Анализ днк мужское бесплодие

Помимо диагностирования основных причин мужского бесплодия, мы проводим исследования возможных генетических отклонений мужских гамет, которые также могут являться причиной инфертильности.

Что нужно знать, чтобы понять причины генетических проблем, вызывающих мужское бесплодие?

Соматические клетки: все клетки организма, которые содержат 46 хромосом, кроме половых гамет.

Мужские и женские гаметы: половые клетки, содержащие 23 хромосомы и созревающие в семенниках и яичниках.

Хромосомы, обуславливающие пол: хромосомы Х и Y, присутствующие как в соматических, так и в половых клетках.

Аутосомы: все остальные хромосомы, находящиеся во всех клетках.

Анеуплоидные клетки: клетки с анормальным числом хромосом.

Мейоз: формирование половых клеток; процесс, происходящий только в семенниках и яичниках.

Соматические клетки человека содержат 46 хромосом: 22 пары гомологичных (похожих друг на друга) хромосом, аутосомы (хромосомы с 1 по 22) и две половые хромосомы. Такой набор хромосом называется диплоидным. Мужчины и женщины имеют в своём генетическом коде по 2 хромосомы, обуславливающих их пол: мужчины имеют набор 46XY, а женщины—46ХХ.

Как можно узнать хромосомных нарушениях?

Это можно узнать, проведя анализ крови на кариотип.

В каких случаях показан данный анализ?

Рекомендуется провести анализ крови на кариотип, в случаях:

• Азооспермия
• Олигозооспермия в тяжёлой форме (с астено- и/или тератозооспермией, или без таковых)
• Нормозооспермия с самопроизвольными абортами у партнёрши
• Пациентам, проходящим программу ЭКО+ИКСИ.

Если кариотип не имеет отклонений, имеет смысл делать остальные анализы?

Кроме кариотипных аномалий, могут быть нарушения мейоза, обусловленные фактором гамет (анормальность в соединении гомологичных хромосом, десинапсис, асинапсис). Данные аномалии провоцируют формацию анеуплоидной спермы, которая при оплодотворении овоцита производит нежизнеспособный эмбрион.

Каким образом генетические или хромосомные отклонения влияют на фертильность?

Эти отклонения могут спровоцировать:

• Альтерации сперматогенеза (производство спермы в семенниках)
• Нарушения транспортации спермы
• Формирование спермы с хромосомными нарушениями (анеуплоиды).

Какие генетические или хромосомные дефекты связаны с бесплодием?

В общем, существует множество причин, вызывающих этот недуг, но наиболее часто встречающиеся приведены ниже:

• Конституциональные аномалии хромосом
• Анормальности, обусловленные гаметами
• Частичное разрушение Y-хромосомы
• Мутации в гене CFTR (кистозно-фиброзный трансмембранный регулятор).

Что такое конституциональные хромосомные аномалии?

Данные отклонения поражают хромосомы соматических клеток человека. В общем, эти аномалии могут быть очень сложными, но обычно встречаются их следующие типы: Нумерический (отсутствие и/или превышение числа одной или нескольких полных хромосом) и Структуральный (изменения в структуре одной или нескольких хромосом).

Иногда эти отклонения проявляются в одно и тоже время.

Часто ли встречаются эти аномалии среди пациентов, прибегающих к вспомогательным репродуктивным технологиям?

Обычно вероятность этих аномалий в 13 раз выше у пациентов с бесплодием, чем у остальных людей.

У пациентов, страдающих бесплодием, число конституциональных хромосомных аномалий обратно пропорционально числу сперматозоидов, что повышает риск отклонений от нормы.

Что такое микроразрушение Y-хромосомы?

Нарушения в половых хромосомах встречаются чаще, чем аномалии в аутосомах.

Y-хромосома обуславливает мужской пол и содержит гены, необходимые для сперматогенеза.

В 1976 году стало известно, что 0,5% бесплодных мужчин страдают микроразрушением хромосомы Y (недостаток генетического материала в длинной части хромосомы).Учитывая это, фактор азооспермии Yq (AZF) был принят за постулат.

Используя молекулярный анализ, базирующийся на PCR (Polimerase Chain Reaction— цепная реакция полимеразы), стало возможным подразелить Y-хромосому на 3 зоны: AZFa, AZFb и AZFc, в зависимости от поражённой области Y-хромосомы. Позже стало возможным изолировать набор генов DAZ (Deleted in Azoospermia), находящихся в зоне AZFc.

В каких случаях рекомендовано изучение Y-хромосомы?

Микроразрушению Y-хромосомы подвержены около 10% пациентов с азооспермией (отсутствие сперматозоидов в эякуляте) и около15% пациентов с тяжёлой формой идиопатической олигозооспермии (недостаточное количество сперматозоидов с концентрацией ниже 20 млн/мл).

Большинство микроразрушений приходятся на зону AZFc и таким образом поражают ген DAZ, который во многих случаях обуславливает азооспермию.

В прошлом пациенты с тяжёлой олигозооспермией и микроразрушением Y-хромосомы считались стерильными, однако с приходом техники ИКСИ, у них появилась возможность иметь детей.

Для пациентов с азооспермией и микроразрушением Y-хромосомы появление техники ИКСИ также явилось революционным, равно как и ТЕЗА (Testicular Sperm Aspiration— аспирация сперматозоидов из ткани яичка) и ТЕЗЕ (Testicular Sperm Extraction— экстракция сперматозоидов из ткани яичка).

Лишь в случаях с одновременным поражением всех трёх зон Y-хромосомы—AZFa, AZFb и AZFc—можно дать негативный прогноз, так как в этих случаях сперма оказывается абсолютно непригодна к оплодотворению.

Существует вероятность, что пациенты, страдающие микроразрушением Y-хромосомы и получившие потомство путём ИКСИ, передадут данное заболевание своим потомкам мужского пола (на женщин оно не распространяется, так как проявляется только в мужской Y-хромосоме).

Что такое генетические мутации CFTR?

Фиброзная киста—это самое распространённое аутосомное рецессивное заболевание, поражающее 2000-2500 новорожденных кавказской расы. Более 95% мужчин, страдающих фиброзной кистой—бесплодны.

Ген, чья мутация вызывает фиброзную кисту, в международном обозначении называется Cystic Fibrosis (CF) или Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR); этот ген находится в длинной части (q 31) 7-ой хромосомы. Первый случай мутации гена CFTR был описан в 1987 году; на сегодняшний день описаны более 1000 случаев мутаций этого гена.

При каких диагнозах рекомендовано пройти обследование на мутагенный фактор?

• Азооспермия, вызванная врождённым билатеральным отсутствием спермовыводящих путей;
• Унилатеральное отсутствие спермовыводящего пути при наличии азооспермии или без таковой;
• Обструктивная азооспермия.

В клинической практике изучены 31 наиболее часто встречающиеся мутации гена CFTR. Если у мужчины присутствует мутагенный фактор, становится необходимым провести аналогичное исследование его партнёрши, так как она также может оказаться подвержена этому фактору. Если у обоих родителей он присутствует в равной степени, эмбрион может его унаследовать и в последствии страдать от клинического проявления фиброзной кисты.

В этих случаях очень важно провести PGD (Preimplantation Genetic Diagnostic— Генетическое Диагностирование Эмбриона), чтобы проверить, является ли зародыш простым носителем мутагенного фактора или же он подвержен заболеванию фиброзной кисты.

Каким образом можно узнать степень генетических аномалий спермы?

Несколько лет назад появилась новая техника для хромосомного исследования. Она включает в себя цитогенетику и анализ на молекулярном уровне, и в международном обозначении называется Fluorescent In Situ Hybridation (FISH)—флюоресцентная гибридизация in situ.

FISH проводится на образце эякулята и позволяет анализировать лишь 5 хромосом из 23 (хромосомы 13, 18, 21, X и Y). Тем не менее, хотя это исследование может оказаться полезным и позволить обнаружить отклонения в данных хромосомах, оно недостаточно полное. В конце концов, мы предпочитаем проводить анализ мейоза, который даёт полную картину состояния хромосом.

Что такое мейоз?

Как уже было сказано, соматические клетки человека содержат 46 хромосом (диплоидный набор), а половые клетки (женские и мужские гаметы)—23 хромосомы: единичные копии каждой аутосомы плюс одна половая хромосома (X или Y) (гаплоидный набор) Во время мейоза (вид клеточного деления) тело хромосомы делится пополам, при этом из одной материнской образуются две дочерние клетки, каждая из которых имеет половину хромосомного набора соматической клетки. В результате этого деления образуются сперматозоиды и яйцеклетки, а после оплодотворения восстанавливается нормальный диплоидный набор хромосом. Во время мейоза в дочерних клетках происходят определенные генетические изменения, вызванные образованием перекреста (кроссинговера), таким образом эмбрион наследует генетическую информацию отца и матери.

Каким образом исследуются мейотические нарушения?

С начала 80-ых годов двадцатого века, исследования мейоза являются обязательными при использовании вспомогательных репродуктивных технологий при мужском бесплодии. Обычно они проводятся на основе биопсии ткани яичка; проводя этот анализ андрологи наблюдают за поведением хромосом во время первой и второй фаз мейотического деления.

