Биомаркеры при болезни альцгеймера

Ученые из Калифорнийского Университета Лос-Анджелеса (University of California Los-Angeles, UCLA, США) получили первые доказательства того, что можно разработать простой метод анализа крови на наличие в головном мозге человека бета-амилоида, накопление которого является главным признаком развития болезни Альцгеймера. Несмотря на высокую распространенность болезни Альцгеймера среди населения, в частности, только в США от нее страдает около 5 млн. человек, до сих пор не разработано надежного анализа, позволяющего диагностировать у человека это нейродегенеративное заболевание. В то же время болезнь Альцгеймера является одной из самых распространенных причин смерти человека в развитых странах. Использование биомаркеров крови для подтверждения наличия у человека болезни Альцгеймера может стать главным достижением в области диагностики заболевания. По словам доктора Лианы Г. Апостоловой (Liana G. Apostolova), руководителя нового исследования, главы лаборатории нейровизуализации в Центре Исследования Болезни Альцгеймера Мери С. Истон при UCLA (Mary S. Easton Center for Alzheimer’s Disease Research at UCLA, США), определение биомаркеров в крови пациента имело бы значительные преимущества, поскольку биоматериал легко получить, кроме того, данный метод можно применять среди больших групп населения, проживающих в удаленных районах. По мнению ученого, определение биомаркеров в крови может оказать большое влияние на лечебную работу и клинические испытания. Точно диагностировать наличие у человека болезни Альцгеймера можно только при посмертном исследовании тканей его головного мозга. При постановке клинического диагноза у пациента врачи в основном анализируют симптомы заболевания, указывающие на нарушение его когнитивной функции, например, наличие потери памяти. Два метода, которые используются в настоящий момент для определения образования бета-амилоида, характерного для болезни Альцгеймера, имеют значимые недостатки. Один из методов основан на исследовании спинномозговой жидкости, для чего пациенту проводят пункцию спинного мозга – инвазивную процедуру, при выполнении которой можно повредить нервы и вызвать другие серьезные осложнения. Метод позитронно-эмиссионной томографии амилоида – метод диагностической визуализации, основанный на применении радиоактивного вещества, обладает высокой диагностической эффективностью, однако, ассоциирован с действием радиоактивного излучения на обследуемого. Этот метод дорогостоящий, и в западных странах страховка пациента не покрывает его стоимость. Кроме того, не все медицинские учреждения располагают данной технологией. Ученые из UCLA разработали простой метод, позволяющий предсказать наличие амилоидоза головного мозга (отложения бета-амилоида в головном мозге). Метод основан на интерпретации результатов обычного клинического обследования пациента (тестирования памяти, структурной магнитно-резонансной томографии) и одновременном определении в крови белков, ассоциированных с болезнью Альцгеймера. Результаты исследования показали, что разработанный метод можно использовать для предсказания наличия бета-амилоида в головном мозге с умеренной степенью точности.

«Результаты нашего исследования показали, что панели белков крови можно использовать для определения патологии типа болезни Альцгеймера», – говорит Апостолова. По словам ученого, необходимо провести дальнейшие исследования с целью усовершенствования созданного метода, в частности, внедрения системы оценки патологического состояния. Однако уже полученные данные указывают на то, что создание подобного диагностического метода является возможным, и он появится на рынке в ближайшее время. Несмотря на то, что пока не существует лечения, которое может остановить или обратить вспять прогрессирование болезни Альцгеймера, разработка неинвазивного, недорогого и надежного метода диагностики этого заболевания может помочь уберечь пациентов и их семьи от тревоги, вызванной неопределенностью, на раннем этапе развития болезни направить пациентов в службу поддержки и обеспечить доступность существующих и будущих методов терапии болезни Альцгеймера. Диагностика болезни Альцгеймера, основанная на определении биомаркеров в крови, обладает значительными преимуществами, поскольку биоматериал легко получить, кроме того, данный метод можно применять среди больших групп населения, проживающих в удаленных районах.)

L. G. Apostolova, K. S. Hwang, D. Avila et al. Brain amyloidosis ascertainment from cognitive, imaging, and peripheral blood protein measures. Neurology, 2015; 84 (7): 729

источник

Биомаркеры для ранней диагностики болезни Альцгеймера: «Азоцитарный ген ALZheimer» — новый биомаркер крови?

Срочно необходимы неинвазивные тесты для раннего выявления дегенеративной деменции с использованием биомаркеров. Тем не менее, до настоящего времени достоверные внеклеточные диагностические маркеры (плазма / сыворотка, тромбоциты, моча, соединительная ткань) для ранней диагностики болезни Альцгеймера (AD) отсутствуют. На стадиях заболевания с явными когнитивными нарушениями клинический диагноз вероятного АД производится с точностью до 90% с использованием современных клинических, нейропсихологических и методов визуализации. Диагностическая чувствительность и специфичность даже на ранних стадиях заболевания улучшаются с помощью маркеров CSF, в частности комбинированных тау и амилоидных β-пептидов (Aβ) и плазменных маркеров (например, Aβ-42 / Aβ-40). Недавно новый ген / белок — ALZAS (ALZheimer ASsociated protein) — с 79 аминокислотной последовательностью, содержащей фрагмент амилоида β-42 (Aβ-42), трансмембранный сигнал белка предшественника амилоида (APP) и 12 аминокислот C -терминал, не присутствующий ни в каких других известных аллелях APP, был обнаружен на хромосоме 21 в области APP. Обратная транскриптаза-ПЦР выявила экспрессию транскрипта этого белка в областях коры головного мозга и гиппокампа, а также в лимфоцитах пациентов с АД человека. Выражение ALZAS отражается специфическим аутоиммунным ответом у пациентов с АД, направленным против конца ct-12 альфа-пептида, но не против Aβ-последовательности. Исследования ELISA плазмы выявили самые высокие титры ALZAS у пациентов с умеренным когнитивным расстройством (предсимптоматический AD), но только умеренно увеличились титры в подтвержденном аутопсией AD, тогда как низкие или неопределяемые титры ct-12 были обнаружены у когнитивно интактных возрастных субъектов и молодых управления. Антиген, белок ALZAS, был обнаружен в плазме на более поздних клинических стадиях AD. Предполагается, что ALZAS представляет собой индикатор в динамическом равновесии между периферическими и дегенеративными изменениями головного мозга в AD и может стать полезным «неинвазивным» диагностическим маркером посредством простого анализа крови.

Болезнь Альцгеймера и диагностика

ALZheimer ASsociated protein (ALZAS)

— АЛЗАС как будущий биомаркер?

Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенной причиной деменции у пожилых людей, что составляет 65-70% всех случаев [1]. Риск пожизненного риска для AD в возрасте от 65 до 100 лет составляет 33% для мужчин и 45% для женщин с ежегодным увеличением на 1-2% в седьмом десятилетии до почти 60% в 10-м десятилетии с удвоением каждые 5 лет. AD очень распространен и, следовательно, является основной проблемой общественного здравоохранения. По мере роста населения мира число людей с АД, как ожидается, резко возрастет с примерно 24 миллионов человек в 2001 году до 81 миллиона к 2040 году [2]. Общая сумма ежегодных затрат на лечение и уход за сумасшедшими пациентами оценивается примерно в 250 миллиардов долларов США [3]. Деменция, после сердечно-сосудистых заболеваний и злокачественных новообразований, является третьей частой причиной смерти.

С генетической точки зрения, AD является гетерогенным расстройством с двумя (редкими) семейными и (частыми) спорадическими формами. Семейный AD (FAD), составляющий менее 2% от общего числа, является аутосомно-доминантным расстройством с началом до 65 лет, вызванным мутациями гена APP на хромосоме 21 [4] и, реже, мутациями в гомологичный пресенилин 1 (PSEN1) на хромосоме 14 и пресенилин 2 (PSEN2) на хромосоме 1 [5-7]. Хотя эти последние формы встречаются редко с распространенностью ниже 0,1% [8], ряд генов, например, аллель аполипопротеина E (APOE) ɛ4, были вовлечены в спорадический AD (sAD), который представляет собой подавляющее большинство случаев. Алоэ APOE ɛ4 действует как главный генетический фактор риска в sAD и изменяет возраст начала [9-12]. Общим молекулярным механизмом мутаций или полиморфизма этих генов, связанных с патогенезом AD, является их стимулирующий эффект генерации амилоида β (Aβ) из-за дисбаланса метаболизма APP [13] (рис.1).

Основные патогенные факторы, вызывающие болезнь Альцгеймера.

