Моделирование БА у животных проводится, как правило, на грызунах: мышах, крысах, морских свинках. Наиболее распространенной является методика получения мутантных животных, геном которых несет мутантные гены АРР , пресенилинов 1 и 2 и белка τ. Однако эти мутации не отражают полностью всех случаев болезни Альцгеймера. У мутантных мышей не наблюдается выраженной гибели нейронов. Кроме трансгенных мышей в последнее время появились трансгенные крысы, которые несут признаки болезни Альцгеймера.
Инъекционные модели основываются на введении животным нейротоксинов, вызывающих преимущественную гибель специфических популяций нейронов; также довольно популярны инъекционные модели, в которых используется интрацеребральное введение βA или его фрагментов, а также в некоторых случаях провоспалительных цитокинов, например, фактора некроза опухоли [ФНО-α].
Однако введение βA в мозг животным не приводит к образованию амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков, но тем не менее данные модели позволяют моделировать когнитивные нарушения на ранних этапах БА. В инъекционных моделях используются преимущественно мыши и крысы.
Некоторыми авторами используется модель спорадической формы БА. Нейродегенерация альцгеймеровского типа инициируется удалением обонятельных луковиц (бульбэктомия, БЭ), которые тесно связаны с деятельностью лимбических структур, участвующих в процессах обучения и памяти. Наиболее адекватно этот тип модели осуществляется на морских свинках, у которых аминокислотная последовательность βA аналогична таковой у человека. Однако на этой модели показано, что на начальных стадиях развития патологии наблюдается стимуляция истинного нейрогенеза в мозге БЭ животных, что противоречит данным о снижении нейрогенеза в стареющем мозге человека и животных.
Примером исследования сфинголипидов на мутантных животных, модулирующих болезнь Альцгеймера, может служить работа, в которой определяли содержание церамидов, сфингомиелинов, сульфатидов и галактозилцерамидов в коре мозга APP[SL]PS1Ki мышей, экспрессирующей человеческий APP 751 со шведской и лондонской мутациями в комбинации с пресенилином-1. Было обнаружено значительное накопление церамидов в коре этих животных по сравнению с мышами дикого типа PS1Ki, в то время как другие сфинголипиды, кроме галактозилцерамида, не претерпевали заметных изменений.
Нами впервые было показано, что введение βA или ФНО-α в мозг крыс приводит к активации сфингомиелиназы и накоплению церамида. Этот процесс наиболее выражен в гиппокампе по сравнению с корой и мозжечком.
Хроническое повышение внутриклеточных церамидов может замедлять элонгацию аксонов и интернализацию фактора роста нервов. Церамиды в нервных клетках вовлечены в апоптотические программы. Эти сигнальные молекулы способны стимулировать как протеинкиназную, так и фосфатазную сигнальные системы. βA и церамид расположены в пределах одних и тех же рафтов, которые являются структурными элементами мембраны, и содержат в своем составе необходимые сигнальные системы для индукции апоптоза. В βA-индуцированном апоптозе принимает участие 75-рецептор ФНО-α и FAS-лиганд, которые представляют собой семейство клеточных рецепторов, использующих сфингомиелин-церамидный путь для проведения сигнала апоптоза.
Более того, βA и церамид вызывают митохондриальную дисфункцию и индуцируют окислительный стресс. He только увеличение церамида в результате гидролиза сфингомиелина происходит в ответ на стрессовые сигналы и апоптоз, но и наблюдается повышение его синтеза в этих условиях. Таким образом, результаты, полученные в модельных экспериментах, позволяют предположить, что церамид играет существенную роль в патогенезе БА, механизм его действия можно представить в виде последовательности событий, при которых βA прежде всего индуцирует окислительный стресс и гидролиз сфингомиелина до церамида, завершающегося апоптотической гибелью нейронов.
Высокое содержание ганглиозидов характерно в ткани мозга и их очень часто используют в качестве биомаркеров биохимических патологий нервной системы. Известно, что ганглиозиды участвуют в начальной стадии агрегации βА. Довольно подробно изучается метаболизм ганглиозидов на различных моделях БА с использованием трансгенных животных. В зависимости от вида модели наблюдается разнообразный ход изменений в содержании различных ганглиозидов в структурах мозга животных, что говорит об очень тонкой настройке механизма амилоидогенеза с участием ганглиозидов.
источник
Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративным заболеванием, приводящим к снижению когнитивных функций, слабоумию и в конечном итоге смерти. Она уже является огромным бременем для нас, и картина становится только хуже по мере старения населения. Журнал ассоциации Альцгеймера “Alzheimer’s and Dementia”, считает, что к 2050 году по всему миру один из 85 человек будет страдать этой болезнью. Несмотря на согласованные усилия ученых, чтобы исследовать природу болезни Альцгеймера, его точные механизмы до сих пор являются предметом дискуссии. Мало того, методы лечения, которые выглядели обнадеживающими в доклинических исследованиях не оправдались в клинических испытаниях на людях. Очевидно, существует острая необходимость улучшить трансляцию научных достижений в область медицины, чтобы найти методы профилактики и лечения болезни Альцгеймера.
Первым шагом в сторону такого необходимого медицинской прогресса является исследование болезни Альцгеймера. Большая часть предыдущих работ была сосредоточена на явные признаки болезни Альцгеймера: накопление “бляшек” бета-амилоида, фрагмента белка в головном мозге, и избытка тау-белка с образованием “клубков”. В то время, как мы знаем, что бета-амилоид и тау-белок присутствуют в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера и, вероятно, способствуют гибели клеток головного мозга, их точные роли и механизмы остаются неясными, особенно на ранних стадиях. Действительно, многие из неудачных пробных терапий были сосредоточены на блокирование бета-амилоидного накопления, так что очевидно, что по-прежнему у нас еще недостает много важных кусочков этой головоломки.
Хорошей новостью является то, что есть новые мощные инструменты и технологии, доступные для исследователей, которые помогут исследовать болезнь с гораздо большей точностью и скоростью, чем это было возможно ранее. Методы поиска новых генов и процессов, вовлеченных в болезнь Альцгеймера, с помощью новых технологий были представлены в недавнем обзоре “Toward more predictive genetic mouse models of Alzheimer’s disease”, опубликованном в Brain Research в декабре 2015 года, автором которого являются д.м.н., ассистент-профессор Майкл Саснер, д.м.н, доцент Гарет Хауэлл и их коллеги из Jackson Laboratory (US). В обзоре обсуждаются как модельные животные, используемые ранее, так и новые технологии, а также обсуждается о том, как оба варианта могут улучшить друг друга.
Как уверяет журнал ScienceDaily стиль написание статьи весьма трудночитаем без достаточного научного словарного запаса. Далее цитируют статью: “Генетические модельные мыши болезни Альцгеймера (БА) широко используются для понимания аспектов природы болезни, вместе с тем, имеют ограниченный успех в трансляции их результатов в клиническую практику. В настоящем обзоре мы рассмотрим преимущества и недостатки существующих генетических моделей и последние достижения в области новых технологий (в том числе высокопропускное секвенирование и редактирование генома), которые позволят создать более предиктивную модель. Мы резюмировали широко используемые биомаркеры и поведенческие тесты мышиных моделей БА, и выделили лучшие приложения, которые максимизируют транслируемость доклинических результатов”.
Авторы обзора уделили внимание новым данным, выходящим за рамки бета-амилоида и тау-белка, при сравнении болезни Альцгеймера с ранним и поздним началом (наиболее распространенным для человека, и наиболее сложномодулируемом на мышах), а также рассмотрели роль воспаления, важность гематоэнцефалический барьера, взаимодействие различных систем и так далее, в контексте расширения и совершенствования исследований.
Болезнь Альцгеймера является сложной и очень трудно точно воспроизводимой на модельных животных болезнью. Предполагается, что высокопроизводительное секвенирование позволит найти генетические вариации в клетках головного мозга больных, а эффективность геномной инженерии позволит отпечатать эти варианты в геноме мышей. По оценке биологических последствий каждого варианта и их влияния на органы и системы можно судить об их вкладе в развитии данной патологии. С новым инструментами ученые теперь смогут собрать все части головоломки болезни Альцгеймера. “Данная задача остается внушительной и весьма проблематичной, но новые технологии в настоящее время позволят лучше понять и, надеюсь, предотвратить и вылечить эту страшную болезнь.” — Марк Ваннер.
