и выпавший язык.

Паралитическая стадия:

• снижение температуры тела ниже отметки 38.5 © ;
• отсутствие интереса к внешним раздражителям;
• резкое снижение массы тела;
• параличи.

Все три стадии длятся от 5 до 10 дней и заканчиваются летальным исходом.

Для возвратной формы бешенства характерно приступообразное течение, проявляющееся резким появлением симптомов маниакальной стадии и внезапным их исчезновением. Каждый последующий приступ по силе превосходит предыдущий, и через 2-3 раза наступает смерть.

Ученым до сих пор не удалось выяснить природу абортивной формы бешенства. Загадка заключается в том, что после заражения у животного появляются симптомы продромальной стадии заболевания, которые через 2-4 дня бесследно исчезают и собака становится здоровой.

В мировой практике зарегистрированы единичные случаи данной формы, после чего животные жили еще несколько лет без проявлений рецидивов болезни.

При развитии атипичной формы отсутствует маниакальная стадия, поэтому в клинике заболевания отсутствует агрессия. Вместо этого наблюдается:

• расстройство пищеварения, сопровождаемое рвотой и поносом;
• отказ от пищи;
• атрофия мышц корпуса и конечностей;
• малоподвижность.

Собака погибает от стремительно развивающегося истощения.

Важно! Коварность данной формы заключается в отсутствии характерных для бешенства признаков. Ее легко перепутать с энтеритом и чумой плотоядных, начать симптоматическое лечение животного и подвергнуть свою жизнь смертельной опасности при попадании вируса на поврежденные кожные покровы.

После смерти животного ветеринарный специалист отправляет труп в лабораторию с соблюдением всех правил предосторожности, предусмотренных законодательством, с целью исключения распространения вируса. От собак крупных пород может направляться только голова или головной мозг.

Важно! Исследование материала на бешенство должно проводиться бесплатно и без очереди. О результатах в обязательном порядке сообщается главному врачу города или района.

В лаборатории проводят следующие исследования:

• просматривание окрашенных мазков-отпечатков головного мозга под световым микроскопом с целью обнаружения телец Бабеша-Негри;

• постановка реакции с антирабическим флюоресцирующим иммуноглобулином с последующим просматриванием мазков-отпечатков в поле люминесцентного микроскопа;

• реакция диффузной преципитации (применяется реже, так как процент выявления возбудителя составляет от 45 до 70%);

• биопроба на белых мышах, являющаяся наиболее эффективным методом диагностики бешенства.

Разработан еще ряд исследований, позволяющих установить наличие вируса бешенства (РСК, ИФА, РН, РТГА), но они не нашли широкого применения из-за сложности выполнения и малой эффективности.

Некоторые страны требуют, чтобы в ветеринарных документах на ввозимых собак был указан результат анализа крови на антитела к вирусу бешенства, вырабатываемые в организме животного после прививки.

Данное исследование целесообразно проводить не ранее 30 дней, но не позднее 1 года после вакцинации. В этот период количество антител в крови уже достигает количества не менее 0,05 МЕ/мл (IU/ml), являющегося минимальной допустимой концентрацией.

К сожалению, в России существуют единичные лаборатории, прошедшие аккредитацию и получившие разрешение на проведение подобных тестов. К тому же данное исследование является достаточно дорогостоящим.

источник

Анализ на бешенство у собак подразумевает проведение специальных экспресс-тестов на наличие в крови специфических антирабических антител. Иногда его применяют в комплексной диагностике при подозрении на заражение домашних питомцев вирусом бешенства. Данное заболевание представляет угрозу для жизни животных, человека, поэтому заводчики собак должны иметь понятие о том, как проявляется данный недуг. Если есть подозрение на заражение, если питомец имел контакт с возможным бактерионосителем, нужно сразу отвезти питомца в ветлечебницу, для проведения лабораторной диагностики, без которой невозможно установить точный диагноз.

Бешенство (rabies) – остропротекающее заболевание теплокровных животных инфекционной этиологии, вызываемое вирусом, который поражает ЦНС, провоцируя серьезные нарушения в организме. К сожалению, эффективного лечения на данный момент не разработано, поэтому инфекция всегда заканчивается летальным исходом.