AD — многофакторное и гетерогенное расстройство, патогенез которого не полностью понят. В настоящее время наиболее популярной гипотезой об его этио-патогенезе является «гипотеза амилоидного каскада», согласно которой дисбаланс между продуцированием и очисткой Aβ в мозге является инициирующим событием, что в конечном итоге приводит к нейронной / синаптической дегенерации и деменции [14] , Измененная клеточная обработка белка предшественника амилоида (APP) с повышенной продуцированием или уменьшение удаления продуктов расщепления, таких как Aβ, является основным фактором для осаждения амилоида [15]. APP является членом семейства интегральных мембранных белков, который был идентифицирован путем секвенирования Aβ, депонированного в мозгу AD [16]. На хромосоме 21, 19 альтернативно составленные экзоны кодируются для APP, длина до 770 аминокислот. Он вездесущ и экспрессируется в различных изоформах, обладает длинным внеклеточным / внутривезикулярным N-терминалом и коротким цитоплазматическим C-концевым концом. Все изоформы содержат полную последовательность Aβ. Превышение экспрессии APP является следствием различных стимулов, таких как ишемия, травма или воспаление in vitro, или достигается в трансгенных (tg) животных моделях [17].

В соответствии с этой гипотезой, как внутримозговая инфузия Aβ в FTDP-17 tau мутации P301L-экспрессирующих tg мышей, так и скрещивание этих животных с мутациями APP tg 257G показала обострение нейрофибриллярной патологии [18, 19] и в 3 × tg-AD мышей, было обнаружено, что осаждение A предшествует нейрофибриллярной патологии, будучи более тяжелой, чем у мышей с двойным tg 2 × tg-AD [20, 21]. Однако у этих мышей, несущих синаптическую дисфункцию PSEN1 APP и tau (P301L), проявлялась в возрастной манере перед патологией бляшек и клубок [21], что указывало на то, что патологию бляшек и клубок способствуют когнитивной дисфункции в более поздние моменты времени.

Но до настоящего времени никакие данные из человеческих условий не поддерживают гипотезу амилоидного каскада (см. [22]), и в мозгах пациентов с АД нет никаких определенных доказательств сверхэкспрессии трансмембранного белка APP большого типа. Aβ получают из APP в результате двух последовательных протеолитических расщеплений с участием связанной с мембраной аспартил-протеазы (β-секретазы, BACE1) и двух гомологичных мембранных протеаз (PSEN1 и PSEN2), соответствующих активам λ-секретазы [23]. Внутри рафтовых кластеров предполагается, что APP расщепляется β-секретазой и наружными плотами α-секретазой [24]. Этот фермент расщепляет APP в середине области Aβ для генерации секретируемого экстрадомена (α-APP) и более короткого α-расщепленного COOH-концевого заглушки APP (α-CTF), который также расщепляется 7-секретазой. Aβ-42, также предлагаемый быть нейротоксичным, продуцируется протеолитическим расщеплением — многочисленные протеазы способны расщеплять Aβ на нескольких участках in vitro [25] — и накапливаются в виде фибриллярных агрегатов в бляшках и стенках сосудов (рис.2). Уплотнения на основе карбокси-терминалов (ЦФТ), которые проявляют важную нейропротективную и нейротропную активность, транспортируются антероградным аксональным транспортом и имеют функциональное значение для формирования синапсов [26]. Недавно был рассмотрен последний прогресс в понимании роли растворимых олигомеров А в AD [27].

Молекулярный патогенез болезни Альцгеймера. Осаждение амилоида β-пептида после расщепления белка предшественника амилоида (APP) и гиперфосфорилирования тау-белка вызывает образование бляшек, нейрофибриллярных клубок и нейродегенерацию с потерями нейронов и синапсов.

Выделенная роль Aβ в патогенезе AD была исследована in vivo без ингибирования комплексного каскада при обработке мышей APP tg, несущих конструкцию мышиного Aβ под контролем промотора NF-L, показала значительные патологические изменения с интраневральной экспрессией Aβ, широко распространенный апоптоз и реактивный глиоз, приводящий к смерти. Когда пептид Aβ транспортируется путем связывания с сигнальным пептидом NCAM во внеклеточные пространства, патологических изменений не происходит [21]. Эти данные и недавняя демонстрация внутрирангового накопления Aβ-42 в качестве вероятного продукта нормального метаболизма нейронов с повреждением синапсов уже до отложения Aβ в ткани мозга свидетельствуют о его важной роли в прогрессировании болезни [17, 28] и в качестве источника для эктраннейронной агрегации Aβ. Смертность нейронов, характерная особенность AD, связана с высвобождением олигомерного внутриклеточного Aβ-42 в окружающую ткань, что может стимулировать образование амилоидогенных фрагментов APP, усиливать уровни внутриклеточного Aβ в соседних клетках и действуют как очаг для осаждения секретируемого Aβ [29, 30]. Недавние исследования, однако, указывают на то, что внутрирангонная иммунореактивность Aβ, наблюдаемая уже в молодом человеческом мозге, не является предиктором амилоидоза головного мозга или нейрофибриллярной дегенерации [31]. Имеются лишь слабые корреляции между амилоидными отложениями (числами бляшек) и дисфункцией нейронов как у человека, так и у мышей tg [32], а скорость атрофии мозга не определяется количеством нерастворимого Aβ в сером веществе [33]. Однако существует прямая зависимость между синаптической потерей и растворимой Аβ, которая индуцировала гипотезу диффузных диффузных диффундирующих лигандов (АДЛЛ), полученных из Aβ, которая предполагает, что растворимые олигомеры являются высоконеотоксичными белками и могут быть причиной разрушительной функции и пластичности синапсов, нарушая тем самым когнитивные функции [27, 34-37]. Экзогенные, растворимые (кровяные) Aβ-пептиды могут проникать в мозг через дефектный гематоэнцефалический барьер и избирательно связываться с нейронами [38].

APP tg B6SJL — иммунная гипофункция к Aβ, предполагающая, что Aβ-специфический нарушенный адаптивный иммунный ответ может способствовать невропатологии [39]; увеличение аутоантител к Aβ у пациентов с АД предполагает, что гуморальный иммунный ответ на Аβ может способствовать дегенерации нейронов, процесс с последствиями для будущих вакцинных методов лечения AD [40]. Было показано, что короткие иммуноглобулины Aβ уменьшают нагрузку на мозг A и дефицит обучения в мышиной модели AD в отсутствие специфического к Aβ клеточного иммунного ответа [41], и предполагается, что выбранные моноклональные антитела человека Aβ могут уменьшать и ингибировать отложения Aβ в мозге [42] в отсутствие Аβ-специфической реактивности Т-клеток [43], что требует тщательного отбора антигенов и антител, чтобы максимизировать эффективность и минимизировать побочные эффекты [44].

Было показано, что почти параллельно с осаждением Aβ в бляшках путаницы состоят из аномально фосфорилированного тау-белка [45]. Тау является нормальным аксоновым белком, который связывает микротрубочки, способствуя их сбору и стабильности, его гиперфосфорилирование вызывает разборку микротрубочек и, таким образом, нарушает перенос аксонов, нарушая работу нейронов и синаптических функций [46, 47]. Тау-белок образует аномальные фибриллы в AD и другие нейродегенеративные заболевания, называемые tauopathies. Он является высокорастворимым и принимает изначально раскрытую структуру в растворе, тогда как в его фосфорилированной нитевидной форме, например, нейрофибриллярные тангельсы (NFT), небольшие сегменты tau принимают β-конформацию и взаимодействуют с другими тау-мольдулами, что приводит к образованию нечеткого слоя нитей [48]. Связь между патологиями Aβ и tau и их воздействием на патогенез AD по-прежнему вызывает споры. Биохимические исследования по курсу и схеме распределения их патологий предполагают независимые, но синергетические эффекты [49]. Некоторые авторы полагают, что AD является тауопатией, вызванной дисфункцией APP [50], и которая связывает либо антецедные бляшки, либо — менее вероятно — независимо друг от друга [51]. Другие считают, что увеличение образования и осаждения Aβ, вызванное дисбабаболизмом APP, которое обычно происходит в нейронах и синапсах [52, 53], вызывает раннее патологическое фосфорилирование тау путем активации каспаз, ключевых ферментов в конечном каскаде запрограммированной гибели клеток, индуцируя образование NFT [54]. Активность каспазы-6, которая расщепляет тау на аминокислотах 402 и 13, была обнаружена в случаях легкой и тяжелой AD [55], особенно в энторинальной коре при отсутствии бляшек и клубок, что указывает на то, что она активируется в качестве исходного участка, пораженного в AD , что приводит к нейродегенерации и воспалению. Недавние разработки предполагают, что аксональный перенос APP влияет на осаждение Aβ и APOE ɛ4 влияет как на аксоновское фосфорилирование тау, так и на патологию, вызванную амилоидом, что связывает патогенные механизмы Aβ, tau и APOE ɛ [56]. «Альтернативная» гипотеза амилоидного каскада предполагает, что отложение амилоида не является исходной причиной AD, но является следствием других процессов, таких как нарушения в белках, регулирующих клеточный цикл, окислительный стресс, дисфункцию митохондрий с нарушением энергетического метаболизма нейронов [ 57-60] и может представлять собой нейропротективную реакцию [61, 62]. Другая альтернативная интерпретация гипотезы амилоида предполагала, что накопления внутримышечных Aβ-пептидов могут влиять на функции самого APP и сборку PSEN 1, nicastrin и других комплексов [63], в то время как другая новая гипотеза о токсичности Aβ получает некоторую поддержку в отношении ее эффектов на функциях ионного канала [64]. Однако из-за отклонения результатов в моделях мышиных мышей AD [17, 65] в настоящее время полностью не признан точный ход молекулярного каскада, приводящий к нейродегенерации в AD (рис.2), и окончательный патологический каскад, ведущий к смерти нейронов. Различные этиологические факторы, которые могут быть активными в развитии AD-патологии, могут привести к некоторым распространенным патогенным патогенам, которые в конечном счете предшествуют заболеванию, но дальнейшие обширные фундаментальные исследования, в том числе использование моделей на животных, оправданы [66].