Пост подготовлен по материал предоставленным Jackson Laboratory (Mark Wanner), “Alzheimer’s and Dementia” и ScienceDaily.
источник
Болезнь Альцгеймера является наиболее распространенной причиной деменции среди пожилых людей, что составляет
60-70% всех случаев деменции. Невропатологическими признаками болезни Альцгеймера являются старческие бляшки (в основном содержащие β-амилоидный пептид, полученный из белка предшественника амилоида) и нейрофибриллярные клубочки (содержащие гиперфосфорилированный белок Тау) наряду с потерей нейронов. В настоящее время нет эффективного лечения болезни Альцгеймера. Учитывая распространенность и плохой прогноз заболевания, разработка моделей на животных является приоритетом исследований для понимания патогенных механизмов и тестирования терапевтических стратегий. Большинство случаев болезни Альцгеймера происходят спорадически у людей старше 65 лет и не генетически унаследованы. Примерно 5% пациентов с болезнью Альцгеймера имеют семейную болезнь Альцгеймера, то есть связанную с генетической предрасположенностью, включая мутации в белке предшественника амилоида, пресенилин 1 и пресенилин 2 гена. Открытие генов для семейной болезни Альцгеймера позволило получить трансгенные модели посредством сверхэкспрессии белка-предшественника амилоида и / или пресенилинов, несущих одну или несколько мутаций, обнаруженных в семейной болезни Альцгеймера. Хотя ни одна из этих моделей полностью не повторяет человеческое заболевание, они предоставили ценную информацию о механизмах болезни, а также возможности тестирования терапевтических подходов. В этом обзоре описаны основные модели трансгенной мышиной болезни Альцгеймера, которые были приняты в исследовании болезни Альцгеймера, и обсуждается понимание патогенеза болезни Альцгеймера из исследований в таких моделях. Таким образом, мышиные модели болезни Альцгеймера были ключом к пониманию роли растворимых β-амилоидных олигомеров в патогенезе болезни, а также взаимосвязи между β-амилоидной и тау-патологией.
Болезнь Альцгеймера (AD), прогрессирующее нейродегенеративное расстройство, является наиболее распространенной причиной деменции среди пожилых людей. Это составляет
60-70% всех случаев деменции. Распространенность возрастает с возрастом от
1% в 60-64-летней возрастной группе до 24-33% в возрасте старше 85 лет1. Невропатологическими признаками АД являются наличие в мозге внеклеточных старческих бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубок , наряду с потерей нейронов. Сенильные бляшки в основном состоят из фибрилл 39-42 (43) аминокислотного β-амилоидного (Aβ) пептида, которые окружены дистрофическими нейритами и реактивными глиальными клетками. Сам пептид Aβ получен из обработки более крупного белка-предшественника, известного как белок-предшественник амилоида (APP) .2 Дисфункция метаболизма APP и последующее накопление Aβ-пептидов и их агрегация в виде старческих бляшек в паренхиме головного мозга людей с АД, считаются решающими для нейродегенерации в этой болезни. Это так называемая «гипотеза амилоидного каскада» .3,4 Однако в последнее время растворимые олигомеры пептида Aβ коррелируют с синаптической потерей в мозге субъектов АД.5-7. Нейрофибриллярные пучки содержат гиперфосфорилированные и агрегированные формы Tau , связанный с микротрубочками, который обычно способствует сборке и стабильности микротрубочек в нейронных клетках.2 Аномально гиперфосфорилированный тау в головном мозге AD накапливается в нейронах в парные спиральные нити, которые, в свою очередь, объединяются в нейрофибриллярные клубок, приводящие к гибели нейронов.8 Поэтому, невропатологические признаки AD индуцируют прогрессирующую дисфункцию нейронов и дегенерацию, что приводит к тяжелой атрофии головного мозга и снижению памяти и другим когнитивным функциям.2 Хотя это и не является критерием для диагностики AD, отложение Aβ в сосудистой сети мозга, называемое церебральной амилоидной ангиопатией (CAA ), могут быть обнаружены у 90% пациентов с AD.9. Однако CAA может возникать в отсутствие AD-патолога y и наоборот.10
Большинство случаев AD происходят спорадически у людей старше 65 лет и не генетически унаследованы. Примерно у 5% пациентов с AD наблюдается семейная болезнь Альцгеймера (FAD), необычная форма, которая, как правило, наступает раньше, и связана с генетической предрасположенностью, включая мутации в гене APP на хромосоме 21, ген пресенилина 1 (PS1) на хромосоме 14 и пресенилин 2 (PS2) на хромосоме 1.1. Этиология AD неясна и в настоящее время нет эффективного лечения. Учитывая распространенность и плохой прогноз заболевания, разработка моделей на животных является приоритетом исследований для понимания патогенных механизмов и тестирования терапевтических стратегий. Открытие генов для семейных форм AD позволило создать трансгенные модели, которые воспроизводят многие критические аспекты заболевания. Первоначально, до обнаружения FAD-мутаций, предпринимались попытки сверхэкспрессировать APP дикого типа у трансгенных мышей путем пронуклеарной инъекции. Однако ни одна из этих усилий не вызвала ничего, что напоминало бляшку Aβ или любую другую узнаваемую патологию типа AD. После обнаружения FAD-мутаций в APP ряд групп обратил свое внимание на создание моделей AD на основе избыточной экспрессии трансгенов, содержащих FAD-мутации, с использованием различных промоторов.11 В этом обзоре описываются основные модели трансгенных мышей AD, которые были приняты в исследовании AD, и обсуждает понимание патогенеза AD из исследований в трансгенных моделях.
Мутации в APP, связанные с FAD, включают голландский (E693Q), 10 Лондон (V717I), 12 Индиана (V717F), 13 шведских (K670N / M671L), 14 Флорида (I716V), 15 Айова (D694N), 16 и Арктика (E693G) 17 мутаций. На сегодняшний день было обнаружено более 160 мутаций в PS1, связанных с FAD (см. Http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations). Мутации в связанном гене, теперь называемом PS2, вскоре были связаны с FAD.18 Большинство мутаций FAD вызывают аберрантную обработку APP в сторону более длинных, более амилоидогенных видов Aβ1-42.19 Aβ находится частично внутри эктодомена (N- концевую часть) и частично в трансмембранном домене (С-концевой части) APP. По меньшей мере три фермента ответственны за обработку APP и называются α-, β- и γ-секретазами. Путь обработки α-секретазой, называемый неамилоидогенным, расщепляет APP в домене Aβ в C-концевой части последовательности этого пептида, продуцируя растворимый APPα, который обладает нейротрофическим и нейропротективным действием. Путь обработки β- и γ-секретазами, называемый амилоидогенным, расщепляет APP в N- и C-концевых частях Aβ-области, соответственно, продуцируя Aβ-пептид. γ-секретаза расщепляет APP на разных соседних участках с образованием видов Aβ, содержащих 39-43 аминокислоты.20 Пресенины способствуют каталитической активности комплекса γ-секретазы.1 Обработка APP α-, β- и γ-секретазами показанном на рисунке 1.