Что такое биопсия яичка и как она проводится?

Это абсолютно безболезненная амбулаторная процедура, проводимая под местной анестезией. В нижней части мошонки делается маленький надрез (примерно 5мм) и извлекается микроскопический образец ткани яичка. Затем надрез обрабатывается растворимыми волокнами и через некоторое время от него не остаётся и следа. В отдельных случаях после процедуры мужчина может ощущать чувство дискомфорта, но это быстро проходит.

В каких случаях рекомендуется проводить мейотическое исследование?

Некоторые медицинские публикации говорят о 4-8% пациентов с нарушениями мейоза; эти цифры дополняются до 18% в следствие наличия пациентов с олигоастенотератозооспермией (

источник

При мужском факторе бесплодия в 30-50% всех случаев выявляется нарушение структуры или числа хромосом, т.е. генетическое бесплодие.

Процесс сперматогенеза у мужчин контролируется более чем двумя тысячами генов, особенно в половой хромосоме Y.

Мутации генов могут являться причиной нарушения, как самого процесса сперматогенеза, так и морфологии сперматозоидов, их подвижности и общих фертильных свойств.

Многие люди даже не подозревают о наличии носительства мутаций. Как правило, это выявляется при обследовании супружеской пары, когда им не удаётся зачать ребёнка. Мутации в генах бывают и у женщин, и у мужчин. Поэтому анализ кариотипа рекомендуется проводить обоим супругам при всех формах бесплодия или привычного невынашивания беременности.

При генетическом бесплодии в спермограмме у мужчин выявляется:

• Азооспермия (отсутствие спрматозоидов в эякуляте)
• Олигозооспермия (снижение числа сперматозоидов)

Самой частой причиной этого являются мутации Y-хромосомы и мутации в гене CFTR (ген муковисцидоза). Также причиной мужского бесплодия могут быть повреждения ДНК самих сперматозоидов (высокая фрагментация ДНК в сперматозоидах), аномалии в общем наборе хромосом у мужчины, например, синдром Кляйнфельтера (наличие лишней X хромосомы).

Гораздо реже встречается врожденное двустороннее отсутствие семявыносящего протока (генетическая мутация в одной из хромосом 7 пары).

1. наследственность;
2. неблагоприятное влияние окружающей среды (курение, алкоголь, наркотики, инфекционные заболевания, радиация, приём некоторых лекарственных препаратов).

Для выявления данной патологии проводятся исследования:

• венозной крови (анализ кариотипа, анализ микроделеций Y-хромосомы (AZF-фактор и др.), исключение носительства мутаций в гене CFTR);
• анализ эякулята (спермограмма, выявление фрагментации ДНК в сперматозоидах (Halosperm)).

• при бесплодии неясного генеза;
• при тяжёлой олигозооспермии, необструктивной азооспермии;
• в случае привычного невынашивания раннего срока беременности у супруги (наличие 2 и более самопроизвольных абортов в первом триместре беременности);
• при наличии в семье родственников с врождёнными пороками;
• при наличии нескольких неудачных попыток ЭКО.

Генетическое бесплодие вылечить невозможно, но это не означает, что супружеской паре нельзя ничем помочь. Современная медицина располагает методами, позволяющими паре с диагнозом генетическое бесплодие стать родителями здоровых детей. В этом случае рекомендован один из методов вспомогательных репродуктивных технологий – ИКСИ. Т.е. в яйцеклетку, с помощью тончайшей трубочки вводится сперматозоид.

Но для того, чтобы предотвратить риск передачи своему потомству генетических отклонений необходима преимплантационная генетическая диагностика (ПГД). Это исследование (на 4-5 сутки после оплодотворения) даёт возможность провести полную диагностику всего набора хромосом эмбриона. По результатам ПГД в полость матки будут перенесены только здоровые эмбрионы.

источник

Диагностика причин мужского бесплодия

В случае бесплодия в браке следует обследовать обоих супругов с целью установления причин инфертильности. Совокупность тщательного обследования партнеров и точность установленного диагноза во многом определяют успешность лечения и возможность рождения долгожданного потомства.

За последние годы особую значимость как медицинскую, так и социальную, приобрело нарушение репродуктивной функции у мужчин. В России и во многих других странах отмечается увеличение частоты мужского бесплодия. Мужское бесплодие в мире достигает в среднем 30-50%.

Бесплодие у мужчин возникает в результате разнообразных патологических процессов в организме или вследствие влияния различных эпигенетических факторов. Отрицательное воздействие этих процессов на эндокринные и половые железы, центральную нервную систему, непосредственное повреждение половых желез приводят к изменениям дистрофического характера в семенных канальцах и тканях яичка.

Основные причины нарушения репродуктивной функции у мужчин

1. варикоцеле,
2. инфекционно-воспалительные заболевания мочеполовой системы,
3. врожденные аномалии развития половых органов (крипторхизм, гипоспадия),
4. изолированные нарушения семенной жидкости,
5. иммунологические факторы,
6. заболевания других органов и систем (туберкулез, цирроз печени, хронические заболевания дыхательных путей, сахарный диабет, эпидемический паротит, осложненный орхитом, хроническая почечная недостаточность и ряд других),
7. хирургические вмешательства на мочеполовых органах, по поводу паховой грыжи, гидроцеле, операции на мочевом пузыре, стриктуры уретры и другие,
8. применение химиотерапии, лучевой терапии, гормонотерапии, применение сульфаниламидов, нитрофурановых производных, транквилизаторов, средств, снижающих артериальное давление,
9. применение наркотических средств,
10. сексуальные и эякуляторные нарушения,
11. эндокринные факторы (первичный гипогонадизм, вторичный гипогонадизм; гиперпролактинемия, тестостерондефицитные состояния)

Дополнительные факторы, приводящие к бесплодию у мужчин

1. привычные внешние интоксикации: злоупотребление алкоголем, курение,
2. профессиональные внешние интоксикации: контакт с некоторыми органическими и неорганическими соединениями и веществами, воздействие ионизирующей радиации,
3. тепловой фактор: работа в условиях высоких и низких температур, длительное лихорадочное состояние с повышением температуры тела свыше 38 °С,
4. травматическое повреждение половых органов,
5. несбалансированная диета,
6. психологические факторы.

Методы диагностики мужского бесплодия

На первом этапе обследования мужчины рекомендуется консультация андролога с целью проведения сбора анамнеза и выявления факторов риска бесплодия.

Основной анализ для оценки репродуктивного статуса мужчины – спермиологический анализ эякулята (спермограмма). Перед проведением данного анализа рекомендуется воздерживаться от половых отношений в течение 48-72 часов. В этот период не разрешается употребление алкоголя, сильнодействующих лекарств, посещение сауны и бани. Данный анализ позволяет определить количество сперматозоидов, содержащееся в сперме, их подвижность, жизнеспособность и морфологию.

Выявляемые нарушения показателей спермограммы:

• олигозооспермия – снижение количества сперматозоидов (менее 20 миллионов на 1 мл);
• астенозооспермия – уменьшение числа подвижных сперматозоидов;
• тератозооспермия – наличие (более 96%) дефектных сперматозоидов – удвоение головки, изменения шейки и хвостика;
• гипоспермия – уменьшенный объем спермы;
• лейкоспермия – высокое содержание лейкоцитов;
• полиспермия – большой объем спермы (10 и более мл);
• азооспермия – отсутствие в эякуляте сперматозоидов и др.

Если зафиксированы патологические изменения в эякуляте, то рекомендуется повторная сдача анализа через 2 недели.

Дополнительное исследование эякулята, позволяющее выявить число сперматозоидов, которые могут быть покрыты антиспермальными телами, что делает оплодотворение невозможным. При обнаружения 50% и выше сперматозоидов, связанных с антиспермальными антителам ставится диагноз «иммунологическое бесплодие».

Определение уровня ДНК-фрагментации в сперматозоидах

Этот метод позволяет определить число сперматозоидов с нарушенным генетическим статусом. При наличии уровня фрагментации ДНК в сперматозоидах более 15% рекомендуется проведение специфического лечения.

При подозрении на наличие инфекций и воспалительных процессов проводится инфекционный скрининг, включающий:

• мазок из уретры;
• ПЦР-анализ на половые инфекции;
• посев эякулята (в случае повышения лейкоцитов или обнаружения бактерий);
• исследование секрета простаты.

Биохимический анализ эякулята

Также проводится биохимический анализ эякулята (содержание глюкозы и лимонной кислоты, цинка и а-гликозидазы, щелочной фосфатазы).

Гормональное исследование включает определение уровня ФСГ и ЛГ, тестостерона, пролактина и эстрадиола. Оценивается уровень свободных радикалов. Изучается акросомальная реакция, когда сперматозоид контактирует с яйцеклеткой, на его головке происходят химические изменения, позволяющие растворить оболочку яйцеклетки и проникнуть внутрь. Акросомальная реакция характерна только для сперматозоидов с нормальной морфологией.

Исследование спермиев и цитогенетический анализ

Электронно-микроскопическое исследование спермиев и цитогенетический анализ позволяют изучить и выявить патологию внутренних структур спермиев, содержимое плазмы эякулята, количество и качество хромосом. В случае выявления хромосомных аномалий назначается консультация генетика.