Sporadic AD является медленно прогрессирующим расстройством с коварным началом и продолжительностью около 10-12 лет. Его диагноз и дифференциация от других расстройств деменции сложны и только на довольно прогрессирующих стадиях заболевания, когда память и другие когнитивные расстройства достаточно суровы, чтобы иметь значительное влияние на повседневную жизнь пациента, точность диагностики при использовании всех в настоящее время доступные тесты составляют около 90%. До патологического диагноза только «возможный» или «вероятный» диагноз заболевания может быть сделан с использованием текущих критериев [67-70]. Определенный диагноз АД возможен только при гистопатологическом обнаружении его характерных изменений, накоплении внеклеточного агрегированного Аβ в бляшках и церебральной сосудистой сети (церебральной амилоидной ангиопатии / САА) и внутриклеточного и нейритического осаждения гиперфосфорилированного тау-белка (NFTs , нейропильные нити и нейритные бляшки), связанные с потерей синапсов и нейронов в определенных областях мозга и потерей нейрональной связи как одной из основных причин деменции (см. [71, 72]). Хотя большинство этих изменений неспецифичны, они представляют собой основные морфологические маркеры AD, (полу) количественная оценка которых лежит в основе существующих морфологических критериев для диагностики AD: CERAD [73], Braak & Braak и Национальный институт по проблемам старения — Институт Рейгана (NIA-RI), объединяющий стадии CERAD и Braak [74], которые дали хорошие корреляции между клиническими данными и патологическими данными между AD и бездомным контролем [72]. Степень деменции обычно значительно коррелирует с плотностью и распространением тау-патологии, в то время как она показывает только слабые корреляции с числом старческих бляшек, но лучше всего на общую нагрузку растворимого Аβ (см. [72, 75]).

Исследования аутопсии показывают, что патология клубочковой таинственности впервые появляется в медиально-базальной височной доле, особенно в (транс) энторинальной коре, прогрессирующей через гиппокамп в области изокортикальной ассоциации с окончательным участием подкорковых ядер [76, 77]. Эта картина распределения коррелирует с ранним ухудшением памяти из-за прерывания «перфорантного пути» GABAergic, который связывает гиппокамп с другими областями мозга, тем самым изолируя гиппокамп от входящих и исходящих раздражителей. Скорее стереотипное развитие тау-патологии отличается от фаз амилоидного осаждения, обычно начинающегося в неокортексе, с участием антерограда allocortex в области, которые принимают нейронные проекции уже вовлеченных областей [78].

Ожидается, что нейродегенерация в AD начнется через 20-30 лет до начала клинического периода, в течение которого доклиническая фазовая налет и увеличение нагрузки клубка и при определенном пороге появляются первые симптомы [1, 72]. Эта клиническая фаза обычно называется «умеренным когнитивным расстройством» (MCI), в ходе которой субъекты имеют измеримый когнитивный дефицит, но которые недостаточны для выполнения критериев для любого конкретного заболевания деменцией [79, 80]. Было высказано предположение о том, что он представляет собой переходный этап между нормальным старением и AD, но данные показывают, что многие пациенты с амнистическим MCI имеют ранние нейропатологические изменения AD, включая синаптические потери гиппокампа, и, таким образом, представляют ранний AD [81-83], но во многих случаях с CDR 0.5 показаны различные патологии, не ограниченные AD [84-86]. Хотя некоторые из этих пациентов могут оставаться стабильными или даже улучшаться, многие из них обращаются в AD с годовым коэффициентом конверсии до клинической деменции 10-19% [87, 88]. Доклинический АД обычно проявляет более тяжелую невритовую патологию, чем «нормальное» старение с переменными интенсивностями тау и амилоидной биохимии. Сочетание клинических, нейропсихологических и визуализационных методов дифференцировало различные подтипы MCI [89-92], которые, однако, не выявили значительных различий в их годовой конверсионной скорости к деменции [88].

Биомаркеры должны улучшать диагностическую чувствительность и специфичность и контролировать биологическую активность AD с точки зрения нагрузки на нейрональную активность и темпа прогрессирования заболевания. Ввиду продвижения научных знаний о биомаркерах для AD / MCI было предложено включить эти биомаркеры в пересмотренные диагностические критерии в будущем [91-93]. Биомаркеры вначале будут дополнять наши более традиционные нейропсихологические и визуализирующие маркеры и могут перейти к полезным суррогатным признакам к фармакологическому действию анти-деменции [94-100].

Сенильные бляшки в мозге AD в основном состоят из Aβ-42, тогда как CAA в основном содержит Aβ-40 [101, 102]. В человеческих существах обнаружена обратная зависимость между амилоидной нагрузкой in vivo и уровнями CSF Aβ-42 [103]. CSF пациентов с АД даже на ранних стадиях заболевания демонстрирует снижение значений Aβ-42 и вместе с увеличением общего tau (tTau) или фосфорилированного тау (pTau), свидетельствует о наличии когнитивных дисфункций даже у здоровых пожилых людей [104, 105 ]; Коэффициент CSF tau / Aβ-42 — это предсказание когнитивного спада у взрослых бездомных [106-110] и с MCI [110-113]. Вместе с медиальной атрофией височной доли на МРТ [114-118] или ФДГ-ПЭТ [119] и наличием аллеля APOE ɛ4 эти маркеры предсказывают слабоумие при умеренных когнитивных нарушениях или более высокий риск развития AD [83, 89, 120] как rCBF-SPECT [121] и церебральная гипоперфузия, индуцированная fMRI [122] и плазмой Aβ-42, медиальной височной атрофией и гомоцистеином [123]. Сообщалось, что уровни антагониста CSF Aβ-42, tTau и pTau-Thr231 отражают гистопатологические изменения, наблюдаемые посмертно в мозге случаев AD [124, 125]. Уровни CSF тау заметно увеличены у пациентов с диффузным аксональным повреждением при травмах головы, которые возвращаются к клиническому улучшению [126]. Таким образом, основная часть доказательств подтверждает, что CSF отражает состояние метаболизма белков мозга; Уровни CSF токсичных продуктов конечной конечной гликировки (TAGE) также могут помочь в раннем выявлении AD [127]. В настоящее время комбинация повышенных белков CSF tTau или pTau и низких CSF Aβ-42 являются единственными биомаркерами с достаточной чувствительностью и специфичностью, которые служат полезными диагностическими биомаркерами, способными отличать AD от других деменций на ранних стадиях [96, 128-136 ], Пациентов с Деменцией (PDD) у пациентов без [137] и DLB [138], в то время как уровни serpin CSF не улучшали диагностическую классификацию AD по сравнению с DLB [139]. Они являются возможными маркерами для тяжести и обилия симптомов в AD [71, 105, 140-144] (таблица 1). Другие исследования показали, что значительное повышение уровня и активности BACE 1 в CSF является показателем MCI или других нейроиммунных маркеров, указывающих AD [145, 146]. В то время как прогрессирующее увеличение концентраций tTau CSF было обнаружено с ранних и поздних этапов AD [147], было показано, что растворимый Aβ-42 не связан со степенью когнитивных нарушений [140] и Aβ-42/40, но не Только Aβ-42 коррелирует с pTau у пациентов с низкой и высокой нагрузкой на CSF Aβ-40 [148]. Недавние продольные исследования показали, что уровни CSF Aβ-42 и tTau, но не pTau у треонина 181, со временем увеличивались в группе пациентов с клиникой памяти с сопоставимыми изменениями во всех диагностических группах. Однако различие в поперечном сечении между диагностическими группами значительно превышало продольные изменения у индивидуумов, что указывает на то, что эти биомаркеры не чувствительны в качестве маркеров прогрессирования заболевания [149]. Каузальные отношения между прохождением нагрузки Aβ и плотностью бляшек в головном мозге и восстановлением CSF Aβ до конца не поняты, но они объясняются истощением мономерного белка в олигомерные растворимые и нерастворимые формы в головном мозге и увеличением отложения Aβ в бляшках [94 ]. Возраст и АПОЕ ɛ4 аллельное ускорение патогенного отложения головного мозга Aβ-42, начинающегося в позднем среднем возрасте у лиц с нормальным познанием, приводят к снижению CSF Aβ-42, но не к концентрации Aβ-40 [150], тогда как уровни CSF Aβ-40 при лобно-височной деменции (FTD) уменьшены [151], а флуктуации уровней CSF Aβ обнаружены у отдельных субъектов [152]. Уровни ApoE в CSF коррелируют с тау и 24S-гидроксихолестерином у пациентов с когнитивными расстройствами [153, 154]. Экстремальные уровни CSF Aβ идентифицируют семейные мутации eoAD и loAD PSEN1 и, таким образом, могут быть полезными эндофенотипами для генетического AD [155], а также для детей с синдромом Дауна [156], но обратные отношения между нагрузкой на изображение амилоида in vivo в мозге человека и CSF Aβ-42 были найдены [103].