Шведская мутация, которая находится непосредственно за пределами N-конца домена Aβ APP, способствует расщеплению β-секретазы in vitro21 и связана с повышенным уровнем и осаждением Aβ1-42 в мозге AD.22 Мутации голландцев и Айовы , которые расположены в Aβ-домене APP, ускоряют образование фибрилл Aβ1-40 in vitro.23,24. Голландская мутация связана с цереброваскулярным отложением Aβ, то есть CAA, что приводит к церебральным кровоизлияниям и деменции у пациентов с AD, 10 тогда как мутация Айовы связана с тяжелой ВГА, широко распространенными нейрофибриллярными путаницами и необычайно обширным распределением Aβ1-40 в бляшках в головном мозге AD.16. Арктическая мутация, которая также находится внутри домена Aβ, делает APP менее доступным для α-секретазы расщепление и увеличивает β-секретирующую обработку APP, что благоприятствует внутриклеточной продукции Aβ in vitro. 25,26. Арктическая мутация связана с тяжелой САА при отсутствии кровоизлияния, обильных паренхиматозных отложений Aβ и нейрофибриллярных клубок в мозге AD.27 Локальная мутация, которая находится в трансмембранном домене APP, а также мутации PS1 и PS2, изменяет расщепление γ-секретазы и увеличивает уровень Aβ1-42 и / или Aβ1-42 / Aβ1 -40 in vitro. 28-30 Ломоносовская мутация связана с обширным паренхимным отложением Aβ и обильными старческими бляшками и нейрофибриллярными клубочками, а также умеренным ВГА в головном мозге AD.31,32. Мутация в Индиане, которая также расположена в трансмембранной домен APP, связан с большим количеством нейрофибриллярных клубок и старческих бляшек, а также умеренной ВГА в головном мозге AD.33. Мутация Флориды, которая также находится в трансмембранном домене APP, влияет на расщепление γ-секретазы, вызывающее увеличение Aβ1 -42 и соотношение Aβ1-42 / Aβ1-40 in vitro.15,30
Games et al34 сообщили о первой трансгенной модели AD, названной мышам PDAPP, которые сверхэкспрессируют человеческий APP-трансген, содержащий мутацию Индианы (V717F) под контролем промотора фактора роста β-тромбоцитов. Aβ1-42 составлял 27% Aβ, присутствующих в мозге молодых мышей PDAPP, и этот процент увеличился до 89% у 12-месячных животных. У мышей развились старческие бляшки, которые в основном состояли из Aβ1-42,35 мышей PDAPP, показали возрастное отложение Aβ в кортикальных и лимбических областях, которое начиналось через 8 месяцев и прогрессировало, чтобы покрыть 20-50% нейропила в коре головного мозга, энторинальной коре, и гиппокамп 18-месячных животных. Отложение Aβ ассоциировалось с дистрофическими нейритами и обширным глиозом (реактивные астроциты и активированная микроглия), однако в энторинальной области коры головного мозга, гиппокампальной области CA1 или корешковой коры через 18 месяцев у мышей PDAPP не наблюдалось явной потери нейронов.36 Дистрофические нейриты иммунореактивные для гиперфосфорилированного Tau наблюдались вблизи бляшек Aβ через 14 месяцев, хотя не было выявлено парных спиральных нитей и нейрофибриллярных клубок.37 Мышей PDAPP наблюдали значительную и зависящую от возраста синаптическую потерю, а довольно выраженную атрофию гиппокампа наблюдали уже 3 месяцев у этих мышей.38 Молодые мыши PDAPP продемонстрировали дефицит в пространственном обучении и памяти, которые ухудшались с возрастанием возраста и бременем Aβ.39
Аналогично, Hsiao и соавт. 40 сверхэкспрессируют у мышей человеческий APP-трансген, содержащий шведскую мутацию (K670N / M671L), приводимую в действие промотором белка хонмера хондера. Эти мыши, называемые мышами Tg2576, были наиболее широко изученной AD-трансгенной моделью. У мышей Tg2576 наблюдалось возрастающее увеличение уровней Aβ1-40 и Aβ1-42 и отложение Aβ, что приводило к старческим бляшкам, аналогичным тем, которые были обнаружены в AD. Аβ-бляшки были впервые отчетливо видны через 11-13 месяцев, что в конечном итоге стало широко распространенным в корковых и лимбических структурах.40 Отложения Aβ были связаны с выраженным глиозом и нейритной дистрофией, без явной потери нейронов в поле CA1 гиппокампа или явной потери синапса в зубчатом полотне гиппокампа gyrus.41 Мыши Tg2576 проявляли дефицит синаптической пластичности в поле CA1 гиппокампа и зубчатую извилину, уменьшали плотность дендритного позвоночника в зубчатой извилине и нарушали пространственную память и конкретизировали страх за несколько месяцев до значительного осаждения Aβ, которое обнаруживалось в 18-месячном возрасте .42,43 Снижение плотности позвоночника было обнаружено уже в 4 месяца, а синаптическая дисфункция и нарушение памяти наблюдались через 5 месяцев. Более того, увеличение отношения растворимого Aβ1-42 / Aβ1-40 впервые наблюдалось в эти ранние возраста, т. Е. В возрасте
4-5 месяцев43. Мышей Tg2576 также наблюдали увеличение накопления интранурональной Aβ1-42 со старением, и это накопление было связано с аномальной синаптической морфологией перед патологией бляшек Aβ.44
Впоследствии многие другие трансгенные линии были разработаны с подходами, аналогичными подходам, используемым для разработки мышей PDAPP и Tg2576, обычно опираясь на сильные промоторы для обеспечения сверхэкспрессии APP-трансгенов, содержащих одиночные или множественные мутации FAD. Например, мыши TgCRND8, которые экспрессируют множественные мутации APP человека, то есть мутации Швеции и Индианы, управляемые промотором белка приона, проявили агрессивную невропатологию с началом паренхиматозного отложения Aβ и когнитивного дефицита уже в возрасте 3 месяцев и с плотные бляшки А и нейритная дистрофия, очевидная с 5-месячного возраста. Мыши TgCRND8 проявляли избыток мозга Aβ1-42 над Aβ1-40, а высокоуровневое продуцирование Aβ1-42 было связано с нарушением пространственного обучения в возрасте 6 месяцев. Нейрофибриллярные клубок и нейродегенерация отсутствовали.45 Образование бляшек сопровождалось появлением активированной микроглии и вскоре сопровождалось кластеризацией активированных астроцитов вокруг бляшек в возрасте 3,5 месяцев у мышей TgCRND8.46
Двукратные трансгенные мыши, которые экспрессируют APP человека с помощью шведской мутации, обусловленной промотором фактора роста β-тромбоцитов, в сочетании с мутацией PS1 (M146L) под контролем промотора белка приона, называемого мышами APP / PS1, развивали большое количество фибриллярных Aβ в коре головного мозга и гиппокампе, которые напоминают компактные бляшки Aβ. Эти мыши показали селективное увеличение Aβ1-42 в мозге и снижение производительности в задаче пространственной памяти до того, как было обнаружено значительное осаждение Aβ.47 Фибриллярные отложения Aβ были связаны с дистрофическими нейритами и активированными астроцитами и микроглиями у мышей APP / PS1.48
Мыши APP23, которые экспрессируют APP человека только с помощью шведской мутации, вызванной промотором Thy1, показали нейроновую сверхэкспрессию APP. В возрасте 6 месяцев мышей APP23 показали первые редкие отложения Aβ, которые увеличивались с возрастом по размеру и количеству и занимали значительную площадь неокортекса и гиппокампа у 24-месячных мышей. Бляшки Аβ были окружены глиозом (активированными микроглиями и астроцитами) и дистрофическими нейритами, которые были иммунореактивными для гиперфосфорилированного тау, несмотря на отсутствие нейрофибриллярных клубок.49 Определение связанных с бляшками пептидов Aβ1-42 в головном мозге показало пятикратное увеличение мышей APP23 при 6 месяцы. Кроме того, мыши APP23 показали возрастной спад пространственной памяти в возрасте 3 месяцев, а локомоторную активность и дефицит исследуемого поведения — через 6 месяцев. Дефициты пространственной памяти предшествовали образованию бляшек и увеличению количества пептидов Aβ1-42, связанных с бляшкой, но отрицательно коррелировали с концентрацией растворимого в головном мозге Aβ у 3-месячных мутантов APP23. 50 мышей APP23 часто использовали для исследования патогенеза CAA. Значительное осаждение Aβ в сосудистой сети головного мозга, то есть CAA было описано у старших мышей APP23. CAA у этих мышей ассоциировалась с локальной потерей нейронов, синаптической потерей, активацией микроглии и микрогеморрагом.51, 52
Трансгенные мыши, экспрессирующие APP человека с голландской (E693Q) и Iowa (D694N) мутациями в сочетании с шведской мутацией под контролем промотора Thy1.2, называемые мышами Tg-SwDI, развивались в значительной степени диффузно, Aβ-бляшкоподобные отложения в мозге паренхиму, начинающуюся с 3-месячного возраста с высокой ассоциацией с накоплением Aβ в церебральной микроциркуляции. Пептиды Aβ1-40 в основном являются преобладающими видами, которые накапливаются у этих мышей. 53. Мыши Tg-SwDI были нарушены при выполнении задачи пространственного обучения и памяти в возрасте 3, 9 и 12 месяцев. 54
Мыши APPDutch, экспрессирующие APP человека только с голландской мутацией, регулируемой Thy1-промотором, показали сверхэкспрессию нейронов APP и увеличение отношения Aβ1-40 / Aβ1-42 в головном мозге, что приводило к обширному осаждению Aβ в сосудах с практически отсутствием паренхиматозного осаждения.55 Эти исследователи также разработали трансгенную линию, которая выражает человеческую APP-голландскую мутацию, пересекающуюся с мутантом PS1 (G384A), называемым мышами APPDutch / PS1. Эти мыши, имеющие примерно половину отношения Aβ1-40 / Aβ1-42 мозга мышей APPDutch, разработали паренхиматозные бляшки Aβ с небольшим осаждением сосудов. Напротив, молодые трансгенные мыши, укрывающие человеческий APP с арктической мутацией (E693G) в сочетании с мутациями APP-Swedish и APP-Indiana, направленными промотором фактора роста β-тромбоцитов, называемым hAPP-Arc-мышами, развивали выраженные паренхиматозные отложения Aβ-бляшки с небольшим ВГА, несмотря на уменьшенную долю Aβ1-42 / Aβ1-40,56
Мыши Tg-ArcSwe с мутациями APP-Swedish и APP-Arctic, управляемые промотором Thy1, были разработаны двумя независимыми группами.57, 588. Мыши Tg-ArcSwe проявляли возрастающее возрастание внутрипанельного накопления Aβ и дефицитов в пространственной памяти и контекстуальных страх, начиная с возраста 6 месяцев, до начала формирования бляшки Aβ, а также CAA.57-59. Когнитивные нарушения коррелировали обратно с растворимыми уровнями Aβ у мышей Tg-ArcSwe.59 Недавно модель мыши, экспрессирующая APP человека с только арктической мутацией под контролем промотора Thy1, называемой мышами APPArc, сообщалось Rönnbäck и др. 60 Мышей APPArc показывали возрастную зависимость от паренхиматозного и сосудистого отложения Aβ, начиная с суббукула и распространяясь на таламус, и дефицит в зависимости от гиппокампского пространственного обучения и теста памяти. В отличие от трансгенных моделей с мутациями Швеции и Арктики, 57,58 мышей APPArc не проявляли никакой точечной внутрирангонной иммунореактивности Aβ60.
