1 отделение психиатрии, геттингенский университет, геттинген, отделение психиатрии и психотерапии, университет Эрланген-Нюрнберг, Эрланген, 3Брукер Далтроник, Лейпциг, 4Парацельс-Елена Клиник, Кассель, 5 отделение неврологии, Университет Ульма, Штайнхёвелстр, Ульм, Германия и 6Бригам и женская больница, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, США
Поскольку дифференциальный диагноз деменции, основанный на установленных клинических критериях, часто затруднен, биомаркеры для применимого диагностического тестирования в настоящее время подвергаются интенсивному исследованию. Амилоидные бляшки, депонированные в мозге пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, деменция с телами Леви (DLB) и деменцией болезни Паркинсона (PDD) в основном состоят из карбокси-терминально удлиненных форм амилоид-бета (Aβ) -пептидов, таких как Aβ1-42. Абсолютные уровни Aβ1-42 в CSF показали диагностическую ценность для диагностики болезни Альцгеймера, но дискриминация между болезнью Альцгеймера, DLB и PDD была низкой. Недавно установленный количественный анализ Aβ-натрий-додецилсульфат-полиакриламид-гель-электрофорез на основе мочевины с использованием западного иммуноблота (Aβ-SDS-PAGE / иммуноблот) показал высококонсервативную картину Aβ-пептида укороченных карбокси-концевых пептидов Aβ 1-37, 1 -38, 1-39 в дополнение к 1-40 и 1-42 в человеческом CSF. Мы использовали Aβ-SDS-PAGE / immunoblot для исследования CSF у 23 пациентов с болезнью Альцгеймера, 21 с DLB, 21 с PDD и 23 бездушными контрольными заболеваниями (NDC) для специфических для болезни изменений пептидных структур Aβ в его абсолютных и относительных величин. Диагностические группы были сопоставлены по возрасту и тяжести деменции. Настоящее исследование является первой попыткой оценить значение пептидных структур Aβ в CSF для дифференциальной диагностики трех нейродегенеративных заболеваний — болезни Альцгеймера, DLB и PDD. Паттерны Aβ-пептидов отображали специфические для болезни вариации, а отношение дифференциально измененных Aβ1-42 к уровням Aβ1-37 впоследствии различали все диагностические группы друг от друга на очень значительном уровне, за исключением DLB от PDD. Кроме того, новый новый пептид с Aβ-подобной иммунореактивностью постоянно наблюдался в CSF у всех 88 исследованных пациентов. Значительное процентное увеличение этого пептида в DLB позволило значительно различать ПДД. Используя точку отсечения 0,954%, этот маркер дал диагностическую чувствительность и специфичность 81 и 71% соответственно. Из нескольких строк указания мы рассматриваем этот пептид как представляющий собой окисленную α-спиральную форму Aβ1-40 (Aβ1-40 *). Увеличение численности Aβ1-40 *, вероятно, отражает специфическое для болезни изменение метаболизма Aβ1-40 в DLB. Мы заключаем, что Aβ-пептидные структуры отражают специфические для болезни патофизиологические пути различных синдромов деменции как различные нейрохимические фенотипы. Хотя образцы пептидов Aβ не соответствовали требованиям к единственному биомаркеру, их комбинированная оценка с другими биомаркерами является перспективной в диагностике нейрохимической деменции. Стоит отметить, что DLB и PDD демонстрируют различные клинические временные курсы, несмотря на их сходный невропатологический облик. Их различные молекулярные фенотипы подтверждают мнение о различных патофизиологических путях для каждого из этих нейродегенеративных заболеваний.
Амилоид-бета (Aβ) -пептиды образуют основной компонент амилоидных бляшек, депонированных в мозге пациентов, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера (Glenner and Wong, 1984), деменция с телами Леви (DLB) (Jendroska et al., 1997) ) и деменция болезни Паркинсона (PDD) (Jendroska et al., 1996).
Aβ-пептиды получают из трансмембранного предшественника-белка амилоида (APP), расщепляемого двумя ферментами, β- и γ-секретазой (Haas and Selkoe, 1993). Предполагается, что отдельные активности γ-секретазы ответственны за образование либо усеченных карбокси-терминально (Ct-усеченных), либо удлиненных (Ct-удлиненных) Aβ-пептидов в соответствии с Aβ1-40 (Citron et al., 1996). Расщепление APP на δ-секретазу приводит к получению удлиненного аминогруппы (A-удлиненного) Aβ-пептида (Simons et al., 1996).
Дифференциальный диагноз деменции, основанный на установленных клинических критериях, часто бывает затруднен в течение жизни, а селективное снижение Aβ1-42 в CSF пациентов с болезнью Альцгеймера широко изучено как диагностический биомаркер для обеспечения точности диагностики в течение жизни. Недавно проведенный экспертный опрос показал, что он адекватен применимому диагностическому тесту болезни Альцгеймера в дополнение к клиническим критериям (Andreasen et al., 2003). Снижение уровня Aβ1-42 также было зарегистрировано для пациентов с DLB (Andreasen et al., 2001; Mollenhauer et al., 2005) и PDD (Mollenhauer et al., 2005). Таким образом, специфичность этого открытия и, следовательно, его дифференциальная диагностическая ценность при различении разных подтипов деменций была низкой (Andreasen et al., 2001, 2003; Mollenhauer et al., 2005).
В количественном анализе на основе мочевины Aβ-натрий-додецилсульфат-полиакриламид-гель-электрофорез с западным иммуноблотом (Aβ-SDS-PAGE / immunoblot) недавно выявлено регулярное количество Ct-усеченных пептидов Aβ 1-37, 1-38, 1- 39 в дополнение к 1-40 и 1-42 в CSF. Этот образец пептида Aβ выявил специфические для болезни вариации в его абсолютных и относительных количествах в CSF пациентов с болезнью Альцгеймера, болезнью Крейтцфельдта-Якоба (CJD), хроническими воспалительными заболеваниями и другими нейропсихиатрическими заболеваниями (Wiltfang et al., 2002, 2003).
Чтобы оценить значение этого открытия для дифференциального диагноза деменции, мы исследовали 88 пациентов с возрастом, страдающих болезнью Альцгеймера, DLB, PDD и различными нейропсихиатрическими заболеваниями для специфических для болезни штаммов Aβ-пептидов.
Мы смогли продемонстрировать специфические для болезни вариации пептидных структур Aβ в CSF для каждой из диагностических групп, которые допускают очень значительную дискриминацию и могут отражать патофизиологические пути подтипов деменции.
Образцы Aβ пептидов анализировали с помощью Aβ-SDS-PAGE / иммуноблотта (Wiltfang et al., 2002) в CSF пациентов с болезнью Альцгеймера, DLB, PDD и бездомным контролем заболеваний (NDC). В общей сложности 88 пациентов были разделены на четыре диагностические группы в соответствии с их клиническим диагнозом и были проверены на существенные различия в абсолютных и относительных значениях Aβ-пептида. Пациенты были отобраны в период с 1999 по 2004 год и из амбулаторной клиники деменции. Средний возраст не различался между диагностическими группами. Экзамен по мини-психическому статусу (MMSE) (Folstein et al., 1975) проводился на пациентах, страдающих когнитивными нарушениями во время поясничной пункции. Оценка MMSE существенно не отличалась между диагностическими группами деменций (болезнь Альцгеймера, DLB, PDD) и была значительно различной для группы NDC (P = 2,0 × 10-6).
Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации (Всемирная медицинская организация, 1996 г.) и одобрено комитетом по этике Университета Геттингена. Исследования проводились с информированного согласия всех пациентов или, для пациентов с тяжелой деменцией, их ближайших родственников.