Хорошо документированные маркеры CSF при деменции [69, 103, 142]

Специфичность (SP) = определенно отрицательная / (определенно отрицательная + неправильная положительная)

Чувствительность (ST) = определенно положительная / (определенно положительная + неправильная)

Недавно были рассмотрены аспекты Aβ в качестве биомаркера для AD [25], а также вариабельные образцы CSF Aβ между синуклеинопатиями и тауопатиями [157] или другими нейродегенеративными деменциями [158, 159]. В то время как в начальных исследованиях предполагалось, что белок CSF pTau коррелирует с неокортикальной нейрофибриллярной патологией у пациентов с тяжелой деменцией AD и может служить в качестве суррогатного маркера патологии клубочковой тау как in vivo [125], другие недавние исследования не показали ассоциации биомаркеров CSF (Aβ-42, t- и pTau) с APOE ɛ4, налетом бляшки и клубка в подтвержденном вскрытием AD [160, 161]. Увеличение CSF tau наблюдается также при других нарушениях ЦНС с потерей нейронов (дегенеративными, воспалительными, сосудистыми, опухолями), с самыми высокими концентрациями тау в CSF при болезни Крейтцфельдта-Якоба (CJD) и мозговых инфарктов, причем первая проявляет диссоциацию между tTau и pTau [ 162], в то время как AD и AD + CVD показывают аналогичный нейрохимический фенотип с увеличенным тау и уменьшением Aβ-42 с некоторым перекрытием между AD и VaD, причем последний показывает снижение CSF Aβ-38/40 [158, 163], так как а также в плазме [164]. Было также предложено использовать пептиды CSF Aβ для различения DLB, PDD, AD и FTD [158, 165]. У относительно молодых пациентов с деменцией уровни белка нейрофиламента CSF могут играть определенную роль в дискриминации между УТД и ранним началом AD, особенно в сочетании с анализом Aβ-42 и pTau [166]. Антимикробные антитела CSF также являются предположительным маркером продолжающегося воспалительного процесса в AD [167]. Однако, поскольку большинство исследований, оценивающих биомаркеры, сравниваются только с клиническими, а не патологическими диагнозами, следует более подробно изучить концепцию суррогатных маркеров in vivo. Для оценки того, будут ли Аβ-40 и Аβ-42 применяться в качестве нейрохимических маркеров деменции, потребуется повторная оценка с использованием иммунопреципитированных образцов CSF невропатологически определенных нарушений деменции. Сравнительная протеомика CSF, обнаруживающая большое количество неизвестных ранее белков в аутопсийном подтвержденном AD и бездомных пожилых пациентах, может предоставить дополнительные средства для диагностики и оценки AD с 90% -ной чувствительностью и 83% -ной специфичностью [129, 168-175] и различают различные дегенеративные деменции [176]. Предварительные исследования показали, что редокс-реактивные антитела в CSF могут представлять ценные биомаркеры для диагностики AD [177].

Общее количество амилоида плазмы или Aβ-42 увеличивается в случаях семейного AD и трисомии 21 [178, 179], но не всегда были связаны с диагнозом в клинических исследованиях поперечного сечения типичного позднего AD [178, 180-185 ].

Повышенные уровни Aβ-42, низкие уровни Aβ-40 и уменьшенное соотношение Aβ-42 / Aβ-40 в плазме старых субъектов указывают на конверсию когнитивной нормальности в MCI или AD [186-188] и были обнаружены в гериатрическая депрессия [189]. Другие, однако, обнаружили, что снижение уровней плазмы Aβ-42 может быть маркером статуса AD, в частности перехода от нормального состояния или MCI к AD [190], а не маркера нейродегенеративных процессов, происходящих в этой болезни [191] , Из-за высокой внутри- и межличностной изменчивости уровней Aβ в сыворотке и плазме [192] уровни Aβ-40 и Aβ-42 в плазме не являются надежными коррелятами гистологически или биохимически оцениваемых амилоидных нагрузок в головном мозге и происхождением плазмы Aβ до конца не понят [193]. Уровни плазмы Aβ, вероятно, модулируются периферическим и мозговым метаболизмом и клиренсом, а также транспортом через мозг, CSF и сосудистые клетки. Хотя все формы головного мозга Aβ повышены в AD, слабые корреляции различных показателей Aβ мозга в AD предполагают, что они могут отражать различные биохимические и морфологические пулы Aβ [194]. Нормальное равновесие между CSF и плазмой Aβ может быть нарушено с началом осаждения Aβ в мозге [195], но уровни плазмы и CSF Aβ не коррелированы в AD [196], а уровни Aβ-42 в плазме значительно зависят от сопутствующих лекарства [197], в частности, путем лечения инсулином [198]. Поэтому не является неожиданным, что уровни Аβ в плазме и головном мозге не сильно коррелируют. Снижение CSF и плазмы Aβ наблюдалось при церебральной амилоидной ангиопатии (CAA), амиотрофическом боковом склерозе и деменции с телами Льюиса (DLB), а в CJD наблюдалась диссоциация Aβ-пептидов в CSF [199]. Измерение CSF tau вместе с сывороточным сердечным жирным кислотным связывающим белком (CH-FARP) с CSF tau может представлять маркерные кандидаты для дифференциации между AD и DLB [200]. Общепризнано, что только уровни Аβ-42 в плазме, по-видимому, не являются надежными биомаркерами для MCI и AD [123, 183, 201], в то время как снижение отношения пептидов Aβ-38 / -40 плазмы считается основанным на крови биомаркер для сосудистой деменции, его диагностическая точность, напоминающая точность маркеров CSF для AD [164]. Кроме того, маркеры воспаления крови, такие как CRP, интерлейкин-6 и т. Д., Являются маркерами для VaD [164, 202] или увеличены до клинического начала как AD, так и VaD [203], тогда как другие воспалительные молекулы связаны с прогрессией AD [ 204]. Если плазма Aβ является фактором риска развития АД, как это предлагается несколькими продольными когортными исследованиями, то соответствующие уровни Aβ могут наблюдаться за 5-20 лет до смерти [187, 205]. Более того, изменения в плазме Aβ-42 могут быть биохимическим предиктором эффективности лечения ривастигмином [206]. Протеомический анализ плазмы выявил более высокие концентрации α-1-антитрипсина и аполипопротеина J у пациентов с АД [207]. Недавнее протеомическое обнаружение различных белков, передающих плазму, может позволить разработать простой, экономически эффективный тест для AD [208, 209].

Показано, что плазмидный гомоцистеин непосредственно связан с уровнями Aβ-40, тогда как связь с Aβ-42 не является значимой, предполагая, что гомоцистеин связан со старением, но не специфически с AD, но он может взаимодействовать, чтобы влиять на риск и познание AD в PD [210, 211]. В последнее время было показано, что некоторые биомаркеры плазменной сыворотки на основе протеома являются специфическими для AD и коррелируют с тяжести заболевания, хотя для повышения чувствительности и специфичности необходимы альтернативные анализы [212, 213].