Модели трансгенных мышей APP были обеспокоены трудностью индуцирования характерной цитоскелетной патологии AD. Например, у мышей PDAPP фосфорилированные тау-сайты накапливаются в дистрофических нейритах у животных в возрасте 14 месяцев и старше, но нет парных спиральных нитей и неврофибриллярных клубочковых поражений.37 Другие модели были сходны по своему отсутствию любой нейрофибриллярной клубочковой патологии, такой как мыши TgCRND845 и APP23.49
Трансгенные мыши, которые проявляют нейрофибриллярные клубочковые поражения и бляшки Aβ, продуцируются путем комбинирования FAD-мутаций с мутантными формами Tau, обнаруженных в отличной форме деменции, известной как лобно-временная деменция и паркинсонизм, связанная с хромосомой 17 (FTDP-17) .61 Lewis et al.62 сначала пересекали мышей Tg2576 с трансгенной линией, известной как JNPL3, которая экспрессирует мутант P301L Tau, связанный с FTDP-17, генерируя трансгенную модель с большими значениями, называемую мышами TAPP. Известно, что однородные трансгенные мыши JNPL3 развивают нейрофибриллярные клубочковые поражения, а мыши TAPP проявляют как нейрофибриллярные клубочки, так и бляшки Aβ. Мышей TAPP в возрасте от 8 месяцев и старше проявляли более нейрофибриллярную патологию в лимбических областях, в первую очередь миндалевидную, чем мыши, совпадающие с возрастом JNPL3.
Позднее Oddo et al.63 генерировали тройную трансгенную модель AD, называемую мышами 3xTg-AD, которые выражали мутации APP-шведского языка (K670N / M671L) и FTDP-17 Tau (P301L) от экзогенных трансгенов, регулируемых промотором Thy1, объединенным с мутацией PS1 (M146V) от эндогенного гена мыши. Наблюдалось прогрессирующее увеличение Aβ-образования в зависимости от возраста в мозге 3xTg-AD и особенно выраженное влияние на уровни Aβ1-42. У мышей 3xTg-AD внутрирангонное накопление Aβ наблюдалось в возрасте от 3 до 4 месяцев в неокортексе и в возрасте 6 месяцев в поле CA1 гиппокампа и миндалины. Внеклеточные отложения Aβ впервые проявились у 6-месячных мышей в лобной коре и были легко очевидны через 12 месяцев в других областях коры и в гиппокампе. Аβ-бляшки предшествовали патологии Тау, которая не проявлялась до 1 года возраста.63,64. Тау был конформационно изменен и гиперфосфорилирован при множественных остатках в головном мозге мышей 3xTg-AD по возрасту. Тау-реактивные дистрофические нейриты были также очевидны в старшем мозге 3xTg-AD. Функционально мышей 3xTg-AD развивали зависящие от возраста синаптические дефекты пластичности, но до патологий бляшек Aβ и нейрофибриллярных клубок; синаптическая дисфункция, коррелированная с накоплением intraneuronal Aβ1-42.63. Кроме того, эти мыши проявляли самые ранние нарушения удержания в пространственной памяти в возрасте 4 месяцев, что коррелировало с накоплением intraneuronal Aβ1-42. В возрасте 6 месяцев мышей 3xTg-AD проявляли дефицит удерживания в пространственной памяти и контекстуальные задачи по обучению страхов.64
Еще одна проблема с AD-трансгенными моделями мышей — общая трудность, вызывающая потерю нейронов. Например, ни мыши PDAPP, ни Tg2576, несмотря на обширное осаждение Aβ, демонстрируют значительную потерю нейронов.36,41 Мыши APP23 показывают только умеренные потери пирамидальных клеток в поле CA1 гиппокампа (около 15%), потери, которые намного меньше, чем наблюдаемые в рекламе. Никаких количественных доказательств потери нейронов не наблюдалось в неокортексе в целом.65
Сообщалось о более значительных потерях нейронов у мышей, выражающих множественные мутации APP и PS1.66-68. Одной из моделей, показывающих массивную потерю нейронов, являются мыши APPSL / PS1, которые экспрессируют APP человека с помощью шведских и лондонских (V717I) мутаций, обусловленных промотором Thy1 и человека PS1 с мутацией M146L под контролем промотора HMG-CoA-редуктазы. У мышей APPSL / PS1 внутричеребные окраски Aβ1-40 и Aβ1-42 предшествовали осаждению бляшек Aβ, которое начиналось с 3-месячного возраста. Aβ наблюдалось в соматодендритных и аксонных отделениях нейронов в суббукуле, поле CA1 гиппокампа, а также в областях коры.66 Отношение Aβ1-42 / Aβ1-40 было увеличено у мышей APPSL / PS1.69 Значительная потеря (около 30%) пирамидальных нейронов в полях CA1-3 гиппокампа было обнаружено у 17-месячных мышей APPSL / PS1. Потеря нейронов наблюдалась на участках агрегации Аβ и окружающих астроцитов, но, что наиболее важно, также отчетливо наблюдалась в областях паренхимы, удаленных от бляшек Аβ.70 Кроме того, мыши APPSL / PS1 проявляли сильную синапсическую потерю по возрасту в гиппокампальном зубчике извилины и CA1-3 в возрасте 17 месяцев, даже в регионах, свободных от внеклеточных отложений Aβ.69
Другая модель, демонстрирующая выраженную потерю нейронов, выражает человеческие APP-шведские и APP-лондонные мутации, обусловленные промотором Thy1, вместе с двумя мутациями PS1 (KI) (M233T / L235P) в гене PS1 мыши и упоминается как APP / Мыши PS1KI. Модель APP / PS1KI до сих пор является моделью с наиболее агрессивной патологией. Эти животные показали раннее внеклеточное осаждение Aβ в возрасте 2,5 месяцев, которому предшествовало сильное внутриранговое накопление Aβ в полях CA1 / 2 гиппокампа. В возрасте 6 месяцев были обнаружены широко распространенные и многочисленные отложения Aβ в пределах гиппокампальной, кортикальной и таламической областей. Aβ1-42 был преобладающим (85%) Aβ-изовариантом, продуцируемым у мышей APP / PS1KI, и Aβ1-42 олигомеры были очень многочисленны в мозге APP / PS1KI.67 Другие патологические признаки, начиная с возраста 6 месяцев, включали тяжелую аксональную дегенерацию, а также уменьшенная способность выполнять рабочую память и двигательные задачи.71,72 В этот момент также наблюдалась синаптическая дисфункция и потеря в мозге APP / PS1KI. Кроме того, в возрасте 6 месяцев была продемонстрирована потеря 33% пирамидальных нейронов гиппокампа CA1, а также уменьшенный объем слоя пирамидальной клетки CA1 30% и атрофия всего гиппокампа 18% .73 Анализ лобной коры выявили раннюю потерю корковых нейронов, начиная с возраста 6 месяцев, что коррелировало с переходным внутрирангонным накоплением Aβ в отличие от внеклеточной патологии бляшки Aβ.74 В 10-месячном возрасте обширная потеря нейронов (> 50%), присутствовал в пирамидальном клеточном слое полей гиппокампа CA1 / 2, что коррелировало с сильным накоплением intraneuronal Aβ, но не с внеклеточными отложениями Aβ у мышей APP / PS1KI. Очень значительный астроглиоз развился в области сильного внутритрангонального накопления Aβ и потери нейронов.67