Возбудитель инфекционного недуга – РНК-содержащий вирус (рабдовирус). Поражает домашних и диких животных. Существует так называемый «природный» вирус и «лабораторный».

ВАЖНО! БЕШЕНСТВО ОТНОСЯТ К ЗООАНТРОПОЗООНОЗНЫМ БОЛЕЗНЯМ, ТО ЕСТЬ ИНФЕКЦИЯ ПЕРЕДАЕТСЯ ЧЕЛОВЕКУ. ВСПЫШКИ ИНФЕКЦИИ ОТМЕЧАЮТ ВЕЗДЕ. БОЛЕЗНЬ ИМЕЕТ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЙ ХАРАКТЕР.

Природным резервуаром рабдовируса являются инфицированные плотоядные хищники. Смертельно опасный вирус содержится в слюне инфицированных особей. Инфицирование происходит контактным путем, при укусах, проникновении слюны в ссадины, ранки на дерме.

Проникнув в организм, вирус по нервным путям мгновенно перемещается в головной, спинной мозг, слюнные железы, где в дальнейшем он размножается.

В слюне инфицированных животных рабдовирус появляется примерно за три-семь дней до момента проявления первых симптомов. При этом инфицированная особь уже является вирусуносителем, представляя реальную угрозу для человека, других домашних животных. Поэтому заражение бешенством может произойти даже в том случае, если вас или вашего питомца укусило внешне здоровое животное.

Инкубационный период длиться от 2-7-ми суток до нескольких недель. Интенсивность проявления симптоматики зависит от возраста, резистентности, иммунной защиты, вирулентности, концентрации рабдовируса в организме. Смертельно опасный недуг у животных протекает в тихой, буйной, реже в атипической формах.

У собак отмечают преимущественно буйную форму инфекции, продолжительность которой составляет от шести до десяти суток. Имеет три стадии проявлении:

• Продромальную. Срок протекания меланхолической стадии — не более двух суток. На этом этапе развития инфекции отмечают изменение поведенческих манер собаки. Животные сильно угнетены, выглядят подавленными, прячутся в темных укромных местах, неохотно идут на контакт, неадекватно реагируют на раздражители.
• Маниакальную (стадия возбуждения). Продолжительность течения не более трех-четырех суток. Больные животные проявляют беспричинную агрессию к своим собратьям, другим домашним питомцам, человеку, включая хозяина. Агрессия сменяется ласковым поведением. Питомец требует внимания, лижет руки, лицо человека. Больные питомцы поедают несъедобные предметы. Нередко собаки убегают из дома и могут пробежать без устали 20-30 км.
• Паралитическую (депрессивную). Для данной стадии, продолжительность которой составляет не более шести суток, характерны тяжелые сбои в функционировании ЦНС. Отмечают паралич глотки, гортани, мышечные судороги, спазмы. Нижняя челюсть отвисает. Отсутствует глотательный рефлекс. Из пасти постоянно течет слюна. Громкие звуки, шум воды вызывает сильнейшую панику. Координация движения нарушена. Питомец впадает в кому, погибает от истощения, нарушения дыхательной, сердечной функции.

Стоит отметить, что бешеная собака, независимо от формы и стадии заболевания кусает человека, животных не предупреждая о нападении лаем.

Для тихой формы болезни характерно отсутствие стадии возбуждения. Продолжительность — от двух до пяти суток. Характеризуется общим угнетением, меланхоличностью, отсутствием реакции на внешние раздражители. Животные гибнут из-за паралича мышечных структур тела, глотки. Болезнь всегда заканчивается летальным исходом.

Реже у собак отмечают атипичную форму болезни, которая проявляется нетипичными, нехарактерными для данной инфекции проявлениями. Протекает остро, подостро, реже хронически (два-три месяца). У животных отмечают изменение поведения, сбои в работе ЦНС, ЖКТ.

Заметив нехарактерное поведение своего домашнего любимца, изменение повадок, проявление агрессии, а также если собака имела контакт или была укушена бездомными, дикими животными, обязательно нужно отвезти питомца в ветлечебницу, проверить собаку на бешенство. Не стоит забывать, что симптоматика нарастает спонтанно в определенной последовательности.