Выявление антиспермальных антител и иммунного конфликта

Иммунологическое бесплодие диагностируют при выявлении антиспермальных антител класса М, А и G, а также с помощью тестов Курцрока-Миллера и Шуварского (выявление иммунного конфликта на уровне шеечного канала).

• ультразвуковое исследование щитовидной железы;
• рентгенография черепа и турецкого седла (исключить опухоли гипофиза);
• трансректальное и трансабдоминальное УЗИ (размеры и структура яичек, придатков, предстательной железы, выявить изменения в семенных пузырьках в случае обструкции семявыводящих каналов или их отсутствии);
• допплерография мошонки, трансперитонеальное УЗИ мошонки – помогает установить варикоцеле, водянку яичка и расширение вен малого таза;
• термография мошонки (диагностика варикоцеле);
• вазография (рентгенологическое исследование семявыносящих каналов, семенных пузырьков и выявить очаг обструкции);
• биопсия яичка – в случае идиопатической азооспермии при нормальных размерах яичек и содержания ФСГ в крови (возможны 3 варианта: нормоспермаматогенез – полный набор клеток образующих сперматозоиды в семенных канальцах, гипосперматогенез – неполный набор клеток и асперматогенез – в семенных канальцах нет половых клеток).

источник

Примерно в 40-45% случаев бесплодных браков ответственность лежит именно на мужчине, так как мужское бесплодие является довольно распространенным явлением.

При трудностях с зачатием к врачу должны отправиться оба супруга, обследование мужчины на бесплодие не менее важно, чем женщины.

Существует несколько причин, которые препятствуют естественному зачатию, среди которых: нарушение проходимости семявыносящих путей, иммунологический, психологический фактор и пр. А значит, диагностика мужского бесплодия должна проводиться всесторонне.

Как правило, первый тест на бесплодие у мужчин проводится посредством сдачи эякулята (спермограмма). Она подскажет врачу, как определить причины нарушения фертильности, если они присутствуют. По результатам спермограммы назначаются дополнительные исследования, если это будет необходимо (анализы на мужские гормоны, проверка проходимости семявыносящих путей, эректильной дисфункции и т.п.).

Администрация клиники принимает все меры по своевременному обновлению размещенного на сайте прайс-листа, однако, во избежание возможных недоразумений советуем уточнять стоимость услуг в регистратуре или по телефону 8 (800) 551-99-03 .

Стать отцом – такое желание посещает множество мужчин, однако некоторые из них сталкиваются с трудностями при его воплощении в реальность. Если на протяжении года активной половой жизни без контрацептивов у партнерши не наступает беременность, то становится возможным говорить о таком диагнозе, как бесплодие.

Для успешного преодоления проблемы рекомендуется пройти комплексное обследование, в ходе которого назначается ряд исследований, в том числе анализ на гормоны у мужчин, спермограмма и иные. Многообразие причин бездетности, сложная лабораторная диагностика мужского бесплодия, сложность взаимодействия между мужскими половыми железами с другими органами эндокринной системы — все эти факторы усложняют диагностику и лечение нарушений репродуктивных функций у мужчины. Поэтому обследование лучше проходить в клинике, где для этого есть и необходимое оборудование, и опытные специалисты.

Перед тем как проверить мужчину на бесплодие с помощью лабораторных исследований, специалист собирает и оценивает данные анамнеза, среди которых наибольший интерес вызывают сведения о перенесенных урогенитальных заболеваниях и фертильности (гонорея, хламидиоз, микоплазмоз и пр.). Кроме того, изучается образ жизни пациента, хронические заболевания и перенесенные хирургические операции, которые потенциально могли бы стать причиной невозможности зачатия. Также выясняется, как долго не наступает зачатие, наличие абортов и беременностей у партнерши и т.п. Подобные сведения актуальны, если планируется ЭКО при мужском бесплодии.

Анализы на бесплодие у мужчин начинаются с исследования спермограммы. Данный анализ является обязательным, для получения верных результатов следует воздерживаться от половых отношений 48-72 часа. В этот период не разрешается употребление алкоголя, сильнодействующих лекарств, посещение сауны и бани. Если зафиксированы патологические изменения в эякуляте, то потребуется повторная сдача анализа спустя 2 недели. Аналогичное исследование проводится и при проведении ЭКО при мужском бесплодии.

В рамках спермограммы иногда проводятся некоторые другие анализы при мужском бесплодии. Чаще всего – MAR-тест. Исследование предназначено для выявления числа сперматозоидов, которые могут быть покрыты антиспермальными телами, что делает оплодотворение невозможным. Если таких сперматозоидов зафиксировано свыше 50%, то ставится диагноз «иммунологическое бесплодие».

Согласно которому определяется титр антиспермальных антител в сыворотке крови мужчины и его партнерши.

В ходе которого оценивается выраженность вторичных половых признаков, изучается состояние полового члена, яичек, грудных желез, распределение волосяного покрова на теле. При осмотре врач методом пальпации оценивает размеры, консистенцию и расположение яичек в мошонке.

Позволяет получить сведения об отделяемом мочеиспускательного канала, семенных пузырьков.

• Бактериологический анализ.
• Исследуется секрет предстательной железы.
• Определение группы крови, резус-фактора.
• Биохимический анализ крови.
• Тесты на наличие инфекций.
• Общий анализ крови.
• Анализ на гормоны у мужчин.

Если во время первого этапа обследования не была обнаружена причина бесплодия, то специалист назначает ряд дополнительных анализов и исследований, среди которых:

• Расширенный анализ на гормоны у мужчин (ФСГ, ЛГ, тестостерон, секс-гормон связывающего глобулина), который актуален при выраженной азооспермии и патоспермии.
• Если подозревается опухоль гипофиза, то рекомендуется проверить уровень пролактина.
• Ультразвуковое исследование мошонки, которое проводится также для ЭКО при мужском бесплодии.
• Его цель – исследование структурных изменений и обнаружение патологий в придатках, яичках и предстательной железе.
• Метод ТРУЗИ предназначен для выявления изменений в семенных пузырьках, если присутствуют врожденная агенезия семявыносящего протока либо обструкция их дистальных отделов.
• Доплеровское исследование позволяет обнаружить субклиническое варикоцеле, наличие венозного рефлюкса в системе яичковых вен.
• ИФА совместно с ПЦР для выявления инфекций, передающихся половым путем. Генетические исследования, в том числе кариотипирование.
• Исследование центрифугата эякулята обычно назначается при необструктивной азооспермии.
• Изучение посторгазменной мочи.
• Биопсия яичка с диагностической целью проводится достаточно редко. Чаще всего данная операция требуется для проведения ЭКО при мужском бесплодии.

При планировании беременности посредством ЭКО требуется проведение всестороннего исследования мужского организма, которое состоит из двух этапов.

Первоначально тщательно собирается и изучается анамнез, расшифровываются анализы спермограммы. После этого назначается ряд диагностических мероприятий, результаты которых предоставят полную картину состояния организма мужчины.

Первичные анализы на бесплодие у мужчин заключаются в сборе анамнеза, где содержатся все сведения о том, какими заболеваниями страдал пациент. Проводится осмотр и УЗ-исследование. Также назначаются анализы мужчине на установление иммунологического фактора бесплодия и спермограмма.

Перед сдачей спермы на анализ настоятельно рекомендуется половой покой в течение 48-78 часов. Если же фиксируется патоспермия, то через полмесяца потребуется повторная сдача эякулята.

Определить иммунологическую причину бесплодия можно посредством специальных тестов, благодаря которым определяется наличие антиспермальных антител в эякуляте и сыворотке крови. Для этого назначаются ИФА-титр антител и MAR-тест. Если исследование дает положительный результат, то речь идет об иммунологическом факторе бесплодия.

Проверка на бесплодие у мужчин на втором этапе предполагает исследование гормонального профиля, анализ постооргазменной мочи (при ретроградной эякуляции). Также обязательно определяется наличие возбудителей инфекций в мочеполовой сфере, проводится генетическое обследование.

• Анализы на гормоны мужчине позволяют узнать точный уровень ЛГ, ФСГ, ГСПГ и тестостерона. Если есть подозрение на наличие нарушений в деятельности щитовидной железы либо опухоли в гипофизе, то рекомендуется определить уровень тиреоидных гормонов и пролактина.
• Ультразвуковое исследование предоставляет возможность оценить структуру предстательной железы, а также органов мошонки. Патология семенных пузырьков выявляется с помощью методики ТРУЗИ.
• Диагностика бесплодия у мужчин осуществляется методом допплера. Для этого проводится доплеровское исследование сосудов мошонки, благодаря чему определяется субклиническая форма варикоцеле, а также наличие рефлюкса в яичковой венозной системе.
• Пиоспермия может быть обнаружена в ходе посева спермы с микроскопией эякулята.
• Проверка на наличие ИППП осуществляется методом ИФА и ПЦР-диагностикой.
• Необструктивная азооспермия диагностируется путем изучения центрифугата эякулята.