Среди изменений тромбоцитов крови были высказаны аномалии APP для прогнозирования превращения MCI в слабоумие AD типа [214, 215] и были коррелированы с текучестью мембраны и когнитивным снижением [216]. Повышенная активность BACE-1 в AD [217] и увеличение экспрессии моноаминоксидазы B в тромбоцитах крови — и в мозге — сумасшедших пациентов с AD и PD были неоднократно подтверждены [218-220]. Недавно повышенная активность тромбоцитов фосфолипазы А2 была обнаружена у пациентов с AD, VaD и ишемическим инсультом [221].

Значение структурных биомаркеров, основанных на MRI для AD, недавно рассмотрено [222, 223]. Медиальная атрофия височной доли (MTA) на МРТ чувствительна к первичной дегенеративной атрофии гиппокампа у старых субъектов, но не специфична для патологии AD, умеренный показатель MTA не часто ассоциируется с деменцией [224], а для MCI [225]. Уровень повышенного ПЭТ-амилоидного лиганда (11C) PIB у пациентов с MCI / легкой AD указывает на ранний процесс AD [226-229], даже у лиц без сутенера [230]. В то время как анализ CBF-SPECT, CMRgl-PET (метаболизм глюкозы), протонная спектроскопия (H-1 MRS), функциональная МРТ с высокой полевой напряженностью, морфометрия на основе воксела, увеличивали активацию медиаобластной височной доли, обнаруженной fMRI, (R) — [(11) C] PK11195 ПЭТ для обнаружения микроглии и других функциональных методов нейровизуализации, в частности, комбинированной PiB-визуализации и структурной МРТ, используются в качестве чувствительных маркеров для преобразования MCI в раннее AD [121, 231-241]. То же самое верно для ускоренных темпов атрофии гиппокампа и ApoE ɛ4 [114], FDG-PET [242], обнаружения подкорковых гиперинтенсивностей [243-245] и МРТ-структур атрофии серого вещества [246]. Однако относительно нормальный метаболизм глюкозы при наличии высокой лобной амилоидной нагрузки предполагает, что образование амилоидного бляшка не может быть непосредственно ответственным за нейроновую дисфункцию в этом расстройстве [247].

Недавний обзор невропатологической основы МР-определенных церебральных поражений показал, что присутствие лакунов и WMLs является хорошим сигналом для VaD, тогда как атрофия коры и гиппокампа при старении и деменции сложна с несколькими процессами, сходящимися на аналогичных мозговых структурах, которые опосредуют когнитивные снижение [248].

Недавно на хромосоме 21 в области APP был обнаружен новый неизвестный до настоящего времени белок Aβ, выраженный у пожилых пациентов с диагнозом вероятного AD. Этот белок, ALZAS (ALZheimer ASsociated protein) с 79 аминокислотной последовательностью содержит фрагмент Aβ-42, трансмембранный сигнал AP и уникальный c-терминал с 12 аминокислотами, который отсутствует ни в одном известном аллеле APP [249 -252]. В отличие от теоретических вариантов сплайсинга, он имеет исходный кодон в экзоне 16, а его кодирующая последовательность заканчивается интроном 17 (фиг.3). Обратная транскрипция ПЦР выявила экспрессию транскрипта этого белка в областях мозга коры головного мозга и гиппокампа, а также в лимфоцитах пациентов с АД [249-251, 253, 254]. Используя методы клонирования, была выяснена генетическая структура ALZAS [255].

Схема структуры гена ALZAS (A), мРНК (B) и белка в области гена APP (C) на хромосоме 21. APP TM = трансмембранная область.

Регулирование доступа α- и β-секретаз к APP и ALZAS, по-видимому, имеет важное значение с учетом недавних исследований CSF, что прямо свидетельствует о том, что Aβ-фрагменты (усеченные Aβ 1-16, 1-33, 1-39 и 1- 42) в CSF различают спорадический АД от необдуманных контролей с общей точностью 86% [141]. Вывод о том, что Aβ 1-16 является наиболее распространенным пептидом, может указывать на то, что ALZAS с его предсказанной β-спиральной структурой может быть субстратом для α-секретазы [171, 253]. Более того, он может действовать как молекулярный шаперон, который связывает APP и помогает изменить его конформацию. ALZAS, как специфический белок Aβ, может конкурировать или даже конкурировать с APP для трансмембранного транзитного сайта APP в конкретных нейронах, параллельно с интранурональным нейротоксическим накоплением Aβ [250] и активирующими фосфолипазами, что приводит к продолжающемуся разрушению мембраны и синаптическому разрушению в AD (фиг.4) [256]. В настоящее время мало что известно о процессе, в котором такие пептиды, как Aβ, ALZAS или прионы, могут вызывать изменения в фенотипах нейронов и активации микроглии [257].

Гипотетическое конкурирующее действие ALZAS с трансмембранным APP.

Экспериментальные исследования в сыворотке пациентов с вероятным AD выявили до десятикратного увеличения титров антител ALZAS, направленных против неамилоидозного C-конца этого белка. Исследования сывороточного ELISA показали самые высокие титры на ранних стадиях заболевания, то есть у пациентов с предсимптоматическим AD или MCI, но умеренно увеличились титры в полностью развитой и подтвержденной аутопсией AD. Низкие или необнаруживаемые анти-tt 12 титры были обнаружены у здоровых возрастных субъектов или молодых органов управления (рис.5). Максимальные значения были обнаружены в сыворотках пациентов старше 65 лет, у которых был диагностирован «депрессивный» без распознаваемых нарушений познания. Следует подчеркнуть, что депрессия распространена на ранних стадиях AD (до 87%) и связана со значительной заболеваемостью [258-261]. Повышенные гиппокампальные клубочки и бляшки у пациентов с AD и пожизненная история большой депрессии свидетельствуют о взаимодействии между обоими расстройствами [262].

Исследования ELISA образцов плазмы EDTA (разведение 1:20, предварительная инкубация 4 часа, мочевина 1 М при 37 ° C). Обнаружение антител ALZAS IgG у восьми пациентов с АД и семь контролей (сигнал: оптическая плотность / OD / 492-620 нм).

Внутриранговое осаждение белка ALZAS было продемонстрировано в срезах мозга лобной коры головного мозга и гиппокампе у пациентов с аутопсией, доказавших AD, с использованием куриного антитела, очищенного с помощью высокоаффинной хроматографии, тогда как контрольные образцы были отрицательными (фиг.6). Уилкоксонская статистика внутринейронального и капиллярного иммуноощущения ALZAS показала значительную корреляцию с этапами Braak и классификацией NIA-Рейгана AD (рис. 6A и B). Девять случаев (30%) были отрицательными АЛЗАС, у одного (3,3%) было обнаружено положительное отрицательное капиллярное украшение ALZAS, но отрицательное капиллярное украшение, в то время как положительное нейронное и капиллярное декорирование присутствовало в 20 случаях (66,7%). В постмортном мозге AD иммунореактивность ALZAS была расположена внутриклеточно в нейронах и во внутренних сосудистых мембранах (фиг.6В и С).

Иммуноокрашивание белка ALZAS в ткани головного мозга человека с интранурональными отложениями в лобной коре (A) и капиллярным иммуноокрашиванием (B). Распространение внутрижелудочного и внутрикапиллярного окрашивания ALZAS в лобной коре пациентов с АД достоверно коррелирует с нейритической стадией Брэка (C, D).

Чтобы дополнительно проверить постулированный белок ALZAS, ALZAS-мРНК, выделенную из человеческого постмортного мозга AD, амплифицировали и секвенировали с использованием праймеров из областей гена ALZAS из лобной коры головного мозга AD и контролируемых возрастом контролей. Экспрессию мРНК ALZAS исследовали с помощью qRT-PCR. Полученная последовательность коррелировала с постулированной последовательностью mRNS APP-экзонов 16 и 17, а также частями соседних интронов APP I 15 и 17 [253].