Наконец, были получены 5xFAD мыши, экспрессирующие APP человека со шведской, Florida (I716V) и лондонской мутациями вместе с мутантным PS1 (M146L / L286V), регулируемым Thy1-промотором, и наблюдалась устойчивая потеря нейронов. Мышей 5xFAD демонстрировали значительно более высокие уровни Aβ1-42, чем у Aβ1-40, и быстро накапливали огромное количество церебрального Aβ1-42 в молодом возрасте. Отложение Аβ начиналось с 2-месячного возраста в глубоких корковых слоях и в суббукуле. Как мышей в возрасте, отложения Aβ распространяются, чтобы заполнить большую часть коры головного мозга, субикулума и гиппокампа. Аβ-бляшки наблюдались также в таламусе, стволе мозга и обонятельной луковице у более старых мышей, но в этих областях мозга отложения были менее многочисленными. Астроглиоз и микроглиоз были пропорциональны уровням Aβ1-42 и отложению Aβ в мозге 5xFAD и начинались примерно в то время, когда первоначально появились бляшки. Intraneuronal Aβ1-42, накопленный в мозге 5xFAD, начиная с 1,5 месяцев, непосредственно перед первым появлением отложений Aβ через 2 месяца. Синаптические потери начались уже в 4 месяца и были значительными с 9 месяцев в 5xFAD головном мозге, а большие пирамидальные нейроны в корковом слое 5 и субикулуме заметно уменьшились в возрасте 9 месяцев.68 У 5xFAD мышей развились дефициты в задачах пространственной памяти и также проявляли нарушения в тестах на лечение следов и контекстуальных исходов в возрасте 4-6 месяцев.68,75
Данные о характеристиках основных моделей трансгенных мышей AD приведены в таблице 1.
Хотя ни одна из AD-трансгенных моделей полностью не реплицирует болезнь человека, они предложили новое понимание патофизиологии токсичности Aβ, особенно в отношении эффектов различных видов Aβ и возможной патогенной роли олигомеров A.11.
В 1980-х годах обсуждалось, были ли отложения Aβ и, в частности, CAA на стенках сосудов головного мозга, центральной нервной системой или периферическим источником.11 Исследования у мышей APP23, которые развивали сходную степень как бета-пластинок Aβ, так и CAA, обеспечили первое доказательство того, что источник нейронов APP / Aβ является достаточным для индуцирования цереброваскулярного Aβ и связанной с ним нейродегенерации.51 Соответственно, исследования у трансгенных мышей с почти исключительной экспрессией APP нейронной центральной нервной системы, такими как мыши APPDutch, которые развивают почти только CAA, что нейрон Aβ, продуцируемый в мозге, генерирует цереброваскулярную невропатологию Aβ. Кроме того, хотя Aβ1-42 может потребоваться в качестве затравки для осаждения Aβ в любом отсеке (паренхима и сосудистая сеть), исследования у мышей APPDutch и APPDutch / PS1 предполагают, что Aβ1-40 способствует выпадению сосудов, тогда как Aβ1-42 сдвигает осаждение в сторону паренхимы Более того, исследования у мышей hAPP-Arc с мутацией APP-Arctic (E693G) в сочетании с мутациями APP-Swedish и APP-Indiana свидетельствуют о том, что некоторое свойство мутации APP E693G, помимо ее влияния на Aβ1-40 / Aβ1-42, может также влиять на паренхиматозное осаждение по сравнению с осаждением сосудов.56 Следовательно, существующие модели трансгенной мыши мыши показали значительную полезность в расшифровке патобиологии ВГА.
Анализ мозга моделей трансгенных мышей APP, в которых большие количества Aβ накапливались в бляшках, но не развилась нейродегенерация, таких как PDAPP, 35,36 Tg2576,40,41 TgCRND8,45 и APP2365 мышей, не обеспечивают или очень редкую поддержку для обоснованной гипотезы амилоидного каскада. Эта гипотеза подтверждает идею о том, что увеличение производства Aβ и внеклеточного накопления в бляшках приводит к нейротоксичности, что приводит к широко распространенной нейронной потере и деменции.76 Некоторые причины этого обсуждались. Возможно, нейротоксичность является редкой в моделях мыши APP, потому что мышиные нейроны могут быть лишены нисходящих путей, необходимых для того, чтобы Aβ вызывал токсичность, такие как процессы, приводящие к агрегации Тау и образованию нейрофибриллярных клубок в мозге AD.11. Интересно, что после первоначального амилоида гипотеза, стало ясно, что количество бляшек Aβ сравнительно слабо коррелирует с уровнем когнитивного снижения в AD и что число нейрофибриллярных клубок более сильно коррелирует со степенью деменции.77 Возможно, только некоторые виды Aβ (Aβ1-40, Aβ1- 42 или усеченные Aβ) являются нейротоксичными и с использованием мутаций, связанных с семейным AD, мы плохо реплицируем процессы продуцирования и агрегации Aβ в спорадическом мозге AD.11. Любопытно, что усеченные Aβ-пептиды были продемонстрированы в мозге AD более 10 лет назад, 78 79, но наблюдения были частично проигнорированы. Сегодня хорошо известно, что только часть Aβ в постмортном мозге AD является полноразмерной Aβ1-40 или Aβ1-42; N-концевые усеченные варианты Aβ (Aβ3-42 и Aβ11-42) распространены в старческих бляшках мозга AD. 80,81 В отличие от классической гипотезы каскадного амилоида, впоследствии было показано, что растворимые олигомеры Aβ1-42, а не бляшки- ассоциированный Aβ коррелирует лучше всего с когнитивной дисфункцией в AD.6, 82
В настоящее время большой интерес в определении того, какой вид Aβ (Aβ1-40, Aβ1-42 или усеченный Aβ) и форма (олигомеры или отложения) будут отвечать за нейротоксичность и в понимании взаимосвязи между патологиями Aβ и Tau.11 APP трансгенные мыши дали убедительные доказательства токсичности растворимых Aβ-олигомеров in vivo, показывая, что многие патологические и функциональные изменения у мышей происходят до появления патологии Aβ-бляшки. Например, исследования, проведенные у мышей PDAPP, показали, что потеря объема в гиппокампе, преимущественно локализованная на зубчатой извилине, присутствовала у 100-дневных мышей задолго до осаждения Aβ в бляшках.83 Кроме того, потеря общей дендритной длины была очевидна в зубчатой извилине 90-дневных мышей PDAPP задолго до накопления Aβ.84 Мышей Tg2576 проявлялось повышенное отношение растворимого Aβ1-42 / Aβ1-40, дефицит синаптической пластичности в поле CA1 гиппокампа и зубчатая извилина, потеря дендритных шипами в зубчатой извилине и ухудшением пространственной и контекстной памяти за несколько месяцев до значительного осаждения Aβ.42,43 У мышей APP23 дефицит пространственной памяти предшествовал образованию бляшек и увеличению количества пептидов Aβ1-42, связанных с бляшкой, но отрицательно коррелировал с растворимой концентрацией Aβ .50 Мышей Tg-ArcSwe проявляли устойчивые дефициты в пространственной памяти и контекстуальное состояние страха перед наступлением отложения Aβ 57-59, а когнитивные нарушения коррелировали обратно с растворимые уровни Aβ.59 Мыши 3xTg-AD развивали зависимые от возраста синаптические дефекты пластичности и нарушения пространственной памяти перед патологией бляшек Aβ и нейрофибриллярных клубок, но вместо этого коррелировали с растворимыми Aβ1-42.63,64 Наконец, мыши APP / PS1, которые проявляют большое количество компактные бляшки Aβ в коре головного мозга и гиппокампе, продемонстрировали избирательное увеличение Aβ1-42 в их мозге и снижение производительности в задаче пространственной памяти в период, предшествующий явному отложению Aβ47. Эти исследования согласуются с более важной ролью Aβ1- 42 в патогенезе AD и предполагают нейротоксический эффект растворимых форм Aβ.
