Молекулярные основы болезни альцгеймера

Авторы работы:

Научный журнал:

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, том 41, № 2, с. 331-345

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

© 2007 г. А. П. Григоренко1′ 2, Е. И. Рогаев1′ 2*

1Научный центр психического здоровья Российской академии медицинских наук, Москва, 113152 Россия 2Brudnick Neuropsychiatrie Research Institute, Department of Psychiatry, University of Massachusetts

Medical School, 01604, MA, USA Поступила в редакцию и принята к печати 10.10.2006 г.

Изучение молекулярных основ патогенеза болезни Альцгеймера привело к двум главным открытиям. Во-первых, были обнаружены гены, мутации в которых являются причиной (пресенилины PS1 и PS2, АРР) или фактором риска (ApoE) этого нейродегенеративного заболевания головного мозга. Во-вторых, найден новый тип протеаз и обнаружены, по-видимому, универсальные для различных клеточных систем и организмов механизмы регуляции дифференцировки и развития, осуществляемые посредством внутримембранного протеолиза. Пресенилины в составе тетрабелкового комплекса (е-/у-секретаза) расщепляют трансмембранные белки типа I, а недавно открытые аспартат-ные протеазы IMPAS/SPP расщепляют трансмембранные белки типа II. Процессинг трансмембранных белков с помощью клеточных внутримембранных протеаз приводит к образованию сигнальных белков, факторов транскрипции и коротких гидрофобных пептидов (фрагментов трансмембранных доменов), которые могут иметь как физиологическую функцию, так и играть ключевую роль в патогенезе старения ф-амилоид при болезни Альцгеймера). В настоящее время известно около 160 мутаций в гене PS1, более 10 мутаций в гене PS2 и 21 мутация в гене АРР. Уже стала возможной доклиническая диагностика некоторых ранних форм болезни Альцгеймера. Так как патогенез ранних и поздних форм болезни Альцгеймера сходен, изучение механизмов протеолиза, регулируемого внутримембранными аспартатными протеазами, позволит разрабатывать лекарственные средства, непосредственно влияющие на регуляцию процессинга трансмембранных белков как на первопричину болезни Альцгеймера.

Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, пресенилины, АРР, IMP/IMPAS/SPP/SPPL, внутримембран-ный протеолиз.

MOLECULAR BASICS OF ALZHEIMER’S DISEASE, by A. P. Grigorenko12, E. I. Rogaev12* ^Research Center of Mental Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 113152 Russia; 2Brudnick Neuropsychiatrie Research Institute, Department of Psychiatry, University of Massachusetts Medical School, 01604, MA, US; *e-mail: Evgeny.Rogaev@umassmed.edu). Studies of molecular mechanisms for Alzheimer’s Disease have led to the two major achievements. First, genes with mutations causing Alzheimer’s Disease (prese-nilin genes PS1, PS2 and APP) or bearing a risk factor polymorphism (ApoE) for Alzheimer’s Disease were described. Second, the new type of proteases and mechanisms of regulation of cellular differentiation and development by processes of intramembrane proteolysis were identified. These mechanisms, apparently, are universal for various cell types and organisms. Presenilin is a catalytic component of tetra-protein complex (e-/y-secretase) cleaving type I transmembrane proteins. Other recently discovered aspartate proteases, IMPAS/SPP, cleave type II transmembrane proteins. Processing of transmembrane proteins by cellular intramembrane proteases results in production of signal peptides, transcriptional factors and short hydrophobic proteins (fragments of transmembrane domains), which may have a physiological function or play a key role in patogenic events associated with ageing (e.g., P-amyloid formation in Alzheimer’s Disease). To date approximately 160 mutations in PS1 gene, more than 10 mutations in PS2 gene and 21 mutations in APP gene were described. Early preclinical diagnostics of some early forms of Alzheimer’s Disease became possible. Since patogeneses of early and late onset forms of Alzheimer’s Disease are similar, identification of molecular or epigenetic factors affecting primary molecular mechanisms (intramembrane or membrane associated proteolysis) underlying the disease may ultimately contribute to development of rational therapy for Alzheimer’s Disease.