Первоначальная количественная оценка мРНК ALZAS в разных тканях с использованием RT-PCR показала, что ALZAs транскрибируется во всех исследованных тканях (лимфоцитах, коре головного мозга), но предварительная оценка результатов не выявила существенных различий в показателях транскрипции между пациентами AD и здоровыми управления. Кроме того, исследования клеточной культуры с использованием мышиных эмбриональных стволовых клеток, которые содержали трансген жирных кислот, который включал кальцитонин-реагирующий промотор, показали, что экспрессию ALZAS инициировали добавлением кальцитонина к культуре. В культивируемых стволовых клетках трансгенных мышей ALZAS находили в нейронных плазматических мембранах дифференцирующих эмбриональных ES-клеток. Внутриполональная иммунопроницаемость кортикальных отделов головного мозга AD с Aβ-специфическим антителом 4G8 показала сходное украшение нейронов, как в трансгенных стволовых клетках мыши (фиг.7). Более того, ген ALZAS клонировали в индуцибельном экспрессирующем векторе для дальнейшей трансфекции в клетках нейробластомы человека (SH-SY5Y) [253].

Белок ALZAS экспрессируется в трансгенных стволовых клетках мыши (A) и интраневронно в лобной коре пациента AD человека (B). Aβ-специфическое 4G8 иммуноокрашивание.

Несмотря на увеличение титров антител ALZAS у пациентов с АД, транскрипция в исследуемых тканях пациентов с АД и контрольной группы кажется сходной, и между тканями существуют только некоторые различия, с самой высокой транскрипцией и самыми низкими различиями транскрипции между АЛЗАС и АПП в крови. До сих пор роль АЛЗАС в клеточном метаболизме носит весьма спекулятивный характер. Дальнейшие исследования должны уточнить, являются ли ALZAS per se или во взаимодействии с его «более крупным братом» Aβ-42, приводит к известным нарушениям метаболизма и агрегации белка в мозге AD. Кроме того, неизвестно, какой тип и степень выраженности экспрессии ALZAS необходимо, какие клетки преимущественно участвуют и какими механизмами индуцируется патогенная экспрессия ALZAS у пациентов с АД. Клонирование области промотора ALZAS в экспрессионном векторе может позволить нам найти факторы транскрипции, которые избирательно влияют на экспрессию гена и, вероятно, могут спровоцировать патогенез AD. Индивидуальные данные в исследованных до сих пор зондах крови и сравнение последовательностей промоторной области могут указывать на вероятные гормональные реакции.

Плазма пациентов с АД по сравнению с контролируемым возрастом здоровым контролем содержит повышенную концентрацию антител ALZAS, что может быть подтверждено повторными исследованиями [255]. Используя ELZAS-Capture фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), были обнаружены специфические IgG-антитела, которые исключительно направлены против С-конца, кодированного в интрон-области APP. Предварительные данные также показали увеличение пептида ALZAS, возможно, действующего как аутоантиген, в сыворотке поздних стадий AD (фиг.8B). Тем не менее, различие между AD и другими нарушениями деменции, такими как сосудистые деменции, должно быть исследовано в ходе дальнейших исследований. Значительное повышение уровня IgG сыворотки ALZAS было обнаружено у пациентов с ранними стадиями деменции, у которых результаты нейропсихологических испытаний все еще превышали пороговые уровни деменции. Даже у пациентов с МСИ, которые позднее развивали ДЭ, отмечалось повышение уровня АЛЗАС на базовом уровне. Это может быть интересно для ранней диагностики AD и может быть ценным знаком для раннего лечения. Однако существует значительная изменчивость специфичности и чувствительности белка ALZAS в зависимости от сравниваемых групп, статистических методов и предельных значений [253, 254]. Кроме того, необходимо учитывать влияние возраста, которое в настоящее время изучается.

Исследования ELISA образцов плазмы EDTA для обнаружения IgA против ALZAS выявили повышенные уровни у пациентов с МРЖП (n = 19) и, что менее выражено, у пациентов с деменцией AD (n = 38) по сравнению с молодыми и пожилыми контролами (A). В плазме пациентов с МРП наблюдается лишь незначительное увеличение белка ALZAS, но более выраженное при ДД слабоумия (В).

Прогресс в нашем понимании молекулярной патологии и патогенеза AD и его связи с старением головного мозга оказали клинически значимые успехи в развитии биомаркеров, основанных на методах биохимии и нейровизуализации. Они должны обладать потенциалом для обеспечения эффективных мер ранней диагностики, биологической ацитивности, результатов заболевания и указания суррогатных конечных точек для их клинического использования в диагностических и доклинических целях и для контроля лечения. Поскольку большинство клинических критериев не имеют специфики, особенно на ранних стадиях заболевания, и большинство исследований связано с маркерными значениями с клиническими критериями и только очень редко с невропатологическими диагнозами, цитируемые чувствительности и особенности для предполагаемых биомаркеров трудно интерпретировать. В настоящее время лучшие проверенные биомаркеры CSF, pTau и Aβ-42, с сообщенной чувствительностью и специфичностью около 90% для диагностики AD, показывают по крайней мере некоторые, если нестабильные, корреляции с церебральным тау и патологией Aβ [125, 130, 160 , 161]. В качестве биомаркеров в плазме было исследовано несколько веществ, например. изопростан, 3-нитротирозин, α-1-антихимотрипсин, интерлейкины, C-реактивный белок, комплементарные системы C1q, 24S-гидрохолестерин, гомоцистеин, но ни один из этих маркеров не обладал достаточной чувствительностью или специфичностью для диагностики AD [100, 134]. То же самое верно и для пептидов Aβ в сыворотке, которые не отражают нагрузку Aβ в головном мозге. Хотя в сочетании с МРТ-исследованиями медиаобластной височной доли они могут указывать на превращение когнитивных нормальных старших в MCI или AD [123], но только они не являются надежными биомаркерами для AD. В будущем оценка аутоантител в сыворотке, сывороточных тромбоцитах и ​​лимфоцитах против Aβ и RAGE (рецептор для конечных конечных продуктов гликирования) проявляется все более интересными [122, 123, 263, 264] и может указывать на тесные отношения между AD и аутоиммунными расстройствами [265].

Считается, что хроническое воспаление с активацией микроглии играет центральную роль в патогенезе поражений центральной нервной системы у пациентов с AD или рассеянным склерозом (MS). В AD в пораженной коре присутствует активная активация микроглии [266]. Клетки Microglia, активированные in vitro при AD-подобных условиях, такие как добавление пептида Aβ к культуральной среде, продуцируют различные провоспалительные и токсичные цитокины и медиаторы [267-269]. Было высказано предположение, что такие токсические факторы усиливают или способствуют отложению амилоидов и дегенерации нейронов [270-272]. Напротив, активная иммунизация или пассивная передача специфических антител против Aβ-пептида уменьшают амилоидные отложения в tg-моделях AD и у пациентов [273]. Считается, что клетки Microglia и астроциты играют важную роль в очистке отложений Aβ [274-277]. Это может происходить и в экспериментальных моделях даже в простейшем случае без участия специфических адаптивных иммунных реакций против Aβ [41].

Хотя МС давно считается демиелинизирующим заболеванием белого вещества, обширная кортикальная демиелинизация была показана как характерный признак патологии прогрессирующей МС [278, 279]. На этом этапе глубокие воспалительные инфильтраты, составленные Т-лимфоцитами Т и В в мозговых оболочках, связаны с сильной активацией микроглии в коре и образованием широко распространенных субпиальных полосовых демиелинизированных поражений [280-282]. Клетки микроглии, активированные в мозге МС, также продуцируют провоспалительные цитокины и токсические факторы, которые способствуют демиелинизации и аксональным поражениям [283]. В какой степени хроническое воспаление в коре головного мозга пациентов, влияющих на развитие очагов поражения, до сих пор не разрешено.

Недавнее исследование случаев аутопсии МС, AD и сопоставимых по возрасту средств контроля показало глубокую активацию микроглии как в костях МС, так и в AD с аналогичными образцами. Но активация микроглии в коре МС в отличие от АД и контролей коррелирует с инфильтрацией лимфоцитов и плазматических клеток в мозговые оболочки. У старых пациентов с РС наблюдалась AD-патология со сравнимой частотой, как в процессе нормального старения, а плотность бляшек Aβ и NFT не различалась между демиелинированными и не-демиелинированными кортикальными областями. Эти данные свидетельствуют о том, что неспецифическая активация микроглии в коре MS, которая была описана для снижения нагрузки Aβ у экспериментальных животных, сенсибилизированных только сополимером I или адъювантом [41], практически не вмешивается в развитие патологии коры головного мозга [ 284], и не играет существенной роли в клиренсе Aβ у людей, если не присутствуют специфические антитела Aβ [275].