Если подозревается ретроградная эякуляция, т.е. в мочевой пузырь проникает сперма, то назначается анализ посторгазменной мочи. Столь обширное исследование позволяет выявить точную причину мужской формы бесплодия и назначить квалифицированное лечение.

Чтобы на свет появился здоровый малыш, беременность нужно планировать. Для этих целей также необходимо пройти обследование. Анализы мужчине при планировании беременности покажут имеющиеся отклонения в организме и своевременно пройти лечение. Конечно, перечень исследований при планировании зачатия для мужчин будет короче, чем для женщин — ведь женщина не только участвует в зачатии, от состояния ее здоровья зависит возможность выносить плод. Тем не менее, обследование мужчины перед зачатием является таким же важным.

Если вы ищете, где провериться на различные заболевания мужской половой системы, обращайтесь в клинику «АльтраВита». Здесь можно быстро и без очередей пройти все необходимые исследования и получить по ним консультацию у опытного андролога. Цены на анализ на бесплодие у мужчин здесь вполне доступные.

источник

Тавокина Л.В., Молекулярно-цитогенетическая лаборатория Медицинского центра ООО «Исида-IVF», г. Киев.
Статья опубликована в журнале «Почки», № 2 (08), 2014 год.
Информационный ресурс «Издательский дом Заславский» www.mif-ua.com

В данном обзоре представлены данные о некоторых генетических факторах мужского бесплодия и рассмотрены методы, которые могут быть использованы для его диагностики. Среди генетических факторов выделяют изменения генетического аппарата на уровне гена (мутации), хромосом (хромосомные аберрации), тотальной ДНК (дисперсия хроматина и фрагментация ДНК). Кроме стандартных цитогенетических методов обследования, спермограммы и ДНК-диагностики, существует ряд молекулярно-цитогенетических методов, таких как FISH, TUNEL, SCSA, SCGE, SCD. Углубленное изучение спермы бесплодных мужчин на нескольких уровнях организации генетического материала позволит оценить информативность каждого метода отдельно и в комплексе, а также разработать оптимальный алгоритм для проведения диагностики с целью выбора наиболее эффективного метода лечения мужского бесплодия.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Согласно статистике, в нашей стране около 15 % пар, находящихся в браке, имеют проблемы с зачатием ребенка. По данным ВОЗ, 15 % — это предел, за которым бесплодие становится социальной проблемой. Считается, что если при регулярной половой жизни без контрацепции беременность не наступает в течение года, необходимо начинать обследование и, возможно, лечение супругов. С чего же начать обследование пациентов? Это определяется тем, какой тип бесплодия будет диагностирован у супружеской пары. На сегодня основные формы бесплодия установлены.

Бесплодие является первичным, если беременности никогда не было, и вторичным, если у женщины была хотя бы одна беременность, какой бы исход она не имела (роды, внематочная беременность, выкидыш и т.д.).

При женском бесплодии выделяют несколько форм: трубное, перитонеальное, трубно-перитонеальное, эндокринное, связанное с эндометриозом бесплодие, иммунологическое, психологическое и т.д. Сочетание у женщины нескольких причин бесплодия получило название «сочетанное бесплодие». Сочетанное бесплодие надо отличать от комбинированного, при котором и мужчина, и женщина имеют проблемы с репродуктивным здоровьем. Помимо этих форм выделяют еще такую форму, как идиопатичекое бесплодие, или бесплодие неясного генеза, которое наблюдается среди абсолютно здоровых и хорошо совместимых супружеских пар.

Когда женщина на протяжении определенного времени не может забеременеть, она обращается за консультацией к доктору. Если же оказывается, что она вполне здорова и может иметь ребенка, тогда акушер-гинеколог рекомендует пройти обследование супругу. Однако не каждый мужчина готов спокойно признать, что ему необходима медицинская консультация и помощь.

На сегодня установлено, что причины мужского бесплодия так же, как и женского, очень разно–образны. В числе причин мужского бесплодия рассматриваются эякуляторные, сексуальные, анатомические изменения в строении половых органов, эндокринные расстройства, воспалительные процессы, иммунологический фактор, различные нарушение сперматогенеза, факторы внешней среды и многое другое. На сегодня в структуре причин бесплодного брака мужское бесплодие занимает до 40 %, и ему должно быть уделено такое же пристальное внимание, как и женскому. Возможные осложнения простатита также могут быть причиной бесплодия

В настоящей работе сделан акцент на генетических аспектах мужского бесплодия. Рассмотрение этой проблемы необходимо проводить в двух плоскостях: способность половых клеток мужчин к зачатию ребенка и способность развития зародыша после зачатия.

Известно, что генетические факторы обусловливают по крайней мере 30–50 % всех случаев тяжелых форм бесплодия у мужчин. Сперматогенез является сложным биологическим процессом, который зависит от точно контролируемого каскада активации и деактивации определенных генов. Результатом работы этих генов является процесс созревания сперматозоидов из клеток-предшественников (сперматогониев). У человека в этот процесс вовлечено более 2000 генов. По причине генетических нарушений могут возникнуть разные по своей этиологии и степени тяжести формы бесплодия: от незначительных нарушений сперматогенеза до полной дисфункции гонад.

Среди генетических факторов мужского бесплодия выделяют три основных: изменения генетического аппарата на уровне хромосом (хромосомные аберрации), на уровне гена или группы генов (мутации), на уровне тотальной ДНК (дисперсия хроматина и фрагментация ДНК). Вот почему кроме стандартных морфологических, биохимических тестов при мужском бесплодии рекомендовано применять молекулярно-цитогенетические и молекулярно-генетические методы, которые позволяют оценить состояние генетического аппарата соматических и половых клеток у мужчин.

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ, ИЛИ КАРИОТИПИРОВАНИЕ

Это исследование позволяет увидеть изменения на уровне хромосом в соматических клетках (например, лимфоциты крови) и определиться с конституциональными особенностями пациента. Многими работами показано, что среди мужчин с бесплодием и нарушением сперматогенеза в 5–15 % случаев обнаруживают хромосомные изменения, числовые или структурные. При этом аномалии гоносом (половых хромосом Х и Y) составляют 75 %, а аутосом (неполовых хромосом) — 25 % [2].

Наиболее распространенными являются синдромы Клайнфельтера (кариотип 47, ХХY; частота 1,5 на 1000 новорожденных), дисомия Y (кариотип 47, ХYY; частота 1 на 1000 новорожденных).

Внешние половые органы у таких пациентов, как правило, сформированы по мужскому типу; для них характерен микроорхизм, который является одним из важнейших клинических критериев данных синдромов. Объем эякулята редко достигает 1,5 мл, проявляется азооспермия. При выявлении олигозооспермии целесообразно проведение молекулярно-цитогенетического (FISH-теста) исследования клеток эякулята для выявления мозаичной формы синдромов. При мозаичной форме с преобладанием клона 46,ХY описаны фертильные мужчины, хотя они, как правило, имеют повышенную частоту специфических и неспецифических хромосомных аберраций (поломок) в сперматозоидах [3]. При диагностике у пациента азооспермии, но с присутствием клеток-предшественников сперматозоидов в яичках возможно применение методов искусственного оплодотворения с забором генетического материала непосредственно из яичка путем биопсии. Описано рождение здоровых детей, зачатых таким образом. На данный момент также возможно использование метода предымплантационной генетической диагностики для выбора эмбрионов с нормальным набором хромосом до эмбриотрансфера в цикле экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Частота структурных хромосомных аберраций в кариотипах мужчин с бесплодием различна в разных исследованных выборках и колеблется в пределах 1,6–4,2 % [2, 4]. По данным других авторов [5], в группе пациентов — кандидатов на оплодотворение in vitro методом ICSI (внутрицитоплазменная инъекция сперматозоида, ИКСИ) этот показатель достигает 13,1 %. В последнем случае показаниями для цитогенетического обследования служили мужской фактор бесплодия и неудачные попытки ЭКО.

У мужчин с бесплодием встречаются кариотипы с хромосомными аберрациями типа сбалансированных перестроек: транслокации (робертсоновские и реципрокные), маркерные хромосомы, инверсии. По данным литературы, если популяционная частота, например, таких сбалансированных транслокаций не превышает 0,1 %, то их частота в группах мужчин и женщин с репродуктивными проблемами достигает 3,0–6,2 и 0,7–9,8 % соответственно [5]. Из числа сбалансированных перестроек в кариотипах мужчин чаще всего обнаруживается дериватная (производная) хромосома, которая образовалась в результате транслокации между 13-й и 14-й хромосомами — der(13;14)(q10;q10) [6, 7]. Важно знать, что сбалансированные перестройки хромосом при их формировании не приводят к потере или добавлению генетического материала, а только к перемещению его в пределах генома. Их носители, как правило, фенотипически нормальны и здоровы, но имеют риск рождения ребенка с хромосомной патологией. Напротив, присутствие несбалансированной перестройки (делеции и дупликации) в кариотипе пациента меняет дозовое соотношение генов, поэтому их носительство сопряжено с существенными отклонениями от нормы.