Key words: Alzheimer’s Disease, presenilins, APP, IMPAS, intramembrane proteolysis.

Принятые сокращения: БА — болезнь Альцгеймера; APP — предшественник ß-амилоида; PSEN/PS — пресенилин; APOE -аполипопротеин E; IMPAS/IMP — внутримембранная аспартатная протеаза; SPP — пептидаза сигнального пептида; ICD -внутриклеточный домен; AICD — внутриклеточный домен APP; NICD — внутриклеточный домен Notch; EGF — эпидермаль-ный фактор роста; NMDA — ^метил^-аспартат.

*Эл. почта: Evgeny.Rogaev@umassmed.edu

Деменции — прогрессирующая потеря памяти и интеллекта — представляют серьезную проблему для здравоохранения и социальной сферы в развитых странах. Наиболее распространенное в среднем и пожилом возрасте нейродегенератив-ное заболевание человека, болезнь Альцгеймера (БА), составляет 50-60% всех деменций.

В 2005 г. насчитывали 24.3 млн. больных БА. По последним оценкам за каждый год число больных БА возрастает на 4.6 млн. и к 2040 г. составит 81.1 млн. человек [1]. Рост заболеваемости связывают, прежде всего, с увеличением продолжительности жизни в развитых странах. Несмотря на то, что доля пожилых людей с деменцией в развивающихся странах ниже, чем в развитых, именно на развивающиеся страны приходится около 52% всех случаев деменции, что обусловлено, в первую очередь, высокой численностью населения в этих странах. В последнее время, благодаря использованию генетических подходов, удалось добиться прорыва в изучении БА.

КЛИНИЧЕСКИЕ И ГИСТОПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

Свое название БА получила по имени немецкого врача Алоиса Альцгеймера (Alois Alzheimer), впервые в 1906-1907 гг. описавшего совокупность гистопатологических признаков заболевания. История болезни Августы Д. (Auguste D.), которая в возрасте 51 года поступила в госпиталь для душевнобольных и больных эпилепсией во Франкфурте-на-Майне и наблюдалась там 4.5 года, послужила основой для доклада на конференции психиатров в Тюбингене 3 ноября 1906 г. и последующих публикаций 1907 г. Больная страдала прогрессирующей потерей памяти, нарушениями речи, движения, узнавания, непредсказуемым поведением, галлюцинациями. Патолого-ана-томический анализ выявил атрофию коры головного мозга и присутствие в кортексе характерных нейрональных бляшек (названных позже альцгеймеровскими, или сенильными), а также нарушение структуры нейрофибрилл (образование внутриклеточных нейрофибриллярных клубков). В 1910 г. впервые появился термин «Болезнь Альцгеймера» (БА), который ввел Эмиль Крэпе-лин (Emil Kraepelin). В настоящее время, согласно международным классификациям (МКБ-10, DSM-IV), различают раннюю (пресенильную) форму БА с началом до 65 лет, составляющую около 10% всех случаев БА, и позднюю (сенильную) форму, которая развивается после 65 лет. Заболевание Августы Д. относилось к первому типу, поэтому часто пресенильную деменцию называют истинной, или классической БА, а форму с поздним началом называют сенильной деменцией

альцгеймеровского типа. Кроме того, выделяют семейную и спорадическую БА.

Клинически БА начинается с ухудшения памяти о недавних событиях, трудностями в пространственной ориентации с прогрессирующим усилением симптомов деменции вплоть до полной потери способности к узнаванию, ориентировке в пространстве и времени, деградации интеллекта и памяти. После появления первых симптомов болезнь неуклонно развивается в течение 2-15 (20) лет. Смерть чаще всего наступает от пневмонии или общего истощения.