Все 23 пациента (8 мужчин и 15 женщин) этой группы выполнили критерии диагностики и статистических руководств (DSM) IV для болезни Альцгеймера и Национального института неврологических и коммуникативных расстройств и ассоциации заболеваний и связанных с ними заболеваний (String-Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association) (NINCDS-ADRDA) критерии клинической диагностики вероятной болезни Альцгеймера (McKhann et al., 1984). Возраст этой группы составил 69,5 ± 11,5 лет (среднее ± стандартное отклонение). MMSE был доступен для 22 пациентов. Одному пациенту подвергся синдром-курз-тест (SKT) вместо MMSE. Показатель SKT составлял 20, что указывает на умеренную форму деменции. Средний показатель MMSE составлял 18,4 ± 5,1 (среднее ± стандартное отклонение) в этой группе.
Все 21 пациент (15 мужчин и 6 женщин) этой группы выполнили критерии DSM IV для слабоумия и критерии McKeith для клинической диагностики вероятного DLB (McKeith et al., 1996). Возраст этой группы составил 71,5 ± 6,6 года (среднее ± стандартное отклонение). MMSE был доступен для 20 пациентов. Один пациент отклонил когнитивное тестирование. Он проявлял умеренные когнитивные нарушения во время поясничной пункции, и невропатологический посмертный анализ подтвердил этому пациенту случай DLB. Средняя оценка MMSE составляла 18,1 ± 5,3 (среднее ± стандартное отклонение) в этой группе.
Все 21 пациент (16 мужчин и 5 женщин) этой группы выполнили критерии DSM IV для лечения деменции и клинические диагностические критерии болезни Болиского банка Великобритании Parkinson для идиопатической болезни Паркинсона (Gibb and Lees, 1988). Все пациенты в этой группе представили паркинсонизм по крайней мере за год до начала деменции в соответствии с критериями McKeith et al. (1996). Возраст этой группы составил 72,4 ± 6,8 лет (среднее ± стандартное отклонение). Показатель MMSE составлял 17,7 ± 7,3 (среднее ± стандартное отклонение) в этой группе.
Эта группа состояла из 23 пациентов без суицида (4 мужчин и 19 женщин), которые прошли поясничную пункцию по другим дифференциальным диагностическим причинам; ни один из этих пациентов не обнаружил клинических признаков нейродегенеративного заболевания. Возраст этой группы составил 68,5 ± 9,0 лет (среднее ± стандартное отклонение). MMSE оценивали подгруппу из 11 пациентов, страдающих депрессией с когнитивными жалобами. Оценка составила 27,7 ± 3,1 (среднее ± стандартное отклонение). Один пациент, страдающий от большой депрессии, отклонил когнитивное тестирование. Когнитивные нарушения у всех депрессивных пациентов улучшились после приема антидепрессантов. В группу входили также пациенты, страдающие височной эпилепсией (n = 1), гидроцефалией нормального давления (n = 2), церебральными транзиторными ишемическими атаками (n = 1), метастазами в мозг (n = 1), периферической инфекцией герпеса (n = 1), рак молочной железы (n = 1), паралич периферического лицевого нерва (n = 1), системный васкулит (n = 1), компрессия спинного мозга (n = 1) и грыжа межпозвонковых дисков (n = 1).
CSF отбирали у пациентов с помощью поясничной пункции, отбирали в пробирках из полипропилена и центрифугировали (1000 г, 10 мин, 4 ° С), а аликвоты 200 мкл хранили при -80 ° С в течение 24 ч для последующего одно- и двухмерного Анализ Aβ-SDS-PAGE / иммуноблоттинг.
Предварительно аналитическая концентрация CSF с помощью иммунопреципитации (IP) была проведена ранее (Wiltfang et al., 2002). Молекулярные антитела 6E10 (Senetec Drug Delivery Technologies Inc, США) и 1E8 использовали аминоконцевые селективные мышиные мышиные моноклональные антитела, по сравнению с карбокси-терминальными селективными 13E9 и 6D5, направленными против карбокси-конца Aβ1-40 и Aβ1-42, соответственно. Последние три антитела были предоставлены Schering AG, Берлин, Германия.
Для отделения пептидов Aβ и последующего обнаружения 10 мкл неконцентрированного CSF кипятили в буфере для образца для SDS-PAGE, и Aβ-SDS-PAGE / иммуноблот проводили, как опубликовано в другом месте (Wiltfang et al., 1997, 2002).
Образцы проводили как три раза, и каждый гель имел четырехступенчатую серию разбавления синтетических Aβ-пептидов Aβ1-37, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40 и Aβ1-42. Синтетические пептиды Aβ1-38, Aβ1-40 и Aβ1-42 были получены из Bachem (Bubendorf, Switzerland); Aβ1-37 и Aβ1-39 были синтезированы автоматически согласно Janek et al. (Janek et al., 2001). Стандартные препараты синтетической смеси Aβ-пептидов были созданы, как описано ранее (Bibl et al., 2004), и полосы были количественно определены из отдельных блотов каждого пациента по сравнению с этой серией разбавления с использованием камеры с зарядовой связью (CCD-камера) ONE (BIORAD).
Коэффициенты вариации и чувствительности обнаружения Aβ-SDS-PAGE / иммуноблота A / SDS были опубликованы в другом месте (Wiltfang et al., 2002; Bibl et al., 2004).
Для изоэлектрической фокусировки (IEF) на иммобилизованных градиентах рН (IPG), а затем Aβ-SDS-PAGE / иммуноблот (Aβ-IPG-2D-PAGE), 25 мкл иммунопреципитированного CSF уравновешивали в буфере для образцов IPG и Aβ-IPG-2D -PAGE выполняли, как было опубликовано ранее (Wiltfang et al., 2002).
Bicine / bistris / tris / сульфат SDS-PAGE (без мочевины) на 12% T (акриламид) / 5% C (N, N’метиленбисакриламид) гели (Wiltfang et al., 1991) использовали для первого измерения для достижения разделение, которое зависит исключительно от эффективных молекулярных радиусов пептидов. В этом сепарационном геле мономерные Аβ-пептиды мигрируют в одной полосе вблизи подвижной границы, тогда как олигомерные формы могут быть разделены в результате их более высоких молекулярных радиусов. Пять микролитров иммунопреципитированного CSF применяли на дорожку. После электрофореза при постоянном токе 12 мА / гель всю полосу вырезали и размещали горизонтально на разделительном геле толщиной 0,75 мм того же состава, но содержащем 8 М мочевины. Гель проводили при постоянном токе 18 мА / г для разделения различных видов пептидов Aβ на основе индуцированных мочевиной пептид-специфических сдвигов при связывании SDS.
Экстракционные картриджи HLB (Waters, № 186000115) активировали 50% -ным объемным метанолом и затем промывали 8 мл 5% метанола перед загрузкой образца. Десять микролитров Aβ-пептида (0,1 мг / мл) в буфере для образцов SDS-PAGE смешивали с 490 мкл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) и загружали в один картридж. Пептид Aβ элюировали 83% ацетонитрилом / 0,08% трифторуксусной кислотой (TFA). Четыре фракции по 1,5 мл каждый собирали в пробирках из полипропилена. Из каждой фракции 50 мкл высушивали в вакууме и повторно растворяли в связывающем буфере для дальнейшего IP-соединения в соответствии с протоколом изготовителя (Bruker Immunocapturing Kit № 233794) и последующим анализом масс-спектроскопии с использованием лазерной десорбции — время пролета modus (MALDI-TOF). Образцы для Aβ-SDS-PAGE растворяли в SDS-PAGE-буфере согласно Wiltfang et al. (1997, 2002).
Для локализации Aβ 1-40 и Aβ 1-40 * в неокрашенных гелях контактные пятна получали сразу после электрофореза, помещая предварительно смоченные PVDF-блоттинговые мембраны на каждый гель в течение 5 мин при комнатной температуре. После кратковременного полоскания в двойной дистиллированной воде (H2Odd) пептиды и белки визуализировались на мембране PVDF путем коллоидного окрашивания серебром [2% (масса / объем) динатрия тринатрия цитрата, гексагидрата сульфата аммония (II), 0,8%, нитрата 0,2% серебро] согласно van Oostveen et al. (1997). Окрашенные мембраны служили шаблонами для вырезания Aβ 1-40 и Aβ 1-40 * из геля.