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) — это метод молекулярной цитогенетики, с помощью которого можно точно идентифицировать конкретную хромосому или ее части. Это является особенно важным при диагностике хромосомных микроаномалий: микроделеции/микродупликации (метод сравнительной геномной гибридизации, или CGH), не выявляемых традиционным кариотипированием микроделеционных синдромов, мозаицизма хромосом и многого другого. Метод FISH широко используется для исследования интерфазных ядер половых клеток (сперматозоидов) на предмет обнаружения численных хромосомных нарушений (анеуплоидий). Такие аномалии могут встречаться у мужчин как с нормальным кариотипом, так и с измененным, однако с разной частотой. Доказано, что в последней группе их частота выше [8].

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Эти методы необходимо использовать для исключения мутаций на уровне гена или группы генов (AZF-локус, мутации гена CFTR, определение количества CAG- повторов в гене AR, связанных с изменением чувствительности к андрогенам, и многие другие).

Делеции AZF-локуса. Помимо аномалий кариотипа наиболее частой генетической причиной бесплодия у мужчин являются делеции Y-хромосомы, захватывающие локус AZF (Azoospermia factor region — область фактора азооспермии). Делеции AZF-локуса связаны с различной степенью нарушения сперматогенеза — от умеренного снижения его активности (гипосперматогенез) до практически полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах — синдром «только клетки Сертоли».

В 1996 г. Vogt и соавт. на основе полученных данных о локализации и размере делеций предложили выделить в локусе хромосомы Yq11.21-q11.23 три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc [9]. В настоящее время для мужчин с тяжелой формой олигозооспермии единственно эффективным методом преодоления бесплодия является ИКСИ, а для пациентов с азооспермией — ИКСИ в сочетании с извлечением тестикулярных сперматозоидов с помощью ТЕЗА или ТЕЗЕ. В настоящее время использование репродуктивных технологий позволяет иметь собственных детей мужчинам-носителям микроделеции Y-хромосомы. Однако существует риск передачи данной микроделеции Y-хромосомы мальчикам (в 100 % случаев), а также повышенный риска рождения детей с мозаицизмом 45,X/46,XY (т.е. с синдромом Тернера, смешанной дисгенезией гонад или другой формой гермафродитизма) [10].

Согласно данным В.Б. Черных с соавт. [10], с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в группе мужчин с азооспермией микроделеции были обнаружены у 12,7 %, а в группе с олигозооспермией тяжелой степени — в 8 % случаев. Причем в некоторых случаях отсутствие субрегионов AZFb и AZFc было обусловлено наличием макроделеций — терминальных делеций длинного плеча Y-хромосомы с точками разрыва в локусе Yq11.2, которые можно было видеть при цитогенетическом анализе. Частота микроделеций Y-хромосомы равна примерно 1 на 1000–1500 мужчин. Исследования ДНК Y-хромосомы показали ее высокую полиморфность [11]. Основной причиной высокой частоты микроделеций Y-хромосомы являются ее нестабильность и склонность к потере генетического материала.

Принято рекомендовать определение кариотипа и анализ микроделеций Y-хромосомы всем мужчинам с бесплодием при количестве сперматозоидов в эякуляте менее 5 млн/мл, а также мужчинам из супружеских пар, которым планируется программа ЭКО или ИКСИ. По результатам генетических тестов и медико-генетического консультирования оценивается степень риска рождения детей с нарушением репродуктивной функции. Также для оценки характера происхождения Y-микроделеций (мутация de novo или унаследованная) необходимо молекулярно-генетическое обследование отца, братьев и других мужчин семьи пробанда.

Мальчики же, рожденные после применения ИКСИ у отцов с микроделециями в Y-хромосоме, подлежат диспансерному наблюдению для оценки их фертильного статуса.

Мутации гена CFTR. Трансмембранный регулятор муковисцидоза (англ. CFTR — Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) — это белок, участвующий в транспорте ионов хлора через мембрану клетки. Такое же название имеет ген, кодирующий этот белок. Наличие мутаций в обеих копиях гена CFTR ведет, как правило, к развитию самого распространенного наследственного аутосомно-рецессивного моногенного заболевания — муковисцидоза, а также может быть причиной мужского бесплодия [12]. Ген CFTR человека расположен на длинном плече хромосомы 7 в области q31. На данный момент известно более 900 видов различных мутаций гена CFTR. Около 70 % случаев заболевания муковисцидозом обусловлено делецией трех пар оснований, кодирующих аминокислоту фенилаланин в 508-м положении трансмембранного регуляторного белка — delF508(?F508). Помимо этого, наблюдаемая у мужчин обструктивная азооспермия в 25 % случаев является следствием одностороннего или двухстороннего врожденного отсутствия семявыносящих протоков, которое возникло по причине мутаций в гене CFTR. Поэтому скрининг перед процедурой ИКСИ обязательно включает молекулярно-генетические исследования этого гена. Для диагностики данной мутации используется метод ПЦР в реальном времени.

Делеция в SRY-локусе. В генетической детерминации развития по мужскому типу, формировании яичек, процессов сперматогенеза особо важен ген SRY (Sex- determining Region Y), который расположен в коротком плече Y-хромосомы (Yp11.3). Именно в этом гене обнаружено наибольшее количество мутаций, связанных с дисгенезией гонад и/или инверсией пола. При отсутствии участка хромосомы, содержащего ген SRY, или мутации в указанном гене фенотип будет женский при мужском кариотипе 46,ХУ (синдром Свайера). Напротив, при женском кариотипе 46,ХХ, но в присутствии встроенного в результате транслокации в Х-хромосому или даже аутосому локуса с геном SRY фенотип будет мужским (синдром де ля Шапеля). Но такие мужчины, как правило, бесплодны. Тестирование на наличие SRY-локуса можно проводить FISH-методом, а мутации в этом локусе выявляются методами ПЦР в дополнение, конечно, к традиционному кариотипированию.

Ген, кодирующий андрогеновый рецептор. Другим определяющим фактором мужского бесплодия является нарушение гормональной регуляции сперматогенеза, ключевую роль в котором играют мужские половые гормоны андрогены. Они взаимодействуют со специфическими андрогеновыми рецепторами, определяя развитие мужских половых признаков и активируя сперматогенез. Для гена андрогеновых рецепторов характерно наличие последовательности повторов CAG (цитозин — аденин — гуанин). Ген, кодирующий андрогеновый рецептор, находится в Х-хромосоме. Андрогеновые рецепторы содержатся в клетках семенников, простаты, кожи, клетках нервной системы и других тканей. От количества повторов в гене андрогенового рецептора зависит чувствительность рецептора к тестостерону, причем связь обратно пропорциональная: чем больше повторов, тем рецептор менее чувствительный. При увеличенном количестве CAG-повторов у мужчин возрастает риск развития олиго– и азооспермии. Верхней границей нормы для определения риска генетической предрасположенности к гормонозависимому нарушению сперматогенеза является 23 CAG-повтора. По некоторым источникам, диапазон 20–26 повторов считается относительной нормой [13].

Таким образом, при планировании беременности комплексное генетическое тестирование на хромосомные и основные генные мутации помогает выявлять проблемы по мужской линии, не выявляемые другими тестами (биохимическими, цитологическими, иммунологическими и т.д.), и принять решение о тактике лечения пациента.

ФРАГМЕНТАЦИЯ ТОТАЛЬНОЙ ДНК

В последние годы накапливается все больше данных о том, что кроме хромосомных и генных мутаций значительную роль в проблеме бесплодия играет изменение структуры самой ДНК сперматозоидов. Широкую популярность приобрела гипотеза о том, что снижение репродуктивной функции иногда связано с патологическим состоянием общей ДНК сперматозоидов (фрагментированость — наличие одноцепочечных и двухцепочечных разрывов ДНК, неправильная упаковка хроматина и др.).

Поскольку в норме ДНК должна иметь определенную конформацию, химическую и физическую структуру, то любое незначительное повреждение ДНК или ее упаковки может привести к неправильному развитию событий после проникновения такого дефектного сперматозоида в яйцеклетку [14]. Важным является то, что не всегда дефектный сперматозоид внешне выглядит патологическим. Еще не доказана связь между состоянием ДНК сперматозоида и показателями спермограммы. А это особенно важно при проведении процедуры ИКСИ, поскольку сперматозоиды, которые подбираются для цикла на основе нормальной морфологии, могут иметь повреждение на уровне молекулы ДНК. По многочисленным данным литературы, снижение количества спермиев с поврежденной ДНК существенно повышает шансы получить беременность, которая нормально развивается [15, 16]. И наоборот, сперматозоид с фрагментированной ДНК может оказывать влияние на ранние этапы эмбрионального развития, особенно на формирование бластоцисты. Такая беременность замирает на ранних этапах развития зародыша.

С целью исследования состояния тотальной ДНК (дисперсии хроматина и фрагментации ДНК) используют методы TUNEL (Terminal uridine deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling), SCSA (sperm chromatin structural assay), SCGE (Single Cell Gel Electrophoresis), SCD (sperm chromatin dispersion).

В норме содержание сперматозоидов, несущих фрагментированную ДНК, не должно превышать, по данным разных авторов, 20–30 %.