Основные гистопатологические признаки БА -накопление амилоидных сенильных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, сопровождаемое массовой гибелью нейронов в ряде структур головного мозга. Сенильные бляшки представляют собой нерастворимые сферические образования диаметром около 0.2 мм. Типичная бляшка состоит из центральной более плотной части, образованной в основном отложениями труднорастворимого ß-амилоида (Aß-пептида), продукта амилоидогенного протеолиза APP (белка-предшественника ß-амилоида), и окружена кольцом из дистрофичных нейритов. В состав амилоидных бляшек входят не только различные формы ß-амилоида, но и глюкозаминогликан (GAG), гепарансульфатпротеогликан (HSPG), амилоид P сыворотки (SAP), аполипопротеин E (APOE), а2-макроглобулин, а1-антихимотрипсин, факторы комплемента и др. [2]. Амилоидные бляшки часто окружают капилляры и более крупные сосуды и встречаются в основном в коре, а также в некоторых других структурах головного мозга. Нейрофибриллярные клубки находятся в нейронах в виде внутриклеточных конгломератов, состоящих, главным образом, из аномально фосфо-рилированного тау-белка — структурного белка микротрубочек.

БА поражает в первую очередь нервные клетки височной доли коры головного мозга и гиппо-кампа, ответственные за передачу информации и консолидацию памяти. Повреждаются также лобная доля, отвечающая за принятие решений, индивидуальность, движение, речь; теменная доля, контролирующая речь, тактильные, болевые, пространственные и температурные ощущения; и миндалина, отвечающая за эмоциональный контроль. Ранняя диагностика БА крайне затруднена, так как первые клинические признаки появляются через несколько лет после начала патологических процессов в головном мозге. БА необходимо отличать от других форм деменции, и, в первую очередь, от сосудистых деменций. Точный диагноз БА возможен только при гистопатологическом исследовании мозга (post mortem).

Рис. 1. Схема расщепления APP, различные пути протеолиза APP.

источник

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

240 руб. | 75 грн. | 3,75 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Автореферат — 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Гольдгабер Дмитрий Янкелевич. Молекулярные основы болезни Альцгеймера : Дис. . д-ра биол. наук : 03.00.03 : Москва, 2003 89 c. РГБ ОД, 71:04-3/133