Предварительно аналитическую концентрацию CSF по IP с помощью аминоконцевого селективного мышиного моноклонального антитела 1E8, нековалентно связанного с M280-Dynal-Beads, выполняли, как описано ранее (Wiltfang et al., 2002). Вкратце, вырезанные образцы геля инкубировали в течение ночи при 4 ° С в 40 мкл 5-кратного концентрированного RIPA-детергентного буфера (RIPA5 ×: 2,5% Nonidet P-40, 1,25% дезоксихолата натрия, 0,25% SDS, 750 мМ NaCl, 250 мМ HEPES, одна таблетка коктейля для ингибитора протеазы Complete Mini на 2 мл RIPA5 ×, pH до 7,4 с NaOH) и 160 мкл H2Odd в дополнение к 20 мкл 1E8-M280-Dynal-Beads. Магнитные гранулы затем захватывали на магнитной подставке и дважды промывали PBS / 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и один раз с 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4). Наконец, связанные белки элюировали в 10 мкл буфера для элюирования (Bruker Immunocapturing Kit № 233794) при постоянном перемешивании при 37 ° C в течение 1 часа и еще 2 минуты в ультразвуковой ванне.
Тонкий слой насыщенной α-циано-гидроксикоричной кислоты в ацетоне, содержащем 3% Н2О и 10 мМ NH4H2PO4, готовили на мишени из стальной стали. Аликвоту 0,5 мкл образца непосредственно определяли на матрице и сушили. Затем препарат промывали дважды, добавляя 5 мкл 10 мМ NH4H2PO4 / 0,1% TFA и удаляя его через 10 секунд, сушили и анализировали с использованием масс-спектрометра Autoflex II TOF / TOF (Bruker Daltonics, Германия) в режиме положительного рефлектора. Триста отдельных снимков были объединены для каждого спектра. Спектры были откалиброваны с использованием ClinProt Standard (Bruker Daltonics, Германия).
Уровни пептидов Aβ были отсканированы и рассчитаны как абсолютные значения (нг / мл), а также проценты от общей концентрации Aβ-пептида всех обнаруженных пептидов Aβ. Данные по уровням пептидов были получены из отдельных блотов каждого пациента. Для сравнения групп пациентов были рассчитаны средние концентрации и стандартное отклонение (SD).
U-тест Манна-Уитни применялся для оценки значимости различий между группами.
Двусторонний уровень значимости определялся как P 0,05).
Средний и 95% доверительный интервал (CI) абсолютных уровней Aβ1-37 и Aβ1-42 для каждой диагностической группы. На рисунке показаны только существенные различия.
Путем введения отношения Aβ1-42 к Aβ1-37, группа NDC могла быть дифференцирована на очень значительном уровне от болезни Альцгеймера (P = 5,2 × 10-7), DLB (P = 2,0 × 10-4) и PDD ( P = 1,2 × 10-3). Болезнь Альцгеймера значительно отличалась от группы DLB (P = 3,2 × 10-3) и группы PDD (P = 1,1 × 10-4) соответственно (фиг.4). Используя значение отсечки 0,848, болезнь Альцгеймера можно отличить от НДЦ с чувствительностью и специфичностью 87%.
Средний и 95% доверительный интервал (CI) отношения Aβ1-42: Aβ1-37 для каждой диагностической группы. На рисунке показаны только существенные различия.
Группа DLB может быть дифференцирована от группы PDD на процентное увеличение Aβ1-40 * по отношению к сумме всех Aβ-пептидов (Aβ1-40 *%) в группе DLB на очень значительном уровне (P = 6,0 × 10- 4) (фиг.5). Aβ1-40 * также был повышен в группе болезни Альцгеймера, но не достиг уровня значимости.
Средний и 95% доверительный интервал (CI) относительной численности Aβ1-40 * (Aβ 1-40 *%) для PDD и DLB. Разница между PDD и DLB была очень значительной (P = 6,0 × 10-4).
Абсолютное и относительное содержание Aβ-пептидов каждой диагностической группы суммированы в таблице 1. Отсекающие точки, чувствительность и специфичность наилучшего распознающего Aβ-пептидного отношения (то есть Aβ1-42 / 37 или Aβ1-40 *%, соответственно) для каждого дифференциального диагностического тестирования приведены в таблице 2.
Абсолютное и относительное содержание пептидных структур Aβ в CSF диагностических групп (среднее ± стандартное отклонение).
Общая концентрация Aβ-пептида; ‡ процентное содержание пептидов Aβ относительно общей концентрации Aβ-пептида; Степень абсолютных уровней Aβ 1-42 до Aβ 1-37. AD = болезнь Альцгеймера
Отсечные точки, чувствительность и специфичность наилучшего распознающего Aβ-пептидного отношения (то есть Aβ1-42 / 37 или Aβ1-40 *% соответственно) для каждого дифференциального диагностического тестирования
Ранее неописанный пептид с Aβ-подобной иммунореактивностью (Aβ1-40 *) в сторону высококонсервативной картины пептидов Aβ 1-37, 1-38, 1-39, 1-40 и 1-42 постоянно наблюдался во всех 88 CSF образцы исследованы. Таким образом, Aβ1-40 * проявляет электрофоретические и иммунологические особенности Aβ1-40, но мигрирует в другом положении в Aβ-SDS-PAGE / immunoblot. Аналогичная полоса происходит от синтетического Aβ1-40 во время SPE в гидрофобных условиях (синтетическая Aβ1-40 *) и проявляет массу, соответствующую ожидаемой массе Aβ1-40ox.
Процентное содержание Aβ1-40 * по сравнению с суммой всех исследованных пептидов Aβ (Aβ1-40 *%) заметно увеличивалось в DLB и в меньшей степени также при болезни Альцгеймера по сравнению с PDD и NDC соответственно.
Значительно уменьшенные уровни CSF Aβ1-42 по сравнению с NDC были наиболее заметными при болезни Альцгеймера, и их также можно было продемонстрировать для DLB, но не для PDD. Напротив, Aβ1-37, Aβ1-38 и Aβ1-40 были слегка повышены при болезни Альцгеймера по сравнению с другими группами деменции. Введение соотношений Aβ1-42 в Aβ1-37, 1-38, 1-39 и 1-40, соответственно, улучшило точность диагностического теста для каждого дифференциального диагностического вопроса по сравнению только с уровнями Aβ1-42. Во-первых, это может быть связано с болезненными взаимодействиями каждого непрерывного процесса нейродегенеративной деменции с метаболизмом APP, который не может быть адекватно представлен единственным измерением абсолютных уровней Aβ1-42 (Wiltfang et al., 2001). Во-вторых, процентное содержание каждого вида Aβ-пептида демонстрировало более низкую межличночную дисперсию значений, чем ее абсолютные уровни (Wiltfang et al., 2003). Это соответствует наблюдению, что обилие одиночных видов Aβ-пептидов тесно коррелирует друг с другом и регулируется в узких пределах, тогда как общее количество пептидов Aβ варьируется в зависимости друг от друга (Wiltfang et al., 2002, 2003). Отношение дифференциально измененных Aβ1-42 к уровням Aβ1-37 позволило обеспечить наилучшую точность теста и значительно значительную дифференциацию всех диагностических групп друг от друга, за исключением DLB и PDD. DLB и PDD затем могут быть подвергнуты дискриминации на очень значительном уровне с помощью специально увеличенного Aβ1-40 *% в DLB.