Патофизиологические механизмы, ведущие к фрагментации ДНК, не вполне ясны. Предполагается, что их причиной могут быть нерепарированные повреждения ДНК, дефекты ремоделинга хроматина, возникающие в ходе сперматогенеза, окислительные процессы и апоптоз (программируемая гибель клетки). Сперматозоиды чрезвычайно чувствительны к апоптотическим стимулам, таким как высокие дозы химиотерапии, к генотоксическим факторам окружающей среды (например, курение) и др.

Подходы к преодолению повышенной фрагментации в сперматозоидах человека только начинают разрабатываться [17]. На сегодня известны следующие:

• технология обработки спермы, которая способствуют обогащению образца клетками с интактной нормально упакованной ДНК;
• преодоленияе высоких показателей фрагментации ДНК в эякуляторных сперматозоидах с помощью замещения их тестикулярными сперматозоидами со значительно более низкими показателями;
• использование антиоксидантной терапии;
• донация сперматозоидов при плохом качестве бластоцист и неудачных циклах ЭКО.

Таким образом, анализ фрагментации ДНК сперматозоидов может служить эффективным прогностическим инструментом, выявляющим мужской фактор нарушения фертильности.

Из вышесказанного следует, что причины мужского бесплодия часто не лежат на поверхности, а требуют тщательного изучения одновременно на нескольких уровнях. Только сопоставив данные морфологических, биохимических, цитогенетических и молекулярных исследований, можно судить о реальном репродуктивном потенциале пациента и выбрать соответствующую тактику лечения.

Углубленное изучение спермы бесплодных мужчин на нескольких уровнях организации генетического материала позволит оценить информативность каждого метода отдельно и в комплексе, а также разработать оптимальный алгоритм для проведения диагностики мужского бесплодия. Возможно, комплексный подход, а именно всестороннее изучение качества спермы, даст более полную картину патологического процесса и, следовательно, большую эффективность лечения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Borini A., Tarozzi N., Bizzaro D., Bonu M.A., Fava L., Flamigni C., Coticchio G. Sperm DNA fragmentation: paternal effect on early post-implantation embryo development in ART // Hum. Reprod. Advance Access published. — 2006. — V. 21, Issue 11. — P. 2876–2881.

2. Ворсанова С.Г., Берешева Л.З., Казанцева Л.З., Демидова И.А., Шаронин В.О., Соловьев И.В., Юров Ю.Б. Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных аномалий у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции // Проблемы репродукции. — 1998. — № 4. — С. 41–46.

3. Cozzi J., Chevret E., Rousseaux S. Achievment of meiosis in XXY germ cells: study of 543 sperm karyotypes from an XY/XXY mosaic patient // Hum. Genet. — 1994. — V. 93. — P. 32–34.

4. Mikelsaar R., Lissitsina J., Punab M. Cytogenetic analyses of families with fertility problems // Сongress/Lab. Med. — 2006. — № 1. — Р. 171.

5. Peschka B., Leygraaf J., van der Ven K., Montag M., Schartmann B., Schubert R., van der Ven H., Schwanitz G. Type and frequency of chromosome aberrations in 781 couples undergoing intracytoplasmic sperm injection // Human Reprodaction. — 1999. — V. 14, № 9. — Р. 2257–2263.

6. Стефанович Г.В., Бутенко В.Л., Бариляк І.Р. Цитогенетичні дослідження статевих та соматичних клітин при безплідді // ІІІ з’їзд медичних генетиків України: Тези доп. — Львів, 2002. — С. 36.

7. Scriven P.N., Flinter F.A., Braude P.R., Mackie Ogilvie C. Robertsonian translocation reproductive risks and indications for preimplantation genetic diagnosis // Human Reprodaction. — 2001. — V. 16, № 11. — Р. 2267–2273.

8. Luca Gianoroli, M.Cristina Magli, Giorgio Cavallini, Andor Crippa, Marco Nadalini, Luca Bernardini, Giuseppe F. Menchini Fabris, Silvia Voliani, Anna P. Ferraretti. Frequency of aneuploidy in sperm from patients with extremely severe male factor infertility // Human Reprodaction. — 2005. — V. 20, № 8. — Р. 2140–2152.

9. Vogt P.H. еt al. AZF deletions and Y chromosomal haplogroups: history and update based on sequence // Hum. Reprod. Update. — 2005.

10. Черных В.Б., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Ширшова Л.С., Чухрова А.Л., Ковалевская Т.С., Полякова А.В., Гоголевский П.А., Калугина А.С., Морина Г.В., Тогобецкий А.С., Здановский В.М., Гоголевская И.К., Крамеров Д.Н. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований // Медицинская генетика. — 2003. — Т. 2. — С. 367–379.

11. Jobling M.A., Samara V., Pandya A. et al. Recurrent duplication and deletion polymorphism on the long arm of the Y chromosome in normal males // Hum. Mol. Genet. — 1996. — Vol. 5. — P. 1767–1775.

12. McCallum T.J., Milunsky J.M., Cunningham D.L., Harris D.H., Maher T.A., Oates R.D. Fertility in men with cystic fibrosis: an update on current surgical practices and outcomes // Chest. — 2000 Oct. — 118(4). — 1059–62.

13. Guadalupe S.M.-G. et al. Genetic Screening in Infertile Mexican Men: Chromosomal Abnormalities, Y Chromosome Deletions, and Androgen Receptor CAG Repeat Length // Journal of Andrology. — 2008.

14. Tesarik J., Mendoza C., Greco E. Paternal effects acting during the first cell cycle of human preimplantation development after ICSI // Hum. Reprod. — 2002. — 17. — 184–189.

15. Baker M., Aitken R.J. Reactive oxygen species in spermatozoa: methods for monitoring and significance for the origins of genetic disease and infertility // Reprod. Biol. Endocrinol. — 2005. — 3, 67. — 1477–7827.

16. Findikli N., Kahraman S., Kumtepe Y. Assessment of DNA fragmentation and aneuploidy on poor quality human embryos // Reprod. Biomed. Online. — 2004. — 8, 2. — 196–206.

17. Маркова Е.В., Замай А.С. Фрагментация ДНК в сперматозоидах человека (обзор литературы // Проблемы репродукции. — 2006. — Т. 12, № 4. — С. 42–50.

источник

Способ лечения мужского бесплодия при высоком показателе днк-фрагментации эякуляторных сперматозоидов

Владельцы патента RU 2685797:

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для лечения мужского бесплодия. Производят открытую биопсию яичка и забор тестикулярных сперматозоидов при высоком показателе ДНК-фрагментации эякуляторных сперматозоидов. Перед выполнением биопсии осуществляют цветное ультразвуковое доплерографическое исследование кровотока в субкапсулярных отделах внутрияичковых артерий. Забор сперматозоидов осуществляют из сектора яичка с показателем максимальной систолической скорости кровотока не менее 5,0 см/с. Полученные сперматозоиды используют в процедуре интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов с ооцитами, полученными в тот же день путем трансвагинальной пункции. Способ обеспечивает получение потенциально качественного биоматериала для оплодотворения яйцеклеток при мужском факторе бесплодия, обусловленном высоким показателем ДНК-фрагментации эякуляторных гамет в результате прицельного хирургического извлечения сперматозоидов из изначально фиксированного сектора вмешательства, с учетом допплерографии яичек. 2 ил., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно, к урологии, и может быть использовано для лечения мужского бесплодия при высоком показателе ДНК-фрагментации эякуляторных сперматозоидов. Способ позволяет осуществить забор из яичка сперматозоидов, наиболее пригодных для использования в программах вспомогательных репродуктивных технологий и повысить показатель рождаемости.

В настоящее время частота бесплодия в браке составляет от 15 до 20%. В России показатель превышает 17%. В большинстве стран мира данная проблема имеет тенденцию к росту [Божедомов В.А., 2015; Гамидов С.И. и соавт., 2013].

Доля мужского фактора в бесплодном браке составляет около 50%. В 30-40% случаев мужское бесплодие носит идиопатический характер [Nieschlag S. Et al. Andrology: Male Reproductive Health and Dysfunction. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg 2010]. Более чем в 40% наблюдений, в связи с отсутствием эффекта от терапии, пары вынуждены прибегать к лечению бездетного брака методами вспомогательных репродуктивных технологий.

На сегодняшний день определение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов не рутинный метод исследования в клиниках, занимающихся репродуктивным здоровьем. Тем не менее, целостность структуры ДНК мужской половой клетки является важным элементом, определяющим оплодотворение яйцеклетки, предимплантационное развитие эмбрионов, риски потерь беременности на ранних сроках и ассоциируется с развитием врожденных пороков развития у потомства [Simon L, Brunborg G, Stevenson M, Lutton D, McManus J, Lewis SE. Clinical significance of sperm DNA damage in assisted reproduction outcome. Hum Reprod 2010; Simon L. et al. Sperm DNA damage has negative association with live birth rates after IVF. Reprod. Biomed 2013].

Высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов (более 15%) является сложно преодолимой формой мужского бесплодия. Основными признанными этиологическими факторами, приводящими к разрывам цепочек ДНК гамет признаны: варикоцеле, инфекционно-воспалительные заболевания полового тракта, вредные привычки (курение, алкоголь), профессиональные вредности (высокие температуры, контакт с тяжелыми металлами, ионизирующее излучение), метаболические нарушения, сахарный диабет, расстройства эякуляции, прием гаметотоксичных медикаментов. И в этих случаях, лечение носит этиотропный характер. Но нередко генез фрагментации ДНК остается невыясненным.

Исследования демонстрируют отрицательную корреляцию между показателем ДНК-фрагментации сперматозоидов и частотой наступления и развития клинической беременности в программах вспомогательных репродуктивных технологий, как экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), так и ИКСИ (интрацитоплазматической инъекции сперматозоида). Высокий уровень ДНК-фрагментации ассоциируется с низким показателем рождаемости после процедур ЭКО/ИКСИ [Lynne Robinson Ioannis D. Gallos Sarah J. Conner Madhurima RajkhowaDavid Miller Sheena Lewis Jackson Kirkman-Brown Arri Coomarasamy. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis Human Reproduction, Volume 27, Issue 10, 1 October 2012, Pages 2908-2917; M.H. Коршунов, E.C. Коршунова, С.П. Даренков. Прогностическая ценность показателя ДНК фрагментации сперматозоидов в успехе программ вспомогательных репродуктивных технологий. Эмпирическая антиоксидантная терапия в коррекции ДНК-фрагментации на фоне патологического окислительного стресса эякулята. Экспериментальная и клиническая урология. №3 2017. Стр 70-76].

Таким образом, преодоление бесплодия у мужчин с идиопатическим высоким показателем ДНК-фрагментации сперматозоидов имеет особую актуальность.

На сегодняшний день методы коррекции патологического уровня ДНК-фрагментации сперматозоидов неясного генеза основываются на эмпирическом подходе.

Медикаментозная коррекция представлена антиоксидантной и гормональной терапией.

Антиоксиданты — биологические и химические соединения, которые нивелируют выраженность окислительного стресса в организме, в том числе семенной жидкости. Это группа органических нутриентов, которые включают: витамины, провитамины, минералы, активные ингредиенты растительного происхождения. Их назначение может улучшить качество спермы и снизить фрагментацию гамет.R. Aitken и соавторы провели метаанализ 20 клинических работ о влиянии использования различных препаратов с антиоксидантным профилем действия в коррекции ДНК-фрагментации сперматозоидов, сочетающейся высокой активностью свободных радикалов спермы. Авторы указали, что антиоксидантная терапия является эффективным методом коррекции патоспермии и окислительного стресса, однако на сегодняшний день нет абсолютных доказательств клинической эффективности использования антиоксидантов, особенно при ДНК-фрагментации [Gharagozloo, P., Aitken, R.J. The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy. Hum. Reprod 2011, 26(7); 1628-40]. Кроме того, в ряде случаев назначение антиоксидантов может приводить к ухудшению интеграции генома сперматозоида, вследствие неконтролируемого подавления физиологического уровня свободных радикалов эякулята, необходимого для процесса гаметогенеза.

Альтернативным методом лечения является назначение синтетического рекомбинантного фолликулостимулирующего гонадотропина. Garolla А. с соавторами описали положительный эффект подкожного назначения данного гормона мужчинам с идиопатическим повышенным уровнем ДНК-фрагментации сперматозоидов [Garolla A. et al. FSH treatment in infertile males candidate to assisted reproduction improved sperm DNA fragmentation and pregnancy rate. Endocrine. 2017 Мау;56(2):416-425]. Важно отметить, что наилучший ответ на данный вид терапии отмечается у пациентов с изначально невысокими показателями фолликулостимулирующего гормона сыворотки крови и ДНК-фрагментации и напрямую коррелирует с наличием рецепторного полиморфизма ФСГ p.N680S [Simoni М et al. Treatment with human, recombinant FSH improves sperm DNA fragmentation in idiopathic infertile men depending on the FSH receptor polymorphism p.N680S: a pharmacogenetic study. Hum Reprod. 2016 Sep;31(9): 1960-9].

Поведенческая терапия, направленная на снижение уровня ДНК-фрагментации, основана на получении свежих эякуляторных сперматозоидов. Было отмечено, что меньший срок полового воздержания с предварительными режимом частых эякуляций может привести к улучшению качества спермы и повысить эффективность процедур вспомогательных репродуктивных технологий. Данный метод сложно использовать у больных с нарушенной эякуляторной и сексуальной функциями.

Вышеперечисленные инструменты в большинстве случаев могут оказывать благотворный эффект на целостность цепочек генома мужской половой клетки. Но есть категория пациентов с аномально высокими значениями фрагментации, при которых данные лечебные манипуляции оказываются безуспешными. Сохраняющийся высокий показатель ДНК-фрагментации сперматозоидов может стать причиной повторных неудачных протоколов ЭКО/ИКСИ, обусловленных низким качеством полученных эмбрионов, остановкой их развития после 3-х суток культивирования или выкидышами на ранних сроках гестации.

Несколько экспериментальных исследований показали, что сперматозоиды могут повреждаться свободными радикалами на посттестикулярном уровне в процессе пассажа по семявыносящим путям. При этом было доказано, что у мужчин с данной формой патоспермии, показатель фрагментации тестикулярных сперматозоидов в 2,5-3 раза ниже эякуляторных. Клинические работы показали, что при мужском факторе бесплодия, обусловленном аномально высоким показателем фрагментации ДНК, использование тестикулярных гамет для оплодотворения в процедуре ИКСИ, в сравнении с эякуляторными, приводит к достоверно лучшим показателям рождаемости. [Moskovtsev SI1, Jarvi K, Mullen JB, Cadesky KI, Hannam T, Lo КС. Testicular spermatozoa have statistically significantly lower DNA damage compared with ejaculated spermatozoa in patients with unsuccessful oral antioxidant treatment. Fertil Steril. 2010 Mar 1;93(4):1142-6. Esteves SC. et al. Comparison of reproductive outcome in oligozoospermic men with high sperm DN A fragmentation undergoing intracytoplasmic sperm injection with ejaculated and testicular sperm. Fertil Steril. 2015 Dec;104(6):1398-405; Коршунов M.H., Коршунова E.C., Даренков С.П. Клиническая эффективность использования тестикулярных сперматозоидов в программах вспомогательных репродуктивных технологий при высоком показателе ДНК-фрагментации. Урологические ведомости. 2017 Т. 7 (S):57-58]. Последний источник является наиболее близким аналогом заявленного изобретения. Данный метод лечения оптимален для пациентов, имеющих в анамнезе безуспешные попытки консервативной терапии и неудачные протоколы вспомогательных репродуктивных технологий. Важным моментом является то, что в описываемой литературе сперматозоиды получали по стандартным методикам (путем закрытых и открытых биопсийных вмешательств) без оценки васкуляризации сегментов яичка — «вслепую». Однако, возможно различие в качестве продуцируемых сперматозоидов в сегментах testis. Сперматогенез сложный многоэтапный процесс и на этапах дифференцировки и пролиферации высокочувствителен к гипоксическим воздействиям. В процессе выполнения биопсийного пособия «вслепую» не представляется возможным определить участок яичка для забора с потенциально хорошим качеством сперматозоидов.

Допплерографическое ультразвуковое исследование является признанным методом диагностики в андрологической практике. Показано, что показатели кровотока органов мошонки напрямую коррелируют с функцией гонад и фертильностью. [Schurich М, Aigner F, Frauscher F, Pallwein L. The role of ultrasound in assessment of male fertility. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. 2009;144 Suppl 1:S192-8]. Так, предоперационное допплерографическое ультразвуковое сканирование яичек может быть полезным инструментом при обследовании пациентов с обструктивной и необструктивной формами азооспермии, так как позволяет определить область, наиболее благоприятную для поиска или забора сперматозоидов хирургическим путем, являясь своего рода предиктором. [Nowroozi MR, Ayati М, Amini Е, Radkhah K, Jamshidian Н, Delpazir A, Ghasemi F, Rajabzadeh Kanafi A. Assessment of testicular perfusion prior to sperm extraction predicts success rate and decreases the number of required biopsies in patients with non-obstructive azoospermia. Int Urol Nephrol. 2015 Jan;47(l):53-8]. В случаях достаточной концентрации сперматозоидов в эякуляте, их нахождение в яичках не представляет технических сложностей. Существующий метод мультифокальной биопсии яичка, основанный на заборе гамет из разных участков, позволяет эмбриологу выбрать сперматозоиды для оплодотворения по внешним качествам. Но морфологическая характеристика не коррелирует с эффективность процедур ЭКО/ИКСИ, в отличие от целостности структуры генома гаметы, что может быть напрямую связано с состоянием кровотока. К тому же прицельная биопсия позволяет избежать избыточной травматизации органа.

В литературе не выявлены сведения о корреляции скоростных показателей кровотока в артериях яичка с показателем фрагментации сперматозоидов.

Задачей настоящего исследования является разработка способа эффективного лечения мужского бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий при высоком показателе ДНК-фрагментации эякуляторных сперматозоидов.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение потенциально качественного биоматериала для оплодотворения яйцеклеток при мужском факторе бесплодия, обусловленным высоким показателем ДНК-фрагментации эякуляторных гамет за счет прицельного хирургического извлечения сперматозоидов из изначально фиксированного сектора вмешательства, с учетом данных допплерографии яичек.