1. Общее описание болезни 8

1.1 Первый случай. История развития исследований 8

1.2 Клиническая картина 10

1.3 Патологические изменения мозга 11

1.5.1 АРР — предшественник амилоида 13

1.5.2 Пресенилин 1 ипресенилин2 14

2 Результаты и их обсуждение 18

1. Клонирование и картирование гена АРР 18

2. Внутриклеточные процессы 21

2.1 Экспрессия и гиперэкспрессия АРР 21

2.2 Регуляция экспрессии АРР 24

2.3 Процессирование АРР 27

2.4 Локализация пресенилина и его роль в адгезии клеток 32

2.5 АРР и убиквитин-протеосомная система деградации белков 36

2.6 Митотический нуклеолин в НФК 41

2.6.1 Антигеном TG-3 является митотический нуклеолин 42

2.6.2 Фосфорилирование нуклеолина киназой p34Cdc2 создаёт зпитопТв-З 44

2.6.3 Временные и пространственные изменения нуклеолина в митозе 46

2.6.4 Два вида нуклеолина в митотических клетках 48

2.6.5 Распределение нуклеолина в мозге при болезни Альцгеймера 49

2.6.6 Присутствие митотического нуклеолина в НФК 52

3. Внеклеточные процессы 54

3.1 Взаимодействие Ар пептида и апоЕ 54

3.1.1 Аполипопротеин Е є4 является фактором риска Б А 55

3.1.2 апо ЕЗ и апо Е4 по-разному взаимодействуют с А5 пептидом 57

3.1.3 Зависимость количества амилоида от изоформы апоЕ 59

3.2 Секвестрирование А5 пептида 60

3.2.1 Транстиретин-основной секвестрирующий белок 62

3.2.2. Влияние НСПВЛ на уровень ТТР 65

3.2.3. Влияние интерлейкинов 1 и 6 на уровень ТТР 66

4. Природа генетических форм прионовых заболеваний 67

4.1 Сходство между болезнью Альцгеймера и прионовыми заболеваниями 67

4.2 Заболевание Кройцфельдта-Якоба и мутации в гене PRNP 69

4.3 Болезнь Герстмана-Стройслера-Шейнкера и мутация в гене PRNP 70

Болезнь Альцгеймера является основной причиной слабоумия у пожилых людей и проявляется как прогрессирующая нейродегенерация мозга. Основными патологическими изменениями при этой болезни являются межклеточные отложения амилоида в мозгу и внутринейронные накопления фибриллярных клубков, преимущественно в коре головного мозга и гиппокампе. Постепенная и прогрессирующая потеря памяти и главных функций интеллекта у больных обычно начинает проявляться примерно с 65 лет. Болезнь прогрессирует в течение многих лет и в итоге приводит к прекращению основных функций мозга и полному распаду личности. Лечения в настоящее время нет и болезнь неизбежно кончается смертью. В редких случаях болезнь возникает в более раннем возрасте и иногда носит семейный характер. Однако, около 85% случаев являются спорадическими и представляют собой так называемую позднюю форму болезни. Начиная с 65 лет количество случаев удваивается каждые пять лет, и около 50% людей, доживших до 85-90 лет, заболевают болезнью Альцгеймера. С увеличением продолжительности жизни в экономически развитых странах количество больных возрастает экспоненциально и уже исчисляется миллионами. Стоимость ухода за больными, с учетом потерянного рабочего времени членов семьи, исчисляется в сотнях миллиардов долларов. Болезнь Альцгеймера представляет собой не только личную трагедию семьи, но уже начинает превращаться в общенациональный кризис во всех экономически развитых странах мира. С улучшением уровня жизни в странах с активно развивающейся экономикой продолжительность жизни населения увеличивается и с ней увеличивается количество больных болезнью Альцгеймера. Таким образом, болезнь Альцгеймера переступила границы экономически развитых стран и становится глобальной медицинской проблемой человечества XXI века.

Хотя болезнь была впервые описана в 1906 году, причины заболевания были неизвестны и долгое время подозревалось, что старческое слабоумие является результатом естественного старения организма. Только в середине 60-х годов было показано, что амилоидные отложения и внутринейронные фибриллярные сгустки являются характерными изменениями мозга, присущими

именно больным болезнью Альцгеймера. Однако, ответов на вопросы о причинах и природе заболевания и о процессах, ведущих к характерной патологии мозга, не было, как не было и ответа на вопрос почему у больных синдромом Дауна, явно генетической детской болезнью, к 30-40 годам развиваются характерные патологические изменения мозга, идентичные изменениям, наблюдаемым у больных болезнью Альцгеймера.

Целями данной работы являлось выяснение причин, вызывающих болезнь Альцгеймера, и изучение молекулярных процессов, ведущих к характерным патологическим изменениям мозга больных.

Все научные результаты полученные в работе являются оригинальными. В частности, был клонирован ген АРР, кодирующий 4 кДа Ар пептид, основной компонент амилоидных отложений. Обнаружено, что Ар пептид является фрагментом большого белка АРР — предшественника амилоида (amyloid precursor protein). Ген АРР был картирован на хромосоме 21. Таким образом, была объяснена причина идентичности характерных патологических изменений в мозгу больных с синдромом Дауна и больных болезнью Альцгеймера. Предсказано, что перепроизводство Ар пептида является основой патологии болезни Альцгеймера. Показано, что в мозгу экспрессия гена АРР носит сложный региональный характер. Обнаружено, что по сравнению с контролем, у больных уровень мРНК АРР в мозгу повышен. Показано, что у гена АРР сложная траскрипционная структура и синтезируются три изоформы белка, АРР695, АРР751 и АРР770. Идентифицированы ключевые элементы промотора АРР, отвечающие за базовую и модулируемую активность гена.