Сообщалось о снижении уровня CSF Aβ1-42 у пациентов с болезнью Альцгеймера (Motter et al., 1995; Andreasen et al., 2001, 2003; Wiltfang et al., 2002, 2003; Mollenhauer et al., 2005) и DLB (Andreasen et al., 2001; Mollenhauer et al., 2005). Снижение уровня Aβ1-42 при болезни Альцгеймера объясняется увеличением клиренса пептида из CSF в старческие амилоидные бляшки в течение длительного времени (Motter et al., 1995). Другие исследования указывают на существование альтернативных механизмов, включая образование SDS-стабильных олигомеров (Podlisny et al., 1995) и шапероновых комплексов пептидов Aβ с конкретными белками-носителями (Wiltfang et al., 2002, 2003; Bibl et al., 2004). Однако расщепление и последующее осаждение белков считается основным патологическим событием как при нейродегенеративных заболеваниях, так и в отношении амилоидной патологии также было сообщено о DLB (Merdes et al., 2003).
Сообщается, что альфа-синуклеин, являющийся основным компонентом тел Леви, облегчает агрегацию пептидов Aβ, и взаимодействия между двумя пептидами по существу включают их соответствующие гидрофобные домены (Yoshimoto et al., 1995). Более того, в последнее время обнаружено, что осаждение амилоидных бляшек в DLB связано с количеством кортикальных тел Льюи (Pletnikova et al., 2005). Взаимодействия гидрофобных шаблонов или доменов с Aβ могут индуцировать конформационный сдвиг пептида в α-спираль in vitro (Giacomelli and Norde, 2005). Подобные взаимодействия Aβ, например, с α-синуклеином (Yoshimoto et al., 1995) в случае DLB, могут приводить к α-спиральным Aβ-пептидным видам in vivo. Сообщается, что переходное образование α-спирали играет важную роль в сборке токсичных олигомеров (Klimov and Thirumalai, 2003) и формировании β-листа, что указывает на то, что он является на пути к агрегации Aβ (Kirkitadze et al., 2001).
Кроме того, α-спиральная структура изменяет электронную среду вокруг серы метионинового остатка 35 (met-35), что делает ее склонной к окислению (Butterfield, 2003) с помощью широкого спектра окислителей, которые в изобилии биологических систем. Патогенная роль окислительного стресса (например, повреждение мембраны и нарушение клеточного гомеостаза кальция) хорошо документирована для болезни Альцгеймера (Butterfield et al., 2003) и DLB (Giasson et al., 2000). С одной стороны, окисление метил-35 до метионинсульфоксида (двухэлектронное окисление) снижает клеточную токсичность и прооксидантный потенциал Aβ (Varadarajan et al., 2001; Butterfield, 2003), а также предотвращает агрегацию фибрилл (Watson et al., 1998; Hou et al., 2002; Palmblad et al., 2002). Напротив, ионы металлов, такие как медь, могут реагировать с мет-35 с образованием свободного серурамила на атоме серы (одноэлектронное окисление), что вызывает усиление окислительного стресса посредством окисления ДНК / РНК и белка, перекисного окисления липидов и образование активных форм кислорода, соответственно (Butterfield, 2003). Более того, на металлозависимую агрегацию Aβ не влияет образование сульфоксида метионина (Barnham et al., 2003), а met-35-окисленный Aβ содержит основной компонент общего мозга Aβ в старческих амилоидных бляшках (Atwood et al. , 2002; Dong et al., 2003). В то время как met-35-окисленный Aβ является более гидрофильным, его усиленное высвобождение из нейронной мембраны в синаптическую щель может опосредовать частый контакт с ионами металлов, такими как цинк и медь, высвобожденными при нейронной передаче (Barnham et al., 2003). Это может способствовать агрегации, зависящей от металлов, и вызывать осаждение Aβ как своего рода семя в довольно чувствительном месте нейрона.
Первоначальная избыточная экспрессия α-спирального Aβ может, таким образом, способствовать как образованию фибрилл, так и зависящей от металла агрегации пептида. В совокупности повышенное количество Aβ1-40 * указывает на специфический для болезни механизм амилоидного осаждения в DLB, вызванный конформационным переходом Aβ при гидрофобных взаимодействиях, вероятно, опосредованным α-синуклеином и повышенным посттрансляционным пептидным окислением.
Хотя сообщалось о невропатологических сходствах между DLB и PDD (Iseki, 2004), остается одно существенное различие: тела Лью в PDD преимущественно локализованы в стволе мозга (Jendroska et al., 1996). Менее частое появление кортикальных тел Леви может способствовать более низкой степени отложения кортикального амилоида в PDD по сравнению с DLB (Mastaglia et al., 2003; Pletnikova et al., 2005), что может быть отражено отдельным нейрохимическим фенотипом среди как нейродегенеративные заболевания в СМЖ. Эти данные соответствуют наблюдению, что большинство пациентов с DLB демонстрируют сходные клинические особенности PDD на более ранней стадии заболевания с выраженным синдромом деменции.
Несмотря на некоторое совпадение, особенно в отношении болезни Альцгеймера и DLB, сообщаемые специфические для болезни нейрохимические фенотипы в CSF указывают на существование различных патофизиологических механизмов метаболизма Aβ-пептидов при болезни Альцгеймера, DLB и PDD. Мы предлагаем исследование пептидных структур Aβ в CSF и гомогенатах головного мозга невропатологически определенных групп пациентов для дальнейшего разъяснения этого аспекта.
Аминокислотная последовательность нового пептида и его вторичной структуры в настоящее время оценивается, но остается неясной. Тем не менее четыре различные линии указания указывают на окисленную и α-спиральную форму мономерного Aβ1-40 в качестве вероятного кандидата для Aβ1-40 *:
Во-первых, двумерная комбинация SDS-PAGE без мочевины, за которой следовал Aβ-SDS-PAGE / immunoblot на основе мочевины (немочевина / мочевина-SDS-PAGE), продемонстрировала Aβ1-40 * для миграции в одной полосе с другими мономерными видами Aβ-пептидов при молекулярной массе приблизительно 4 кДа в отсутствие мочевины и последующем электрофоретическом разделении катодно Aβ1-37 в Aβ-SDS-PAGE / immunoblot. То же самое верно для синтетического Aβ1-40 *, полученного из синтетического Aβ1-40 через SPE. Как и другие мономерные Aβ-пептидные виды, пептид, очевидно, может быть отделен только в результате индуцированных мочевиной пептид-специфических сдвигов при связывании SDS во время Aβ-SDS-PAGE (Kawooya et al., 2003). Олигомеризованные Aβ-пептиды могут быть отделены от мономерной полосы в результате их значительно более высокой массы и соответственно более эффективных эффективных молекулярных радиусов в течение не-мочевины SDS-PAGE. В соответствии с текущей литературой синтетический полноразмерный α-синуклеин оказался мигрирующим с молекулярной массой приблизительно 16 кДа в течение не-мочевины SDS-PAGE. Сообщалось, что в гомогенатах головного мозга у пациентов с DLB два дополнительных пептида мигрируют в диапазоне 12 и 6 кДа, соответственно, в 10% трис / трициновых гелях (Culvenor et al., 1999). Эти пептиды могут быть окрашены только антителом, направленным против области NAC (т.е. не-Aβ-компонента амилоида болезни Альцгеймера) α-синуклеина (Culvenor et al., 1999), предполагая, что пептид NAC проявляет молекулярную массу приблизительно 6 кДа как минимум. Эти данные указывают на мономерную форму пептида Aβ, который должен быть визуализирован катодом Aβ1-37 и сделать SDS-стабильные олигомеры Aβ-пептидов или α-синуклеина и NAC, соответственно, вряд ли спровоцировать эту полосу.