Поскольку открытие, которое усекало Aβ3-42, представляет собой крупный вид в старческих бляшках головного мозга AD, 80,81 этот пептид получил значительное внимание. По сравнению с Aβ1-42, Aβ3-42 обладает более высокой склонностью к агрегации и повышенной токсичностью in vitro. 85-87 Недавно была создана новая модель трансгенной мыши (TBA2) 88, которая выражала только усеченные Aβ3-42 в нейронах без какой-либо из другие Aβ-пептиды, и впервые было продемонстрировано, что этот пептид является нейротоксичным in vivo, индуцируя потерю нейронов и сопутствующий неврологический дефицит, характеризующийся потерей координации движений и атаксией.
Раньше Aβ считалось действительным внеклеточным, в то время как недавние данные указывают на токсическое действие Aβ во внутриклеточных компартментах. Первые сообщения, показывающие, что Aβ первоначально депонируют в нейронах до появления во внеклеточном пространстве, относятся примерно к 20 годам.89,90. В последнее время было показано, что нейроны в уязвимых регионах AD накапливают Aβ1-42, и было также предложено, что это накопление предшествует внеклеточному осаждению Aβ и образованию нейрофибриллярных клубок.91 Последовательно было опубликовано множество отчетов, демонстрирующих Aβ в нейронах головного мозга AD.92-95 Любопытно, что растворимые олигомеры Aβ, которые были предложены как наиболее токсичные, , преимущественно внутриклеточно в нейронных процессах и синапсах, а не внеклеточно.96,97. Во всех моделях трансгенных мышей, в которых до сих пор отмечалась заметная потеря нейронов, этому предшествовало значительное количество внутрирангонных Aβ-пептидов.98 Например, в APP / PS1KI, у которых развился тяжелый дефицит обучения, коррелирующий с потерей нейрональной области CA1 и атрофией гиппокампа, увеличенным внутриранговым A 1-42 и не бло связан Ар хорошо совпал с потерей нервной; также были увеличены интраневронные N-усеченные виды Aβ3-42, однако доминирующий вид был Aβ1-42 в модели APP / PS1KI.67,73 В соответствии с этим исследованием исследования на мышах TBA2 впервые показали, что intraneuronal Aβ3 -42 накопления достаточно для запуска гибели нейронов и вызывания ассоциированного неврологического фенотипа. Хотя в модели TBA2 отсутствуют важные AD-типичные невропатологические особенности, такие как запутывание и дегенерация гиппокампа, он ясно продемонстрировал, что внутриранговое Aβ3-42 является нейротоксичным in vivo.88 Накопление Intraneuronal Aβ1-42 также было зарегистрировано на нескольких моделях трансгенных мышей без явной потери нейронов , в том числе Tg2576,44 3xTg-AD, 63 и 5xFAD.68. Эти исследования показывают, что внутрипанельный растворимый Aβ является патологическим признаком AD, который уже давно игнорируется и является ключевым фактором, приводящим к потере нейронов в болезни до внеклеточное осаждение Aβ.
Потеря синаптической плотности нейронов и число синапсов представляют собой еще одну инвариантную особенность AD, которая, как представляется, предшествует открытой дегенерации нейронов. 99,100 Примечательно, что было показано, что потеря синаптических терминалов лучше коррелирует с ухудшением познавательной способности, чем нагрузка на бляшке и клубок или потеря нейронов, к концепции, что потеря синапсов является одним из ключевых событий, ведущих к когнитивной дисфункции в AD.37, 101-104. Накопительные данные от трансгенных мышей AD, что intraneuronal Aβ1-42 вызывает не только раннюю потерю нейронов, но также синаптический дефицит. Например, у мышей Tg2576 наблюдалось увеличение накопления интранурональной Aβ1-42 со старением, и это накопление было связано с аномальной синаптической морфологией перед патологией бляшек Aβ.44 У мышей 3xTg-AD развивались зависящие от возраста синаптические дефекты пластичности, но до патологий бляшек и нейрофибриллярных клубок ; синаптическая дисфункция коррелировала с накоплением внутрирангового Aβ1-42.63 Intraneuronal Aβ1-42, накопленного в мозге 5xFAD, начиная с 1,5 месяцев, непосредственно перед первым появлением отложений Aβ через 2 месяца. Синаптические потери начались уже в 4 месяца и были значительными с 9 месяцев в мозге 5xFAD, тогда как локальная потеря нейронов впервые стала очевидной в возрасте 9 месяцев.68 Развитие мышей APPSL / PS1, которые обнаруживают внутриранговое накопление Aβ1-42, впервые предложила рассмотреть вопрос о том, являются ли изменения синаптической целостности предшествующими нейронными потерями в трансгенной модели животных AD, и данные указывают на то, что потеря нейронов оказывает ограниченное влияние на возрастную синаптическую потерю и что по крайней мере часть синаптических потерь, наблюдаемых в регионах, свободных от отложений Aβ, обусловлена повышенными уровнями растворимых Aβ-олигомеров.69
Что касается взаимодействия между патологиями Aβ и Tau, хотя развитие бляшек Aβ почти наверняка обусловлено мутациями APP и PS1 FAD, тогда как путаноподобная патология обусловлена мутациями Tau, похоже, что такие мутации взаимодействуют, как показывают исследования в трансгенных моделях мыши с мутацией Туу. Например, мышечные мышечные мыши TAPP (экспрессирующие мутантный мутант K670N / M671L APP и мутант P301L Tau) имеют усиленную нейрофибриллярную патологию в лимбических областях, в первую очередь амигдалу, по сравнению с трансгенными животными JNPL3 (экспрессирующими один мутант P301L Tau), что указывает на то, что образование На включения Тау может влиять повышение уровня APP или Aβ-пептидов.62 Кроме того, интрацеребральные инъекции анти-Aβ-антител в гиппокамп мышей 3xTg-AD не только уменьшали накопление Aβ, но также приводили к очистке ранней стадии, но не поздние стадии, гиперфосфорилированные агрегаты Тау. В то время как отложения Aβ очищались в течение 3 дней, поражение Тау потребовало немного более длительного времени и не уменьшалось до 5 дней после инъекции. Таким образом, сначала Aβ очищали, а затем зазор Tau, локализованный в соматодендритном отделении. Напротив, к 30 дням после инъекции отложения Aβ вновь возросли, хотя патология Тау не была очевидна в этот момент времени.105 Эти исследования показывают, что модуляция Aβ влияет на патологию Tau и предполагает, что патология Tau может быть ниже по течению от поколения Aβ.
Чтобы исследовать AD, различные трансгенные мышиные модели были получены посредством сверхэкспрессии APP и / или пресенилинов, содержащих одну или несколько мутаций, обнаруженных в семейных AD.34,40,45,49,53, хотя ни один из AD-трансгенных мышей модели точно воспроизводят состояние человека, способность изучать подобные патологические процессы у живых животных дает ценную информацию о механизмах болезни и возможностях тестирования терапевтических подходов. Модели мышей AD были ключевыми для понимания роли растворимых олигомеров Aβ в болезни патогенеза, а также взаимосвязи между патологиями Aβ и Tau. Данные, полученные при сравнении различных линий мышей AD, показывают, что начало и тяжесть отложений Aβ непосредственно связаны с уровнем растворимого пептида Aβ1-42.42,43,47,58,59,63,64,83, 84 Существует накопление доказательств от трансгенных мышей AD, что intraneuronal Aβ1-42 вызывает раннюю потерю нейронов, а также синаптические дефициты.63, Исследования в трансгенной модели животных AD, которые проявляют выраженную нейронную и синаптическую потерю, указывают на то, что изменения синаптической целостности предшествуют потере нейронов 69, что соответствует гипотезе о том, что синаптическая потеря является одним из самых ранних событий в патогенезе AD.37, 101-104. Кроме того, данные из моделей трансгенной мыши AD подтверждают, что Aβ может прямо или косвенно взаимодействовать с Tau для ускорения образования нейрофибриллярных клубок .62,105 Наконец, трансгенные модели AD могут позволить определять и оценивать потенциальные целевые объекты лекарственного средства и разрабатывать терапевтические стратегии, которые могут мешать или замедлять начало AD.106
Схематическая диаграмма, иллюстрирующая протеолитическое расщепление белка предшественника амилоида (APP). α-секретаза (неамилоидогенный путь) расщепляет APP в домене Aβ для высвобождения двух пептидов, включая нейропротективный растворимый APPα, тогда как β- и γ-секретазы (амилоидогенный путь) действуют последовательно для расщепления APP в N- и C-терминале части Aβ-области, соответственно, продуцируя Aβ-пептид и инициируя нейродегенеративную активность.