Последовательность аминокислот ct-12 (c-терминальная последовательность, вызывающая иммунный ответ), которая распознает эндогенные антитела ALZAS, может преобразовывать вовлеченные клетки в мишени микроглиальных клеток в ткани головного мозга, которые индуцируют процессы иммунного каскада и нейровоспаления как побочные эффекты AD. В связи с этим обсуждается связывание ALZAS с рецептором RAGE, действующее как коэффициент усиления и активации микроглии. RAGE распознает вещества, которые образуются во время хронических и связанных с возрастом расстройств, включая Aβ [264]. В последних исследованиях показано, что превращение MCI в AD деменции связано с воспалительными процессами [285]. Активация микроглии в AD, по-видимому, обусловлена ​​врожденным иммунитетом [286-288]. CD14-зависимый воспалительный ответ на олигомеры Aβ обеспечивает основу для гипотезы структурной мимики между агрегированными, высокогидрофобными амилоидогенными белками и биофизически подобными патоген-ассоциированными микроглиальными узорами, способствующими хроническому нейровоспалению и нейродегенерации [289], что предлагается быть следствием нарушения микроглазии и дезактивации [290]. Пептид ALZAS представляет собой дополнительный источник Aβ, авто-антиген из-за его уникальной аминокислотной последовательности (ct-12) и предсказан как патоген, который может индуцировать как воспаление, так и нейродегенерацию. Вклад возрастной потери микроглиальных нейропротекторных функций в патогенез AD [286, 291] остается правдоподобным вариантом. ALZAS как индуцируемый ген может быть «недостающим звеном» в поиске причин AD (таблица 2 — [271]). Так как пептид ALZAS, такой как APP, содержит трансмембранный сигнал и, следовательно, согласуется с APP для осаждения в клеточную мембрану, он может иметь отношение к мембранной дисфункции и нарушениям переноса аксонов в AD. Хотя клинические и патологические эффекты активной иммунотерапии AD с синтетическим Aβ-42 хорошо известны на животных моделях [273, 292], было сделано мало сообщений о невропатологических данных у пациентов, которые получили иммунотерапию Aβ-42 [274, 293 -299]. Эти данные включают в себя различные степени сокращения бремени бляшки амилоида, но сохранение тау патологии и ВГА. Лимфоцитарная инфильтрация, характерная для менингоэнцефалита [295, 296], не наблюдалась во всех случаях [297, 300], в то время как другие проявляли минимальные эффекты при уменьшении бляшек Aβ, но тяжелой ВГА с кровоизлияниями в мозг [301, 302].

Предлагаемая роль ALZAS в патогенезе и возможном лечении болезни Альцгеймера

Белок ALZAS, который был обнаружен в плазме как на ранней, так и на поздней стадии AD, представляет собой индикатор динамического равновесия между периферическими и дегенеративными изменениями головного мозга, обеспечивая тем самым надежный и простой диагностический маркер AD простым, неинвазивный анализ крови. Дальнейшие исследования оправданы, чтобы подтвердить диагностическую чувствительность и чувствительность тестов сыворотки ALZAS ELISA по сравнению с другими в настоящее время используемыми и будущими биомаркерами в будущих клинико-патологических исследованиях.

Авторы благодарны медицинскому персоналу многих венских больниц за клинические и вскрышные отчеты и материал мозга в качестве основы настоящего исследования. Мы благодарны г-же Веронике Раппельсбергер и г-же Барбаре Вайдингер за отличную лабораторную работу и г-ну Эриху Миттер-Ферстлю, доктору философии, за компьютерную и графическую работу. Часть исследования была поддержана Обществом поддержки исследований в области экспериментальной неврологии в Вене, Австрия.

источник

Владельцы патента RU 2687272:

Изобретение относится к способу диагностики риска развития болезни Альцгеймера или наличия тяжелой AD у субъекта и может быть применено в медицине. Предложенные способы включают измерение в биологическом образце субъекта уровня по меньшей пяти биомаркеров AD, выбранных из нейротрофического фактора из тканей мозга (BDNF), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), фактора роста опухоли бета-1 (TGF-бета 1), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), интерлейкина 18 (IL-18) и моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1), причем повышение IL-18 и MCP-1 и снижение BDNF, IGF-1, VEGF и TGF-бета 1 в сравнении с контролем указывает на наличие или риск развития AD, а повышение IL-18 и VEGF и снижение BDNF, IGF-1, MCP-1 и TGF-бета 1 в сравнении с контролем указывает на наличие тяжелой AD. Предложены новые высокоспецифичные способы и применения указанных биомаркеров, позволяющие проводить дифференциальную диагностику между наличием или риском развития AD и тяжелой AD. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 пр., 5 табл., 2 ил.

Настоящее изобретение относится, в первом аспекте, к способу для диагностирования или для определения риска развития болезни Альцгеймера, или для определения наличия тяжелой болезни Альцгеймера у субъекта, в соответствии с которым измеряется комбинация, по меньшей мере, четырех специфичных биомаркеров. Кроме того, предоставляется набор, а также комплект, содержащий средства обнаружения, в частности, антитела, по меньшей мере, для четырех специфичных биомаркеров. Кроме того, также предоставляется компьютерный программный продукт и реализуемый компьютером способ для диагностирования или определения риска развития болезни Альцгеймера или для определения наличия тяжелой болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессирующим заболеванием мозга с огромной ценой в отношении человеческих жизней. Негативное воздействие заболевания также представляет растущее беспокойство для правительств развивающихся стран, в особенности из-за все более возрастающих высоких количеств пожилых граждан, находящихся в опасности. Болезнь Альцгеймера является наиболее распространенной формой деменции, общего термина для потери памяти и других нарушений когнитивных функций. Обычно, деменция включает форму сосудистой деменции и дегенеративной деменции, включая деменцию болезни Альцгеймера или деменцию Альцгеймера. Различные типы деменции описаны как амилоидопатия (деменция Альцгеймера), таупатия (болезнь телец Леви, болезнь Кройцфельда-Якоба, синдром Пика) и синуклеопатия (болезнь Паркинсона).

Самым большим фактором риска для деменции является возраст. Люди, имеющие возраст выше 85, имеют большую вероятность испытать данное состояние, хотя некоторые формы деменции встречаются у людей моложе 50. Некоторые индивиды являются генетически более склонными к развитию определенных форм деменции, таких как болезни Хантингтона и Альцгеймера. Дополнительно, несколько факторов могут вызывать временную или постоянную деменцию, такие как травмы головного мозга (включая повреждения, вызванные инсультом), неправильное питание, инфекции, реакция на медикаменты, отравление, опухоль или поражение головного мозга.

Болезнь Альцгеймера представляет собой хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, и оно является самым распространенным типом деменции. Текущие диагностические средства, включая методы нейровизуализации, непрерывно улучшаются. Однако, все еще представляет сложность повышение чувствительности и специфичности диагностики болезни Альцгеймера. Две области диагностики являются особенно сложными: во-первых, дифференцирование ранних стадий болезни Альцгеймера от умеренного нарушения когнитивных функций и нормального старения; и, во-вторых, повышение специфичности диагностики, особенно, когда аналогичные клинические симптомы являются общими для различных типов деменции. До настоящего времени, анализ бета-амилоида (1-42), суммарного тау и фосфо-тау-181 в цереброспинальной жидкости (CSF) являлись наилучшими биологическими маркерами для диагностики болезни Альцгеймера и ее дифференцирования от других форм деменции с высокой надежностью и достоверностью. В работе Marksteiner J. и соавт. (Drugs Today 43(6):423-31, 2007) приведен обзор применения биомаркеров CSF и предполагаемых относящихся к крови маркеров. Предполагается, что на риск умеренного нарушения когнитивных функций оказывают влияние изменения гена тау-белка, и что умеренное нарушение когнитивных функций имеет общий генетический фон с болезнью Альцгеймера. Это может помочь объяснению генетического риска в отношении снижения когнитивных способностей и разработке эффективных клинических испытаний. В работе Welge V. и соавт. (J. Neural. Transm. 116(2):203-12, 2009) сообщается, что для цереброспинальной жидкости (CSF) отношение концентраций Abeta1-42/Abeta1-38/p-tau хорошо разделяет пациентов с болезнью Альцгеймера (AD) и с деменцией, не относящейся к болезни Альцгеймера, и выполняет требования по точности для применяемого скрининга и биомаркера AD для дифференциальной диагностики.

Ассоциация болезни Альцгеймера предоставляет семь стадий течения заболевания, а именно, 1: отсутствие нарушения, 2 очень умеренное снижение (ранняя стадия), 3 умеренное снижение, 4 среднее снижение, 5 среднее тяжелое снижение, 6 тяжелое снижение и 7 очень тяжелое снижение.