Во-вторых, пептид проявляет свойства не модифицированного амино-Aβ-пептидом. Aβ-IPG-2D-PAGE выявила идентичную изоэлектрическую точку для Aβ1-40 * и других пяти Aβ-пептидов. Во время IEF усеченные на конце аминокислоты Aβ-пептиды (Aβ2-X, Aβ3-X) демонстрируют сдвиг в их изоэлектрической точке одной единицы рН (5,37-6,37) (Wiltfang et al., 2002), тогда как удлинение с аминоконцом Aβ-пептиды (Aβ-12-X), которые образуются после расщепления APP δ-секретазой, перешли бы в более кислую изоэлектрическую точку из-за дополнительной отрицательно заряженной аминокислоты. Напротив, Ct-усечение вплоть до Aβ1-28 или Ct-удлинение до Aβ1-49 не будет влиять на изоэлектрическую точку. Кроме того, была проведена совместная миграция Aβ1-40 * с различными модифицированными карбокси-концевыми синтетическими Aβ-пептидами, которые, как сообщается, происходят in vivo, были исключены в Aβ-SDS-PAGE / иммуноблоттинг на основе мочевины.
В-третьих, амино- и карбокси-конец Aβ1-40 * иммунологически реагируют как Aβ1-40. Aβ1-40 * иммунопреципитирует аминоконтинуальными антителами против Aβ-пептидов (1E8 и 6E10) и с карбокси-терминально-специфическим антителом против Aβ1-40 (13E9), но не с одним против Aβ1-42 (6D5). В противном случае мы исключили кросс-реакции детектирующего антитела 1E8 с синтетическим α-синуклеином во время процедур иммуноблота. Поскольку NAC-пептид считается продуктом расщепления α-синуклеина, кросс-реакция с NAC также маловероятна. В литературе также нет никаких доказательств того, что mAb 1E8 перекрестно реагирует либо с α-синуклеином, либо с пептидом NAC (Culvenor et al., 1999).
В-четвертых, после SPE синтетического Aβ1-40 (синтетический Aβ1-40 *) в гидрофобных условиях была обнаружена полоса с электрофоретическими и иммунологическими особенностями, подобная Aβ1-40 *, которая встречается in vivo. Анализ MALDI-TOF соответствующих фракций выявил два массовых пика, соответствующих ожидаемой молекулярной массе Aβ1-40 и окисленным Aβ1-40 (Aβ1-40ox), соответственно. Анализ MALDI-TOF каждой соответствующей полосы, выбранный из Aβ-SDS-PAGE и обогащенный IP, показал, что синтетическая полоса Aβ1-40 * содержит исключительно массовый пик, соответствующий ожидаемой массе Aβ1-40ox. Синтетическая полоса Aβ1-40 проявляет преимущественно массовый пик, соответствующий ожидаемой массе неокисленного Aβ1-40, хотя незначительные количества Aβ1-40ox могут быть непоследовательно также обнаружены здесь. Соответственно, окисление Aβ1-40, вероятно, способствует его измененному миграционному поведению в Aβ-SDS-PAGE. Кроме того, вышеприведенные данные сильно свидетельствуют о том, что гидрофобные взаимодействия и, вероятно, последующее образование устойчивой α-спирали Aβ1-40 (Giacomelli et al., 2003, 2005), полностью участвуют в генерации Aβ1-40 *. Две α-спирали, охватывающие позиции 16-24 и 28-36 соответственно, были обнаружены в пределах Aβ1-40 (Coles M et al., 1998), первая из которых, как сообщается, является диссонирующей и, без достаточной стабилизации, особенно подвержена к образованию β-многожильных структур (Kallberg et al., 2001; Päiviö et al., 2003). Вторая α-спираль вокруг положения 28-36 дестабилизируется и полностью отменяется в случае окисления met-35, тогда как первая α-спираль остается незатронутой (Watson et al., 1998). Окисление и вторичный структурный переход Aβ1-40 могут изменять пептидспецифическое связывание SDS и, таким образом, объяснять его измененное миграционное поведение во время электрофореза на основе мочевины (Kawooya et al., 2003).
В настоящее время мы применяем круговую дихроизмную спектроскопию для подтверждения нашей гипотезы.
Данные наглядно демонстрируют, что образцы пептида CSF Aβ варьируются в зависимости от заболевания между болезнью Альцгеймера, DLB, PDD и нейропсихиатрическими заболеваниями. Тем не менее, недостаточно доказательств того, что Aβ-пептидные структуры являются единственным биомаркером для дифференциального диагноза среди трех исследованных деменций. В соответствии с критериями рекомендаций международной консенсусной группы (Wiltfang et al., 2005), образцы Aβ-пептида наиболее близки, но не соответствуют требованиям (например, чувствительность и специфичность выше 85%). Тем не менее, используя значение отсечки 0,848 для отношения Aβ1-42 / Aβ1-37, можно было бы получить разумную точность при распознавании болезни Альцгеймера от НДЦ (то есть 87% чувствительности и специфичности). Ранее сообщаемая чувствительность к обнаружению болезни Альцгеймера и специфичности для исключения DLB, соответственно, не превышала 75% в комбинированном анализе иммуноферментного анализа tau и Aβ 1-42 (ELISA) (Andreasen et al., 2001). Таким образом, фактическое дифференциальное диагностическое значение Aβ-пептидных структур можно считать столь же важным, как и установленные ELISA для tau и Aβ1-42. Более того, поскольку многопараметрические подходы приобретают все большее значение в ранней и дифференциальной диагностике деменций (Lewczuk et al., 2004; Wiltfang et al., 2005), оценка пептидных структур Aβ может помочь диагностировать нейрохимический диагноз деменции в сочетании с другими биомаркерами ( например, тау и фосфотау) (Wiltfang et al., 2005).
Хотя Aβ-SDS-PAGE / immunoblot является высокочувствительным методом (Wiltfang et al., 2002), очень низкая концентрация CSF Aβ1-40 * в некоторых случаях близка к уровню обнаружения. Это можно считать основным недостатком теста, что, скорее всего, способствует увеличению дисперсии значений и, следовательно, к потере точности. В отношении этой проблемы предварительная концентрация пептидов Aβ из CSF с использованием высокодействующего и воспроизводимого N-терминально-специфичного IP (Wiltfang et al., 2002) до Aβ-SDS-PAGE / иммуноблотта обещает улучшенную точность теста. Кроме того, необходимо учитывать, что у исследованных пациентов с ПДД все были представлены две или три основные функции, необходимые для диагностики вероятного DLB (McKeith et al., 1996). Дифференциация между вероятными DLB и PDD, которая не обладает дополнительными основными особенностями DLB (например, флуктуациями или галлюцинациями), могла бы выявить более высокую точность теста.
Следовательно, тест следует переоценить с использованием иммунопреципитированных образцов CSF невропатологически определенных заболеваний Альцгеймера, пациентов с DLB и PDD, чтобы определить, действительно ли Aβ1-40 * будет использоваться в качестве нового нейрохимического маркера деменции.
Дополнительные данные доступны в Brain онлайн.
Щелкните здесь для получения дополнительных данных.
Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.
M.B., P.L., H.E., J.K., M.O. и J.W. поддерживаются грантом гранта BMBF (Федеральное министерство образования и науки Германии), «Компенсационная чистая слабоумия» (01GI0102); J.W. и P.L. поддерживаются фондами ELAN-программ Университета Эрланген-Нюрнберг; М.Б. поддерживается Исследовательской программой медицинского факультета, Георг-Август-Университет Геттинген; и M.O. и J.W. поддерживаются исследовательским центром CMPB / DFG. P.L. и J.W. поддерживаются финансируемым BMBF грантом NGFN2 (проект № PPO-S10T10).
Авторы выражают благодарность Сабине Пол, Биргит Отте, Хайке Заху и Николаусу Кунцу за отличную техническую помощь.
источник
Рынок пептидных разработок переживает сейчас небывалый бум, и врачи прогнозируют наступление «пептидной эры». Сегодня на мировом рынке представлено 60 пептидных препаратов, и почти 20% этих лекарств разработано и запатентовано в нашей стране. Одним из создателей этих препаратов является компания «Фарма Био», резидент Сколково.
Пептиды — это универсальные биорегуляторы, которые контролируют большинство биохимических процессов в организме. Преимущество пептидов перед другими типами медпрепаратов состоит в том, что они безопасны, быстро выводятся из организма, не накапливаясь, и имеют значительно меньше побочных эффектов, чем непептидные лекарства.