Невропатологические особенности основных моделей трансгенных мышей болезни Альцгеймера.
CAA = церебральная амилоидная ангиопатия; Dash (-) = не сообщается.
источник
Владельцы патента RU 2532525:
Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается создания модели болезни Альцгеймера. Для этого используют трансгенных мышей линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J. В кровеносную систему этих животных вводят препарат, содержащий в своем составе синтетический аналог изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида при аминокислотной последовательности DAEFRH[isoD]SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7 [isoD]. Препараты вводят в дозе 100 мкг, в объеме раствора 200 мкл/гол один раз в месяц. Способ обеспечивает возможность произвольного изменения скорости развития патологических процессов у подопытных животных в зависимости от целей конкретного исследования за счет варьирования числа инъекций и/или количества синтетического пептида в одной инъекционной дозе. 1 ил.,1 табл.
Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к способу создания модели болезни Альцгеймера, отличающемуся тем, что церебральный амилоидоз у экспериментальных животных вызывается введением в их организм синтетических аналогов изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7.
Болезнь Альцгеймера (БА) является смертельной нейродегенеративной патологией, клиническое протекание которой сопровождается неуклонным упадком психомоторных функций пациента на протяжении длительного периода (1). В России число таких больных составляет около полутора миллионов человек (2). Лекарственных средств, способных остановить течение данной патологии, в настоящее время не существует нигде в мире, однако их поиску придается колоссальное значение во всех развитых странах, где с ростом числа лиц пожилого возраста увеличивается и число страдающих от болезни Альцгеймера.
Характерным молекулярным процессом болезни Альцгеймера является конформационное превращение небольшого (39-43 аминокислотных остатка) белка, бета-амилоида (3). Этот белок является нормальным компонентом крови, где присутствует в виде мономера, однако образует олигомеры и надмолекулярные агрегаты (амилоидные бляшки) у пациентов с клинически диагностированной болезнью Альцгеймера (4). Согласно широко принятой амилоидной гипотезе, именно полимеризация бета-амилоида, которая приводит к церебральному амилоидозу, является ключевым событием, запускающим весь патогенный каскад болезни Альцгеймера (5).
Церебральный амилоидоз представляет собой процесс образования плотных конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах головного мозга и является одним из важнейших нейроморфологических признаков болезни Альцгеймера (6). В настоящее время существует несколько животных моделей болезни Альцгеймера, основанных на использования трансгенных грызунов (мышей, крыс). В этих моделях церебральный амилоидоз обусловлен изменениями в геноме, которые приводят к повышенной экспрессии эндогенного человеческого бета-амилоида (Аβ) в крови (7-9). Мыши и крысы дикого типа в отличие от всех остальных млекопитающих имеют три замены в аминокислотной последовательности бета-амилоида и не подвержены болезни Альцгеймера. Введение синтетических аналогов Аβ в организм млекопитающих не вызывает у них развития церебрального амилоидоза и, соответственно, патогенеза БА. В то же время было показано, что интрацеребральные инъекции гомогенизированных амилоидных бляшек, выделенных из мозга пораженных болезнью Альцгеймера людей, приводили к развитию церебрального амилоидоза у подопытных животных (10-19). Эти данные дали основание считать, что главной движущей силой патогенеза БА является агрегирование эндогенного бета-амилоида под влиянием структурно и/или химически измененной изоформы бета-амилоида, которая содержится в экстрактах амилоидных бляшек (20-21). Тем не менее, несмотря на многочисленные исследования в течение более чем 20 лет ни одна научная группа в мире не смогла найти такую изоформу бета-амилоида. Соответственно, к моменту создания настоящего изобретения ничего не было известно о точной идентификации индуцирующего патологию болезни Альцгеймера агента и, тем более, никому не удавалось создать экзогенно-индуцированную животную модель болезни Альцгеймера
В 2008 году авторами данного изобретения было показано, что изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в положении 7 ведет к цинк-зависимой олигомеризации металл-связывающего домена бета-амилоида (22). Так как амилоидные бляшки содержат до 75% изомеризованного таким образом бета-амилоида и избыток ионов цинка, то нами — первыми и единственными в мире — было предположено, что именно цинковые комплексы этой изоформы бета-амилоида могут являться молекулярным агентом, вызывающим олигомеризацию и последующую агрегацию растворимых форм бета-амилоида, то есть тех самых процессов, которые абсолютным большинством исследователей считаются пусковыми механизмами патогенеза болезни Альцгеймера. Важно отметить, что в работе М. Meyer-Luehmann et al (14) и во всех остальных известных работах нашего времени способность предлагаемого нами агента вызывать церебральный амилоидоз не была проверена. Таким образом, к моменту создания настоящего изобретения никто не был в состоянии обосновано указать, какая изоформа бета-амилоида является инициатором возникновения церебрального амилоидоза, что безусловно указывает на совершенную неочевидность настоящего изобретения.
Настоящее изобретение состоит в экзогенном инициировании церебрального амилоидоза у млекопитающих, которые экспрессируют эндогенный человеческий бета-амилоид в физиологически обусловленных или же искусственно завышенных количествах. В качестве индуцирующего патологию болезни Альцгеймера агента в настоящем изобретении впервые в мире используются инъекции препаратов, содержащих в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида (изоАсп7-бета-амилоида) и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7. Преимуществом таких экзогенно-индуцируемых моделей болезни Альцгеймера по сравнению с существующими в настоящее время конституциональными трансгенными моделями является возможность произвольного изменения скорости развития патологических процессов у подопытных животных в зависимости от целей конкретного исследования. Дополнительным преимуществом данного изобретения является возможность использования в качестве модели болезни Альцгеймера нетрасгенных животных, так как для специалистов в данной области совершенно очевидно, что если молекулярный агент вызывает церебральный амилоидоз у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий бета-амилоид, то этот же агент, а именно — препараты, содержащие в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7, — будет с неизбежностью вызывать церебральный амилоидоз у всех остальных млекопитающих, у которых человеческий бета-амилоид присутствует конституционально.
Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в создании экзогенно-индуцируемой животной модели болезни Альцгеймера. Никаких прототипов данного изобретения не существует нигде в мире, так как лишь в рамках настоящего изобретения впервые показана роль препаратов, содержащих в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7, в качестве индуцирующих патологию болезни Альцгеймера экзогенно-вводимых агентов.
Пример осуществления изобретения.
Для создания экзогенно-индуцируемой модели болезни Альцгеймера нами была использована линия трансгенных мышей B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J (JAX® GEMM® B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J) без специфицированной патогенной микрофлоры. У мышей данной линии имеются следующие изменения в геноме (21):
— Человеческий ген, кодирующий мутированную форму («Шведский вариант», APPswe, K670N/M671L) Белка-предшественника бета-амилоида; эта форма вызывает наследственную болезнь Альцгеймера.
— Человеческий ген, кодирующий мутированную форму (А246Е) Пресенелина 1; эта форма также вызывает наследственную болезнь Альцгеймера.
Оба гена находятся под управлением промотера мышиного прионного белка. Трансгенный продукт был введен в оплодотворенные яйцеклетки мышей линии C57BL/6JXC3HeJF2, успешная линия была выделена и размножена путем обратного скрещивания с мышами линии C57BL/6J на протяжении 14 поколений.