Для решения задачи при оплодотворении в процедуре ЭКО/ИКСИ используют гаметы, полученные методом открытой биопсии из участка яичка с наилучшими показателями интрапаренхиматозного кровотока, то есть с показателем максимальной систолической скорости кровотока в субкапсулярных отделах внутрияичковых артерий не менее 5,0 см/сек. Полученные из такого участка яичка сперматозоиды имеют уровень фрагментации ДНК менее 15%.

При этом на этапе подготовки супружеской пары к процедуре вспомогательных репродуктивных технологий мужчине выполняется ультразвуковое допплерографическое исследование органов мошонки. Определение кровоснабжения дает возможность оперирующему хирургу прицельно выбрать зону для забора сперматозоидов из яичек.

Способ осуществляют следующим способом.

На этапе предоперационной подготовки пациенту выполняют ультразвуковое исследование органов мошонки с использованием спектрального датчика в режиме допплерографии. Яички полипозиционно делят по секторам (фигура 1). Сканирование проводится по всей проекции органа: передняя и задняя поверхности, медиальная, латеральная области, верхний, средний и нижний сегменты. Регистрируется скорость систолического кровотока в субкапсулярных отделах внутрияичковых артерий (см/сек) в каждом секторе. Результаты фиксируются на бланке (фигура 2).

В день трансвагинальной пункции яичников и получения ооцитов выполняется биопсия яичка. Выбор стороны проведения операции изначально основывается на результатах допплерографии: с максимальными значениями интрапаренхиматозного кровоснабжения.

Продольным срединным разрезом острым и тупым способом выделяется яичко до белочной оболочки. В соответствии с маркировкой анатомо-топографического состояния кровотока в сегменте с показателем максимальной систолической скорости кровотока в субкапсулярных отделах внутрияичковых артерий не менее 5,0 см/сек прицельно иссекается небольшой участок тестикулярной ткани. После предварительной микроскопической оценки эмбриологом материала в случае достаточного количества забранных сперматозоидов для оплодотворения ооцитов, выполняется послойное ушивание оболочек яичка. Полученные сперматозоиды после предварительной обработки в специальных средах используются в процедуре ИКСИ. Таким образом, прицельное хирургическое извлечение сперматозоидов с изначально фиксированным сектором вмешательства, с учетом данных допплерографии яичек, позволяет получить потенциально качественный биоматериал для оплодотворения яйцеклеток при мужском факторе бесплодия, обусловленным высоким показателем ДНК-фрагментации эякуляторных гамет.

Супружеская пара с диагнозом: Первичное бесплодие. Мужской фактор. Астенотератозооспермия. Высокий показатель ДНК-фрагментации сперматозоидов неясного генеза. Неудачные попытки ЭКО/ИКСИ. Возраст пациента — 42 года. Длительность бесплодного брака 10 лет. Репродуктивный статус супруги без патологии. По результатам спермиологического исследования выраженная астенозооспермия, незначительное снижение процента морфологически нормальных сперматозоидов и высокие цифры индекса ДНК-фрагментации гамет — 65%. При обследовании мужчины данных за соматическую патологию и заболевания репродуктивного тракта не выявлено. Вредные привычки отрицает. До обращения в анамнезе у пары 2 неудачных попытки ЭКО/ИКСИ, в обоих случаях наблюдалась высокая степень фрагментации эмбрионов (эмбрионы b, be и с классов), беременность после эмбриотрансферов не наступила. Проведение антиоксидантной терапии улучшило параметры эякулята, как подвижность, так и число морфологически нормальных форм сперматозоидов. Существенной положительной динамики индекса фрагментации ДНК сперматозоидов не наблюдалось — он варьировал от 50-60%. Учитывая положительную динамику параметров эякулята, принято решение о проведении повторного протокола ЭКО/ИКСИ. В 3 попытке были получены эмбрионы со средней степенью фрагментации (класс ab и b), после переноса эмбриона беременность не наступила. На основании анализа предыдущих попыток ЭКО, решено провести протокол ЭКО/ИКСИ с использованием тестикулярных сперматозоидов. На предоперационном этапе выполнено цветное ультразвуковое допплерографическое исследование яичек с полипозиционным разделением по секторам. Показатели скорости систолического кровотока субкапсулярных отделов внутрияичковых артерий (см/сек) зафиксированы в каждом секторе. Результаты анатомо-топографически регистрированы. В день трансвагинальной пункции, после короткого протокола стимуляции супруги и получения 8 ооцитов качества МИ, выполнена открытая биопсия левого яичка. Выбор стороны вмешательства был обусловлен показателями гемодинамики. Биопсия яичка выполнена по общепринятой методике. Интраоперационно, в соответствии с данными секторальной допплерографии, из двух сегментов яичка (с максимальным и минимальным кровоснабжением — 5,4 и 2,5 см/сек соответственно) в достаточной концентрации получены сперматозоиды. На этапе предварительной микроскопической оценки различий в качестве материала зафиксировано не было. Гаметы помещены в 2 маркированные чашки с буферной средой — с учетом показателей перфузии. Часть сперматозоидов из обеих чашки в равных долях использована для оплодотворения яйцеклеток методом ИКСИ, остальной биоматериал проанализирован на степень фрагментации методом sperm chromatin dispersion test. Результат анализа тестикулярных сперматозоидов на фрагментацию составили 12% и 18% из участков с большими и меньшими значениями систолического кровотока в яичке соответственно. Число и качество эмбрионов на пятые сутки культивирования были достоверно выше при использовании гамет, полученных из локуса яичка с лучшим кровоснабжением, вследствие чего данные эмбрионы были использовали для переноса в полость матку. Зафиксирована клиническая беременность. Роды в срок 39 недель.

Супружеская пара с диагнозом: Вторичное бесплодие. Мужской фактор. Олигоастенозооспермия. Высокий показатель ДНК-фрагментации сперматозоидов неясного генеза. Неудачная попытки ЭКО/ИКСИ. Спорадическая потеря беременности. Возраст пациента — 32 года. Длительность бесплодного брака 7 лет. Репродуктивный статус супруги в пределах нормы. По результатам спермиологического исследования олигоастенозооспермия и высокий показатель ДНК-фрагментации сперматозоидов — 42%. Мужчина соматически здоров. Вредных привычек нет. В анамнезе одна попытка ЭКО/ИКСИ с низким показателем эмбриогенеза: остановка развития эмбрионов и формирование одной бластоцисты качества 2 ВС.После переноса эмбриона зафиксирована клиническая беременность, замершая на сроке 4-6 недель гестации. Проведение антиоксидантной терапии и назначение фолликулостимулирующего гонадотропина не улучшило параметры эякулята, фрагментация сперматозоидов составила 41%. Следующий протокол ЭКО/ИКСИ выполнялся с использованием тестикулярных сперматозоидов. На дооперационном этапе проведено цветное ультразвуковое допплерографическое исследование яичек с полипозиционным разделением по секторам. Показатели скорости систолического кровотока субкапсулярных отделов внутрияичковых артерий (см/сек) зафиксированы в каждом секторе. В день трансвагинальной пункции, после короткого протокола стимуляции супруги и получения 12 ооцитов качества МП, выполнена открытая биопсия правого яичка. Интраоперационно, в соответствии с данными секторальной допплерографии, из трех сегментов яичка (с максимальным, средним и минимальным кровоснабжением — 5,1; 4,7 и 2,2 см/сек соответственно) в достаточном количестве получены сперматозоиды. Предварительная световая микроскопическая оценка различий в качестве материала не зафиксировала. Гаметы помещены в 3 маркированные чашки (с учетом показателей гемодинамики) с буферной средой. Сперматозоиды из 3 участков в равных долях использованы для оплодотворения яйцеклеток методом ИКСИ, остальной биоматериал проанализирован на степень фрагментации методом sperm chromatin dispersion test. Результат анализа тестикулярных сперматозоидов на фрагментацию составили 10, 15 и 20% из участков с большим, средний и меньшим значениями систолического кровотока соответственно. Сравнительный анализ показал, что, несмотря на то, что показатель оплодотворения и число эмбрионов статистически не различались при использовании сперматозоидов из разных сегментов, качество эмбрионов было выше при оплодотворении гаметами, полученными из локуса яичка с лучшим кровоснабжением (более 5 см/сек). После эмбриотрансфера развилась клиническая беременность. Роды в срок 38 недель.

Способ лечения мужского бесплодия при высоком показателе ДНК-фрагментации эякуляторных сперматозоидов, включающий открытую биопсию яичка и забор тестикулярных сперматозоидов, отличающийся тем, что перед выполнением биопсии осуществляют цветное ультразвуковое доплерографическое исследование кровотока в субкапсулярных отделах внутрияичковых артерий, а забор сперматозоидов осуществляют из сектора яичка с показателем максимальной систолической скорости кровотока не менее 5,0 см/с, полученные сперматозоиды используют в процедуре интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов с ооцитами, полученными в тот же день путем трансвагинальной пункции.

источник