Клинические исследования по западным стандартам доказательной медицины — это не только испытание препарата на качество, но и компании — на финансовую устойчивость. Позволить себе это могут лишь те, кто уверен, что их препарат обладает огромным коммерческим потенциалом, и не просто уверен, а еще и сможет убедить в этом инвесторов. Заявку на международное качество научный коллектив «Фарма Био» сделал еще в 1990-е, когда глава компании известный ученый, доктор биологических и кандидат химических наук Владислав Дейгин вместе с соавторами продал международной фармкомпании свою разработку — иммуномодулятор тимоген. Сейчас еще одно детище профессора Дейгина, тимодепрессин, о совместной реализации которого на рынке СНГ у «Фарма Био» заключен договор с немецкой компанией Berlin Chemie/Menarini, проходит вторую стадию клинических испытаний в Соединенных Штатах. Компания, основанная в 2010 году при активном участии Института биоорганической химии РАН, сегодня имеет в своем продуктовом портфеле пять принципиально новых лекарственных препаратов пептидной природы.
Специалисты «Фарма Био» придумали новый подход к лечению таких тяжелых заболеваний, как, например, болезнь Альцгеймера. Компания разрабатывает пептидную вакцину, защищающую нейроны от отложений бета-амилоида. Именно эти отложения, согласно общепринятой в научном сообществе гипотезе, и являются причиной возникновения болезни Альцгеймера. Также препараты «Фарма Био» помогают от алкогольной зависимости и некоторых расстройств нервной системы.
Инновационных российских пептидных препаратов на отечественном рынке немного, в основном у нас производят западные дженерики. В России помимо «Фарма Био» разработками в области пептидных лекарств занимается еще шесть компаний. Но несмотря на это, ведущие врачи, работающие с пептидными соединениями, отмечают, что для клинических испытаний препаратов необходима хорошая экспериментальная база, коей не все производители могут похвастаться. «В медицине важно не только разрабатывать новые лекарства, но и выводить их на рынок, а такую компетенцию в нашей стране, к сожалению, могут продемонстрировать очень немногие. Чтобы преуспеть в этом, «Фарма Био» осуществляла патентную работу, налаживала международное сотрудничество с Канадой и США, рассказывают в биомедицинском кластере Сколково. И одним из важнейших преимуществ продуктов «Фарма Био», конечно, является приемлемая рыночная цена. Аналогичные лекарства в мире стоят от $1 тыс. и более за одну ампулу. К примеру, тимодепрессин, эффективный при лечении целого ряда аутоиммунных заболеваний (псориаз, ревматоидный артрит и др.), стоит 3 тыс. рублей, в то время как его западный аналог ремикейд обходится больным в десять раз дороже.
Препараты «Фарма Био» уже давно применяют многие клиники. По свидетельству профессора Николая Короткого, ведущего дерматовенеролога Российской детской клинической больницы, препарат тимодепрессин уже помог тысячам пациентов. «Тимодепрессин подходит для лечения многих патологий,— объясняет доктор.— Для меня же его ценность состоит еще и в том, что он применяется в детской практике». Юлия Виноградова, профессор Гематологического научного центра Минздрава России, которая за 20 лет своей практики работала со многими препаратами, очень высоко оценивает препараты «Фарма Био». По ее словам, главная проблема их аналогов — большое количество побочных действий и токсичность, которая практически полностью отсутствует у лекарств «Фарма Био». «В моей практике были пациенты, организм которых отвечал только на пятикратную дозу. И благодаря отсутствию токсичности препаратов дозу можно было увеличить даже в 50 раз и получать положительный эффект уже на совершенно другом уровне. Препятствием для лечения могло стать лишь то, что эти медикаменты не вошли в список бесплатных лекарств для наших больных»,— рассказывает профессор Виноградова.
«Я уверена, что многие отечественные препараты могут пройти суровую проверку за границей и получить восхитительные отзывы лучших врачей на Западе, но у нас в стране никто в них не поверит и не будет активно продвигать, пока эти препараты не придут к нам с Запада в виде совместных разработок под западными названиями. Издержки менталитета!» — говорит Юлия Виноградова.
Тем временем мировой рынок пептидов продолжает стабильно расти. Так, если в 2008 году, на фоне кризиса, объем продаж пептидных лекарств составлял $15,5 млрд, то в 2012-м он увеличился на 30% и составил $22,8 млрд. Сегодня около 300 пептидных препаратов, что в пять раз превышает число уже зарегистрированных, находится на различных стадиях исследований. И, по мнению экспертов, их количество будет неуклонно расти. Помимо Сколково над ними работают в Институте белка РАН в Пущино, в Екатеринбурге, Новосибирске, Санкт-Петербурге, Черноголовке. Тем не менее для разработки и вывода на рынок принципиально новых препаратов мирового уровня с хорошей патентной защитой необходимы инвестиции в сотни миллионов долларов и 10-12 лет исследований.
Поэтому, несмотря на постоянный рост интереса к пептидным разработкам в мире, перспективы других научных и фармацевтических компаний в России, стремящихся обосноваться в достаточно свободной нише рынка, сильно зависят от притока инвестиций. Специалисты, конечно, надеются, что это произойдет, но, возможно, не в ближайшем будущем.
(оценок: 1, среднее: 5,00 из 5)
Загрузка.
источник
Изобретение относится к биохимии и медицине и представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью (в однобуквенных кодах) HD[pS]GYEVHH, где специальным кодом [pS] обозначен фосфорилированный аминокислотный остаток серина. Данный пептид способен образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида. Автором настоящего изобретения показано, что указанный пептид может эффективно применяться для лечения болезни Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера — это нейродегенеративное заболевание, одна из распространенных форм деменции, «старческого слабоумия». Чаще всего болезнь Альцгеймера развивается после 50 лет, хотя есть и случаи диагностики в более ранних возрастных периодах. (Cummings, J.L. (2004). 
disease. N Engl J Med 351, 56-67.)
Названная по имени немецкого психиатра Алоиса Альцгеймера болезнь на данный момент диагностирована у порядка 46 миллионов человек в мире.
У некоторых пациентов заболевание может быть связано с наследственными нарушениями, но у большинства пациентов заболевание встречается спорадически, без какой-либо определенной причины (Selkoe, D.J. (2001). disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 81, 741-66).
Симптомы болезни Альцгеймера проявляются медленно, и первым симптомом может быть лишь слабая забывчивость. На этой стадии индивидуумы могут забывать последние события, действия, имена знакомых людей или названия вещей и могут быть не в состоянии решить простые математические задачи. При прогрессировании болезни симптомы становятся более заметными и более серьезными. Это вынуждают людей, пораженных болезнью Альцгеймера, прибегать к медицинской помощи. Симптомы, характерные для средней стадии болезни Альцгеймера, включают забывание того, как выполнять простые функции, такие как приводить себя в порядок, при этом возникают проблемы с речью, пониманием, чтением или письмом. Пациенты на поздней стадии болезни Альцгеймера могут становиться боязливыми или агрессивными, могут уходить далеко от дома и, в конце концов, нуждаться в полном уходе.
Гистологически это заболевание характеризуется нейритными бляшками, главным образом ассоциированными с корой головного мозга, лимбической системой и базальными ганглиями. Основным компонентом указанных бляшек является пептид амилоид-бета (Аβ), который является продуктом расщепления белка-предшественника амилоида-бета (βАРР или АРР). АРР является трансмембранным гликопротеидом типа I, который содержит крупный эктопический N-концевой домен, трансмембранный домен и небольшой цитоплазматический C-концевой хвост. Альтернативный сплайсинг транскрипта одного гена АРР в хромосоме 21 приводит к нескольким изоформам, которые отличаются количеством аминокислот.