Мыши B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J характеризуются нейропатологическими повреждениями, которые имеют близкое сходство с выявленными у пациентов с болезнью Альцгеймера (амилоидные бляшки, нейрофибриллярные клубки, гибель нейронов, психомоторные нарушения…) и являются коммерчески доступными.
На период экспериментов трансгенные мыши содержались в стерильных условиях (Пущино, филиал ИБОрХ РАН), Все работы с животными проводились с использованием индивидуальных средств защиты (технологическая одежда). Весь использованный в экспериментах расходный материал (шприцы, ампулы, марля, вата), а также трупы павших и эвтаназированных животных подвергались специализированному накоплению и дальнейшей утилизации на станции огневого уничтожения отходов ФИБХ РАН. Для накопления использованных игл применялся контейнер Шарпа. При проведении эксперимента использовались стандартные условия содержания животных в соответствии с Программой по уходу и содержанию животных в ПЛЖ, рассмотренной и одобренной Институтской Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных в июле 2009 года.
В качестве препаратов для инъекций использовались;
— «А»: раствор бета-амилоида в воде (концентрация = 100 мкМ)
— «В»: Раствор изоАсп7-бега-амилоида в воде (концентрация = 100 мкМ)
«Аβ42» (активный компонент препарата «А»): синтетический 42-членный пептид DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA. Аминокислотная последовательность данного пептида соответствует бета-амилоиду человека (Beta-amyloid protein 42, или Аβ42), который является фрагментом 672-713 Амилоидного прекурсорного протеина (Amyloid beta A4 protein, UniProtKB/Swiss-Prot P05067, A4_HUMAN). Средняя молекулярная масса: 4514 г/моль. «[isoD7]-Aβ42» (активный компонент препарата «В»): синтетический 42-членный пептид DAEFRH[isoD]SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA. Этот пептид является [isoD7]-аналогом вещества «Аβ42». Средняя молекулярная масса: 4514 г/моль.
Все используемые вещества и препараты относится к малоопасным химическим веществам (4-й класс опасности).
Учитывая, что средний объем крови у мыши равен 2 мл, а концентрация бета-амилоида в крови трансгенной альцгеймеровской мыши равна 200 нМ, то общее содержание циркулирующего бета-амилоида в этом животном составляет около 0.002·200·10-9=0.4 наномоль = 2000 нг (2 мкг). В соответствие с целью исследований количество вводимого препарата должна быть по меньшей мере в 25 раз выше количества нативного бета-амилоида и, соответственно, должно составлять 25*2000 нг = 50000 нг (50 мкг). Соответственно, концентрация изоформы бета-амилоида в 100 мкл вводимого раствора препарата может быть рассчитана из соотношения:
25·0.200 мкМ·2000 мкл = х мкМ·100 мкл,
и будет составлять 100 мкМ. При этом в 100 мкл вводимого препарата общее количество бета-амилоида составит 50 (пятьдесят) мкг, а в 200 мкл — 100 (сто) мкг.
Возраст животного к первой инъекции = 8-10 недель. Каждый препарат вводился раз в месяц внутривенно в ретроорбитальное венозное сплетение в объеме 200 мкл/гол, всего было проведено по 8 инъекций для каждого животного, последняя инъекция проводилась в возрасте 9 месяцев.
Внутривенная инъекция в ретроорбитальное венозное сплетение у мышей разрешена для проведения в отсутствие анестезии. Для проведения данной процедуры мышь захватывают за кожу шеи большим и указательным пальцами, другими пальцами надежно удерживают за кожу спины и прижимают к сетке для содержания. Иглой шприца прокалывают конъюнктиву внутреннего угла глаза и проводят ее на глубину 1-2 мм за глазное яблоко, где находиться венозное сплетение. При правильном введении в иглу из ретроорбитального сплетения самотеком поступает кровь (при сомнении можно в шприце создать небольшое отрицательное давление). Убедившись в правильности местонахождения, медленно вводится испытуемый препарат. После инъекции стерильной марлевой салфеткой слегка надавливается глазное яблоко с целью остановки кровотечения. Таким способом можно вводить препарат шприцем объемом 1 мл и иглой №27-29G½. Объем вводимого препарата 100-200 мкл/гол. В течение всего эксперимента мыши содержатся индивидуально в клетках Тип-2 с идентификационными табличками, на которых указывается количество животных, название линии, пол, вид и дата манипуляции. Для облегчения боли и стресса при внутривенной инъекции в ретроорбитальное венозное сплетение будет использоваться анестезия. Основные болевые ощущения и стресс связаны с фиксацией и внутривенной инъекцией. По окончании эксперимента в каждой группе эвтаназировались все животные и приготавливались препараты головного мозга. Эвтаназия проводилась в соответствии с Российским национальным санитарным законодательством и Американским законодательством по защите животных углекислым газом согласно утвержденному в комиссии IACUC Протоколу-заявке на манипуляции с животными №09/01.
Морфологический анализ тканей мозга трансгенных животных проводился с помощью гистохимических методов, описанных ниже.
Покрытие предметных стекол желатиной с алюмохромовыми квасцами — 2 г желатина растворялось в 400 мл дистиллированной воды, с нагреванием раствора до 55°C при постоянном помешивании. После растворения добавлялось 0,2 г алюмохромовых квасцов и раствор хорошо перемешивался. Раствор нагревался до 60°C для покрытия предметных стекол. Стекла высушивались в течение суток перед использованием.
Фиксация мозга — Мозг мыши вынимается из черепной коробки и помещается в свежеприготовленный раствор 4% параформальдегида в фосфатном буфере (pH 7,4) на шесть суток с трех разовый сменой раствора через двое суток. На седьмые сутки, непосредственно перед изготовлением срезов, мозг помещается на шестеро суток в 30% раствор сахарозы с трехразовой сменой раствора через двое суток.
Изготовление срезов — Мозг мыши извлекается из раствора сахарозы, промакивается фильтровальной бумагой и покрывается средой для заморозки (например Tissue-Tek® ОСТ Compound, компании Thermo). Далее мозг замораживался либо на элементе Пельтье, которым снабжен криотом фирмы Thermo, либо в жидком азоте. После заморозки мозг помещался в криотом и делались срезы толщиной в 30 микрон. Срезы помещались на предметное стекло, покрытое желатином, и подвергались гистологическому окрашиванию.
(1) Окрашивание гематоксилиом по Майеру: Срезы последовательно по 2 минуты дегидратируют в 100%, 96% и 70% спирте и помещаит на 2 минуты в воду. Затем препараты помещают на 30 мин в раствор гематоксилина, примывают водой и проявляют в ТАР воде до появления синего окрашивания.
(2) Окрашивание амилоидных бляшек спиртовым раствором Конго-красным; Срезы, предварительно дегидратированные в спиртовых растворах и окрашенные гематоксилином по Майеру, инкубируются в насыщенном 80% спиртовом растворе NaCl, содержащим 1% одного процентного NaOH, в течение 20 минут. Затем Препарат помещается в раствор Конго-красного, содержащего 1% одного процентного NaOH, в течение 20 минут. Препараты два раза по 5 минут дегидратируют в 100% спирте, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Визуализация амилоидных бляшек розового цвета проводится в проходящем свете и подтверждается в поляризационном. Для одновременного окрашивания амилоидных и клеточных структур был применен подход с окрашиванием клеток гематоксилином по Майеру и бляшек Конго-красным.
Число конгофильных амилоидных бляшек подсчитывалось вручную с помощью светового микроскопа в поляризованном свете. Результаты сравнительного анализа показали (Таблица 1, Рисунок 1), что число бляшек у мышей, инъецированных препаратом синтетического аналога изомеризованного по аспратату-7 человеческого бета-амилоида значительно превышает число бляшек у контрольных животных, которым вкалывался препарат, содержащий интактный бета-амилоид, что однозначно свидетельствует о способности изомеризованного по аспратату-7 человеческого бета-амилоида вызывать церебральный амилоидоз у соответствующим образом обработанных животных.
Способ создания модели болезни Альцгеймера, заключающийся во введении в кровеносную систему трансгенным мышам линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J препарата, содержащего в своем составе синтетический аналог изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида при аминокислотной последовательности DAEFRH[isoD]SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) и/или его фрагмент, включающий остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7 [isoD], в дозе 100 мкг, вводимой в объеме раствора 200 мкл/гол один раз в месяц.
источник