Раннее обнаружение нейродегенеративных нарушений позволило бы более эффективно лечить пациентов. Недавние исследования продемонстрировали, что такие нарушения, как болезнь Альцгеймера, характеризуются предсимптоматической фазой, которая, вероятно, продолжается годы, в течение которых происходит разрушение нервных клеток, но до появления клинических симптомов. Это представляет собой и проблему — каким образом идентифицировать индивидов в течение этого преклинического периода — и возможность. Профилактическая терапия могла бы быть начата в течение преклинического периода до появления симптомов болезни. Поэтому, главная цель клинического исследования состоит в улучшении ранней диагностики этих заболеваний посредством разработки инструментов для смещения постановки диагноза на более раннее время в течение процесса нейродегенерации. Кроме того, ранняя идентификация индивидов, подвергающихся риску развития болезни Альцгеймера (AD), является чрезвычайно необходимой. В технике описано, что профилактика и лечение AD, а также задержка конечного прогрессирования AD, являются более эффективными у пациентов при раннем обнаружении указанного нейродегенеративного нарушения.

Агрегированный бета-амилоидный пептид (Abeta) вовлечен в патологию болезни Альцгеймера. Данные агрегации были обнаружены in vitro и в естественных условиях во множестве морфологий, включая шаровидные олигомеры и линейные фибриллы, которые обладают различными биологическими активностями. Диагностика и контроль спорадической болезни Альцгеймера (AD) долго зависели от клинического изучения индивидов с терминальной стадией заболевания. Однако, будущие способы лечения AD оптимально начинать, когда индивиды демонстрируют очень умеренные признаки нейродегенерации. В настоящее время бета амилоид цереброспинальной жидкости (Abeta) становится основным согласованным биомаркером для стадии умеренных когнитивных нарушений AD. Abeta непосредственно вовлечен в патогенез AD или имеет высокую корреляцию с другими основными патогенными факторами. Он продуцируется из белка-предшественника амилоида (APP) посредством протеолитической обработки, которая зависит от фермента 1, расщепляющего бета-участок APP, и комплекса гамма-секретазы, и разлагается широким диапазоном протеаз.

Формы из 40 и 42 аминокислотных остатков бета амилоида (Abeta (1-40) и Abeta (1-42)) в цереброспинальной жидкости (CSF) были предложены в качестве потенциальных биомаркеров болезни Альцгеймера (AD). Количественные анализы пептидов Abeta в CSF полагались почти исключительно на применение основанных на иммуносорбенте исследований, таких как процедура твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Однако, из-за способности пептидов Abeta к легкой агрегации или связыванию с другими белками и стеклянной посудой, такие анализы являются очень сложными. Анализы дополнительно усложняются способностью пептидов подвергаться посттрансляционным модификациям и возможностью для перекрестной реакции в анализах ELISA с эндогенными компонентами CSF. Недавно полученные результаты позволяют предположить, что сниженное количество Abeta (1-42) в относительно Abeta (1-40) в плазме может повышать риск AD (Hampel H. и соавт., Alzheimers Dement. 4(1):38-48, 2008).

Фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа) представляет собой многофункциональный провоспалительный цитокин, который принадлежит к суперсемейству факторов некроза опухоли (TNF). Этот цитокин секретируется, главным образом, макрофагами. Он вовлечен в регуляцию широкого спектра биологических процессов, включая пролиферацию, дифференцирование, апоптоз клеток, метаболизм липидов и коагуляцию. Этот цитокин был вовлечен во множество заболеваний, включая аутоиммунные заболевания, резистентность к инсулину и рак. Исследования на нокаутных мышах также позволяют предположить нейропротекторную функцию этого цитокина.

Концепция воспаления как главного фактора болезни Альцгеймера (AD) до настоящего времени была основана на результатах посмертных исследований аутодеструктивных изменений, ассоциированных с поражениями, а также на эпидемиологических свидетельствах защитного эффекта противовоспалительных средств. Теперь имеется доказательство того, что на риск AD оказывает существенно влияние суммарно 10 полиморфизмов в воспалительных агентах интерлeйкине 1 альфа, интерлeйкине 1 бета, интерлeйкине 6, факторе некроза опухоли альфа, альфа(2)-макроглобулине и альфа(1)-антихимотрипсине. Все полиморфизмы являются обычными.

В WO 2005/052292 и WO 2006/133423 описаны способы и композиции для диагностики, стратификации и контроля AD и других неврологических расстройств в жидкостях организма. Например, EP 2211183 B1, разработанная на основе указанной выше заявки WO, идентифицирует способы для диагностики и контроля AD, в которых производится измерение связывающего инсулиноподобный фактор роста белка 2 (EGFBP-2) в качестве биомаркера. Указанная заявка на патент предоставляет большое количество возможных биомаркеров, которые, как утверждается, должны быть подходящими для диагностирования неврологических расстройств, включая AD. Однако, конкретное множество биомаркеров, позволяющее диагностировать и прогнозировать AD с высокой точностью, не раскрывается. Кроме того, в Thambisetty, N., и соавт., biomarkers and medicine, future medicine, London, Volume 4, No. 1, стр. 65-79, раскрываются основанные на крови биомаркеры AD: сложно, но возможно. WO 2009/149185 идентифицирует иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом и их применение.

Недавно полученные результаты позволяют предположить вовлечение нейротрофического фактора из тканей мозга (BDNF) в патогенез болезни Альцгеймера (AD). BDNF является эндогенным белком, вовлеченным в поддержание нейронной функции, синаптической пластичности и структурной целостности в мозге взрослых людей. Концентрации BDNF в сыворотке и цереброспинальной жидкости (CSF) оценивались посредством чувствительной ELISA в 27 AD пациентах по сравнению с 9 пациентами с нормотензивной гидроцефалией (NPH) и 28 соответствующими по возрасту здоровыми контролями. Значимое уменьшение концентрации BDNF в сыворотке пациентов с AD (18,6 нг/мл) и NPH (18,1 нг/мл) было обнаружено по сравнению со здоровыми контролями (21,3 нг/мл; p=0,041/p=0,017). Концентрации BDNF в сыворотке не коррелировали с уровнями CSF, возрастом или показателями краткой шкалы оценки психического статуса (MMSE) как у пациентов с AD, так и у пациентов с NPH. Уменьшение уровней BDNF в сыворотке при AD и NPH может отражать недостаток трофической поддержки и, таким образом, вносить вклад в прогрессирующую дегенерацию в обеих болезнях.

Хроническое воспаление является характеристикой болезни Альцгеймера (AD). Сообщалось о взаимодействии, ассоциированном с риском AD, между полиморфизмами в регуляторных областях генов для провоспалительного цитокина, интерлeйкина 6 (IL-6) и противовоспалительного цитокина, интерлeйкина 10 (IL-10). Нарушение регуляции IL-6 и IL-10 у некоторых пожилых людей, частично, вследствие генетической изменчивости в этих двух генах, может способствовать развитию AD (Cambarros O. и соавт., J. Neuroinflammation 23(6):22, 2009).

IL-6 (также называемый интерфероном бета 2) имеет сильно повышенный уровень при болезни Альцгеймера (AD) и имеет сильную корреляцию с другими заболеваниями, такими как диабет. IL-6 также имеет корреляции с другими нейродегенеративными заболеваниями и депрессией. Роль в болезни Альцгеймера (AD) также подозревается для интерлeйкинов IL-10, IL-18 и сосудистого эпидермального фактора роста (VEGF). В работе Malaguera L. и соавт. (Neuropathology 26(4):307-12, 2006) было определено, что уровни IL-18 были значительно повышены у больных AD и сосудистой деменцией по сравнению с не имеющими деменции соответствующими по возрасту субъектами.

В работе Mateo и соавт. (Acta Neurol. Scand. 116(1):56-8, 2007) описано, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) определяет важные нейротрофические и нейрозащитные действия. Низкие уровни VEGF в сыворотке ассоциированы с болезнью Альцгеймера.

Целостность нейропротекции является важным компонентом против развития когнитивных нарушений и AD. Группа пациентов с болезнью Альцгеймера демонстрировала в начале исследования сильное снижение уровня инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1) (3,7±1,2 пг/мл), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (63±18 пг/мл) и TGF-бета 1 (33±10 пг/мл) по сравнению со здоровыми пожилыми субъектами (IGF-1, 9,5±2,4 пг/мл; VEGF, 105±31 пг/мл; и TGF-бета 1, 68±18 пг/мл). Значимые положительные корреляции между IGF-1 и концентрациями VEGF были обнаружены как у здоровых субъектов (r=0,87, p 300 пг/мл

IL-18 повышение >200 пг/мл