Аβ пептид представляет собой соединение, которое обычно обнаруживается в биологических жидкостях, таких как кровь или цереброспинальная жидкость, в которых он присутствует в низких концентрациях от 0,5 до 5 нМ, и это одинаково как у здоровых людей, так и у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (Mayeux, R. et al. (1999). Plasma amylo /> beta-peptide from biological fluids. Nature 359, 325-7)
На настоящий момент, по всем имеющимся данным, можно сделать вывод, что 1-16 N-концевая область пептида Аβ является областью, которая несомненно участвует в наиболее убедительном и определяющем пути феномена формирования амилоидных бляшек.
Было определено, что 1-16 N-концевая область бета-амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Cu) присоединяются к Аβ пептиду (Guilloreau, L., Damian, L., Coppel, Y., Mazarguil, H., Winterhalter, M. and Faller, P. (2006). Structural and thermo dynamical properties of Cull amylo /> disease senile plaques. J Neurol Sci 158, 47-52). Некоторое количество исследований и экспериментов, как in vivo так и in vitro, показали, что высокие концентрации цинка вызывают преципитацию Аβ пептида, приводящую к образованию амилоидных бляшек. Кроме того, было показано, что амилоидные бляшки более значимо образуются в окружении нейронов в присутствии высокой концентрации ионов цинка (Frederickson, С.J. and Bush, A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals 14, 353-66; Frederickson, C.J., Suh, S.W., Silva, D. and Thompson, R.B. (2000). Importance of zinc in the central nervous system: the zinc-containing neuron. J Nutr 130, 1471S-83S).
Именно поэтому в настоящее время считается, что блокирование взаимодействия Аβ пептида с цинком должно привести к уменьшению агрегации Аβ пептида в виде амилоидных бляшек и тем самым предотвратить патологии, связанные с этим взаимодействием.
В патенте US 6001852 в качестве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера предлагается Клиохинол, который является цинк-хелатирующим агентом.
В патенте US 7018797 представлен метод ингибирования связывания β-амилоидных пептидов с α-7 никотиновым рецептором ацетилхолина для лечения нейродегенеративных заболеваний. В US 7018797, соединения, полученные из нафталина, в частности, 5,8-дигидрокси-транс-2-ди (N-пропиламино)-3-метил-1,2,3,4-тетрагидронафталин, были предложены в качестве соединений, которые могут подавлять связывание Аβ пептида с α-7 никотиновым рецептором ацетилхолина.
В US 7314724 в качестве лекарства против болезни Альцгеймера было предложено использование растворимых форм ламининов и их фрагментов (>10 кДа), которые способны связываться с Аβ и держать его в мономерном состоянии.
Из документа WO 2010/115843, 14.10.2010 известна антигенная конструкция, содержащая антигенный пептид, соответствующий последовательности в пределах тау-белка, включающий фосфо-эпитоп, где пептидом является (а), модифицированный путем связывания с липофильным или гидрофобным фрагментом, который облегчает встраивание в липидный бислой липосомы, и (б), реконструированный в липосому так, что пептид презентирован на поверхности липосомы, для индукции иммунного ответа у животного, страдающего от нейродегенеративного расстройства. Указанная антигенная конструкция используется для лечения болезни Альцгеймера.
Из документа ЕА 12325, 28.08.2009 В1 известно использование 3-амино-1-пропансульфоновой кислоты в способе лечения болезни Альцгеймера.
Из документа WO 2013/041962 28.03.2013 известно получение антитела для использования при лечении болезни Альцнеймера.
В документе WO 2009/149485 17.12.2009 описана группа изобретений, которая относится к медицине и касается применения мимотопов для лечения β-амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера, где вышеуказанные мимотопы являются полипептидами, содержащими от 4 до 20 аминокислотных остатков, и способны вызывать in vivo образование антител к неукороченному Аβ1-40/42 и укороченным с N-конца формам АβрЕ3-40/42, Аβ3-40/42, Aβ11-40/42, AβpE11-40/42 и Аβ14-40/42 без нарушения физиологических функций передачи сигнала БПА.
В документе WO 2006/121656 16.11.2006 описан способ для предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Аβ в головном мозге пациента, нуждающегося в такой профилактике или лечении. Способ включает введение эффективной дозы иммуногенного фрагмента Аβ с отсутствием T-клеточного эпитопа, способного вызывать иммунный ответ в форме антител к указанному фрагменту Аβ, где иммуногенный фрагмент содержит один или более линейных пептидов из 8 аминокислот (8-меров) Аβ, при этом указанный один или более 8-меров включают Аβ(21-28) (AEDVGSNK).
Из документа RU 2588143 С2, 27.06.2016 известно изобретение, которое относится к пептидному соединению Ra-R1-R2-R3-R4-Rb (I) или Ra-R4-R3-R2-R1-Rb (II), где Ra представляет собой N-концевую первичную аминную группу аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную аминозащитной группой, Rb представляет собой гидроксильную группу C-концевой карбоксильной группы аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную гидроксизащитной группой, и R1-R2-R3-R4 или R4-R3-R2-R1 представляют собой HADD, KADD, DDAK, RADD, DDAR, KAED, DEAK, RAED, DEAR, HADE, EDAH, KADE, EDAK, RADE, EDAR, HAEE, EEAH, KAEE, EEAK, RAEE и EEAR. Данные пептидные соединения применяются для связывания с β-амилоидными пептидами и ингибирования полимеризации их в виде амилоидных бляшек, а также в качестве лекарственного средства или для подготовки или определения препаратов с целью лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера.
Однако, к сожалению, несмотря на успехи в предотвращении образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным.
Исходя из вышеизложенного, на настоящий момент существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn (II) с β-амилоидным пептидом.
Автором настоящего изобретения был получен пептид, соответствующий по своему аминокислотному составу фрагменту 6-14 человеческого бета-амилоида, но в отличие от него пептид по настоящему изобретению содержит химически модифицировнный аминокислотный остаток, а именно фосфорилированый остаток серина (обозначаемый как «[pS]»). Пептид по настоящему изобретению имеет нонамерную (девяти-членную) аминокислотную последовательность HD[pS]GYEVHH с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи (например, с ацетилированным N-концевым амином и амидированным С-концевым гидроксилом) и обозначается далее как «pS-nAβ».
Данный пептид способен образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида. Автором настоящего изобретения показано, что указанный пептид может эффективно применяться для лечения болезни Альцгеймера. На основе пептида создана также фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера. В качестве активного компонента в ней используется пептид «pS-nAβ» согласно изобретению. Остальные компоненты выбраны из круга нейтральных носителей и разбавителей и хорошо известны специалисту в данной области техники (например, физиологичекский раствор).
Таким образом, авторами настоящего изобретения к рассмотрению предложено следующее.
1. Пептид «pS-nAβ», способный образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида.
2. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая эффективное количество пептида согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
3. Способ снижения цинк-индуцированной агрегации бета-амилоида, включающий взаимодействие пептида согласно изобретению с бета-амилоидом.
4. Способ образования цинк-опосредованных межмолекулярных комплексов пептид-бета-амилоид, включающий в взаимодействие пептида согласно изобретению с бета-амилоидом.
5. Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту эффективного колическтва фармацевтической композиции согласно изобретению.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
ПРИМЕР 1. Экспериментальное свидетельство способности «pS-nAβ» образовывать стабильные цинк-опосредованные межмолекулярные комплексы с металл-связывающим доменом человеческого бета-амилоида.
Образование цинк-связанных комплексов между «pS-nAβ» (аналитом) и иммобилизованным пептидным фрагментом DAEFRHDSGYEVHHQK (лигандом), соответствующим металл-связывающему домену 1-16 бета-амилоида человека, Аβ(1-16), было исследовано с помощью биосенсора на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США) в водных буферных системах при физиологических значениях рН. По результатам таких экспериментов рассчитывается значение константы диссоциации (Кд) взаимодействия субстанции и иммобилизованного лиганда. Если значение Кд равно или меньше 10 -4 М, то такое взаимодействие рассматривается в качестве биологически значимого.