При постановке предварительного диагноза должны быть учтены данные анамнеза, паталагоанатомические результаты, эпизоотологическая ситуация, симптомы. Проводится серия лабораторных, гистологических, микроскопических, бактрериологических исследований, экспресс-тесты.

Учитывая схожесть симптоматики с другими инфекциями, проводится дифференциальная диагностика (ИФА, ПЦР). Необходимо исключить болезнь Ауески, чуму плотоядных, энцефаломиелит.

Важно! Если есть подозрение на инфекцию, животное покусало человека, собаку помещают в специальные изолированные боксы и в течение десяти дней, пока не будут готовы результаты анализов, наблюдают за ее состоянием. Если диагноз подтвердился, к сожалению, проводится эвтаназия. Животных усыпляют, поскольку лечения от данной инфекции нет.

Точный диагноз удается установить только после смерти животных. Полученный патматериал исследуют различными методами.

Наиболее достоверный метод, который всегда подтверждает болезнь – микроскопические исследования биоматериала на наличие специфических включений в мозге – телец Бабеша-Негри. Расположеные в аммоновых рогах.

Для обнаружения специфического антигена в мозге применяют реакцию диффузной преципитации, иммунофлуоресцентный анализ отпечатка роговицы.

Иммунофлуоресцентный метод позволяет максимально быстро диагностировать наличие вируса в организме собак. Метод определяет вирусный антиген в 93-97% случаях.

Учитывая то, что вирус перемещается по нервным стволам, его крайне редко удается определить в кровеносном русле. Как правило, при подозрении на заражение для анализов исследуют спинномозговую жидкость.

Серологические исследования заключаются в проведении общего, биохимического анализа крови. Отмечают изменение лейкоцитарной формулы (лейкоцитоз), олигурию, альбуминурию, глюкозурию, увеличение концентрации моноцитов.

Протестировать своего питомца на бешенство, определить напряженность поствакцинального иммунитета позволит тест на наличие специфических антирабических антител в крови. Проводится данная процедура только в аккредитованных лабораториях, некоторых ветклиниках. Стоит отметить, что стоимость данного анализа довольно высока. Результаты после проведения процедуры будут готовы через 10-20 суток.

Сегодня проводится два вида тестов на антирабические антитела – RFFIT (тест быстрого торможения фокуса флюоресценции) и FAVN – тест флуоресцентных вируснейтрализующих антител, который определяет титр антител в МЕ/мл. Данные методики выполняют на живых культурах клеточных структур с добавлением в реакцию возбудителя инфекции. У собак берется 0.5- 1 мл сыворотки крови.

Тест проводят преимущественно в том случае, если вы хотите вывезти своего питомца заграницу. Многие страны ЕС запрещают ввозить на свою территорию не привитых от бешенства животных, а также собак, котов, у которых нет результатов по данному анализу.

Сдавать тест на антитела нужно тогда, когда в крови собаки выработаются антитела к данной инфекции. Специфический иммунитет после иммунизации формируется через месяц после прививки. С этого момента можно везти питомца в лабораторию для прохождения теста на антитела к бешенству. При этом после иммунизации, если возникает потребность в проведении данного теста, от даты прививки не должно пройти более года. Тест нужно сдать не позднее месяца до срока проведения ревакцинации.

Если титр антирабических антител составляет менее 0,50 МЕ/мл – собаку ревакцинируют. Через месяц сдается повторный анализ. На продуцирование защитных антител после иммунизации влияют некоторые факторы: порода, возраст, индивидуальные особенности организма, кратность антирабической иммунизации. Ветврачи рекомендуют проводить мониторинг титра антител у собак, кошек после вакцинации, даже в том случае, если не планируется выезд за границу.

Многие владельцы вывозят своих питомцев на дачу, на природу, в лес, на охоту. Не стоит забывать, что собаку могут покусать дикие звери, которые могут быть инфицированы или являются вирусоносителями.

Единственный способ защитить собаку от смертельно опасной инфекции – своевременно проведенная вакцинация.

В дальнейшем, в зависимости от выбранного препарата, раз год проводится ревакцинация. Некоторые вакцины формируют иммунную защиту сроком на три года. Оптимальную схему вакцинаций, ревакцинаций подберет ветврач.

источник