Перед каждым экспериментом лиофилизированные синтетические пептиды (чистота более 98%), которые использовались в качестве аналита или лиганда, растворяли в подходящей буферной системе. Концентрация каждого пептида в растворе определялась спектрофотометрически с использованием коэффициента экстинкции 1450 М -1 cm -1 при 276 нм (пик поглощения аминокислотного остатка Tyr 10 в человеческом Аβ).
Сенсорный чип СМ5 с гидрофильной карбоксиметилированной декстрановой матрицей, подходящий буфер HBS (10 мМ HEPES, рН 7.4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0.005% ПВА Р20), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-25 carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), 2-(2-pyridinyldithio)-ethaneamine (PDEA), и цистеин, используемые в анализах, были закуплены у компании-производителя (BIAcore, GE, USA). Иммобилизация лиганда проводилась в соотвтествие с протоколами компании-производителя и с использованием соотвтествующих рабочих растворов.
БППР эксперименты были проведен на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США). Синтетический пептид Ас-DAEFRHDSGYEVHHQKGGGGC-NH2 («Aβ(1-16)-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys») был использован в качестве лиганда, который иммобилизировали через дисульфидную связь тиоловой группы C-концевого остатка цистеина. В качестве аналитов использовали синтетический пептид Ac-HD[pS]GYEVHH-NH2 («pS-nAβ»). Концентрации образцов растворов каждого аналита были 0, 2, 5, 10, 15 и 20 микромолей). На рисунке 1 представлены полученные наборы кинетических кривых связывания (сенсограммы БППР) аналита «pS-nAβ» с иммобилизованным Aβ(1-16)-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys) после вычитания контрольного фона. Измерения проводились при 25°С в 10 мМ HEPES буфере (рН 6,8), содержащем различные концентрации аналита (0, 2, 5, 10, 15 и 20 микромолей, кривые 1-6, соответственно) в присутствии 100 мкМ Zn 2+ .
На основании полученых данных было найдено, что константа диссоциации цинк-опосредованных взаимодействий между «pS-nAβ» и иммобилизованным Aβ(1-16)-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys составляет (3.2±0.5)×10 -7 М.
Таким образом, показано образование стабильных межмолекулярных комплексов между металл-связывающим доменом бета-амилоида и тестируемым пептидом в присутствии ионов цинка. При этом в отсутствии ионов цинка никаких взаимодействий зафиксированно не было. Следовательно, пептид согласно изобретению представляет собой средство, способное образовать стабильный межмолекулярный комплекс с металл-связывающим доменом человеческого бета-амилоида.
ПРИМЕР 2. Анализ влияния «pS-nAβ» на образование цинк-индуцированных агрегатов человеческого бета-амилоида (Аβ42) методом корреляционной спектроскопии (динамического лазерного светорассеяния).
Размер цинк-индуцированных агрегатов пептидов Аβ42 определяли методом корреляционной спектроскопии, используя анализатор размера частиц Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания), позволяющий измерять диаметр частиц в диапазоне от 0.6 нм до 10 мкм. Измерения проводили при температуре 25°С в соответствии с инструкцией производителя. Метод корреляционной спектроскопии основан на определении коэффициента диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа корреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света. Размер частиц определяется по формуле Стокса-Эйнштейна, которая связывает коэффициент диффузии с гидродинамическим радиусом частицы. При этом предполагается, что частица имеет сферическую форму.
Для полидисперсной популяции частиц анализатор Zetasizer Nano ZS дает распределение частиц по размеру, для чего используется программа CONTIN, являющаяся частью его программного обеспечения. Программа использует математический алгоритм, позволяющий из всех возможных распределений частиц по размеру выбрать то, которое наилучшим образом описывает экспериментально определяемую корреляционную функцию. Программа также определяет средний размер частиц в полидисперсной популяции, который использовался в данной работе для сравнительное анализа.
Пробы для определения размера агрегатов пептидов методом корреляционной спектроскопии готовились следующим образом. 100 мкл раствора пептида Аβ42 с концентрацией 30 мкМ в буфере А (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4) смешивали с 20 мкл раствора хлорида цинка концентрацией 150 мМ в буфере А в одноразовой микрокювете BRAND UV (BRAND GMBH, Германия) и немедленно использовали для определения размера агрегатов. Для определения влияния пептида pS-nAβ на цинк-индуцированную агрегацию Аβ42 к 100 мкл раствора Аβ42 предварительно добавляли 1 мкл раствора пептида pS-nAβ в буфере А с концентрацией, позволяющей получать желаемое молярное соотношение данных пептидов и Аβ42 в интервале от 1 до 10, инкубировали смесь 10 мин при комнатной температуре, после чего вносили цинк как описано выше. Конечная концентрация Аβ42 в анализируемой пробе составляла 25 мкМ, молярное отношение цинк/Аβ42 было 1:1, а молярное отношение между pS-nAβ и Аβ42 составляло 1:1, 3:1 и 10:1.
Результаты показаны на рис. 2 — влияние «pS-nAβ» на цинк-зависимую агрегацию человеческого бета-амилоида Аβ42.
Из приведенных на рис. 2 данных следует, что добавление pS-nAβ существенно снижает способность Аβ42 подвергаться цинк-индуцированой агрегации. При этом при повышении концентрации субстанции в смесях процесс ингибирования такой агрегации усиливается.
ПРИМЕР 3. Улучшение когнитивных функций мышиной модели («АβРР/PS1») болезни Альцгеймера под действием внутривенного введения «pS-nAβ» экспериментальным животным.
Для оценки влияния субстанции «pS-nAβ» на характеристики памяти и обучения экспериментальных животных была использована стандартная методика оценки пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. Водный лабиринт Морриса является классическим инструментом для оценки пространственной памяти, зависящей от функции гиппокампа. Важно отметить, что именно в гиппокампе у пациентов при болезни Альцгеймера и у трасгенных мышей линии «АβРР/PS1» агрессивно развивается церебральный амилоидоз. Были использованы три группы семимесячных мышей: интактные животные линии «АβРР/PS1» (N «intact»=9 голов), инъектированные препаратом «pS-nAβ» мыши линии «АβРР/PS1» (N «pS-nAβ»=8 голов; препарат вводился внутривенно в дозе 5 мг/кг три раза — в возрасте 4, 5 и 6 месяцев), и контрольные мыши дикого типа (N «wt»=10 голов). Результаты анализа пространственной памяти животных, полученные в этом тесте, продемонстрировали значительную разницу между интактными и инъектированными мышами линии «АβРР/PS1» (рис. 3) — анализ пространственной памяти интактных животных линии «АβРР/PS1» (N «intact»=9 голов, сплошная линия, черные кружочки), инъектированных препаратом «pS-nAβ» мышей линии «АβРР/PS1» (N «pS-nAβ»=8 голов, возраст 7 мес., прерывистая линия, пустые кружочки), и контрольных мышей дикого типа (N «wt»=10 голов., пунктирная линия, пустые треугольнички) в водном лабиринте Морриса. Размер бассейна 180 см, платформа расположена стационарно. На оси ординат указано время, затраченное животными на поиск платформы при последовательных тестированиях в течение 5 дней.
Начиная с 3-го дня обучения время, которое требовалось контрольным животным (дикого типа) и инъектированным препаратом «pS-nAβ» трансгенным мышам для нахождения платформы, достоверно сокращалось. В то же время в группе интактных мышей линии «АβРР/PS1» это время оставалось таким же, как и на 1-й день обучения. Таким образом, было показано, что систематические внутривенные инъекции «pS-nAβ» (в дозах по 5 мг/кг) приводили к улучшению способности животных к обучению и поддержанию долговременной памяти по сравнению с интактной контрольной группой трансгенных мышей, что свидетельствует о существенном когнитивно-стимулирующем эффекте этой субстанции.
источник