Показано, что белок АРР подвергается протеолитическому расщеплению. Показано, что пресенилин, участвующий в процессировании АРР, находится на поверхности клеток и участвует в межклеточной адгезии.

Обнаружено, что АРР деградируется убиквитин-протеосомной системой и что АР пептид блокирует деградацию белков, связываясь с внутренними активными центрами протеосом.

Показано, что Ар пептид взаимодействует с АРР и с аполипопротеином Е (апоЕ), причем взаимодействие с изоформами апоЕ4 и апоЕЗ различны.

Исследована корреляция между изоформами ароЕ и болезнью

Альцгеймера и показана ассоциация аллели апоЕ4 с поздней превалирующей формой болезни. Показано, что наличие аллели апоЕ4 ассоциировано с увеличением количества амилоида в мозгу больных.

Постулирована гипотеза секвестрирования А(3 пептида и найден главный секвестрирующий белок — преальбумин (transthyretin — ТТР). Показано, что ТТР предотвращает образование амилоида. Определена ключевая аминокислота ТТР, ответственная за взаимодействие ТТР с Ар пептидом. Показано, что нестероидные противовоспалительные лекарства, которые способствуют предотвращению болезни Альцгеймера, повышают уровень ТТР.

Исследования внутринейронных нейрофибриллярных клубков (НФК) привело к открытию особой митотической формы фосфолирированного нуклеолина в цитоплазме нейронов гипокампа больных болезнью Альцгеймера. Идентифицирован уникальный эпитоп этой формы нуклеолина и показано, что стерически он идентичен эпитопу белка тау, главного компонента НФК.

В дополнение, открыта первая мутация в сходном с болезнью Альцгеймера нейродегенеративном заболевании — болезни Кройцфельдта-Якоба и, таким образом, доказана генетическая основа этой болезни. Кроме того, открыта первая мутация, вызывающая другое также сходное с болезнью Альцгеймера заболевание, синдром Герстманна-Страуслера-Шейнкера. Обе мутации обнаружены в гене приона ПРНП (предшественника нормального приона). Дополнительные мутации этого гена, приводящие к изменению числа повторов в белке приона, также были открыты в случае болезни Кройцфельдта-Якоба.

В последних стадиях болезни часто наблюдается полное отсутствие аппетита и многие больные умирают от голода. Болезнь неизбежно кончается смертью. При вскрытии обычно наблюдают атрофию коры головного мозга и классические гистологические поражения в гипокампе, энторальном кортексе, амигдале и в некоторых подкорковых зонах, проектирующих в эти пораженные районы мозга. Во многих нейронах находятся патологические структуры, напоминающие спутанные волокна, так называемые нейрофибриллярные клубки (НФК). Эти клубки представляют собой спирально скрученные филаменты, состоящие в основном из гиперфосфорилированного белка тау. Амилоидные бляшки представляют собой внеклеточные компактные сферические отложения, состоящие из 8 нм фибрилл Ар пептида, которые часто окружены дистрофическими дендритами и аксонами. Поражения такового вида называют нейритными бляшками. Однако, при типичной БА, только часть всех амилоидных отложений Ар пептида имеют такую морфологию. Гораздо больше бляшек, которые которые имеют аморфную, штриховую или грубо сферическую форму. Такие отложения амилоида, называемые диффузными бляшками, содержат АР пептиды в различных стадиях аггрегации и количество 8 нм амилоидных фибрилл в них незначительно. Предполагается, что диффузные бляшки постепенно переходят в нейритные. Электронномикроскопический анализ показал, что большинство диффузных бляшек содержат очень мало дистрофичных нейритов. Похоже, локальное накопление не фибриллярных форм Ар пептида не вызывает сколь либо значимого изменения нейропила.

В дополнение к амилоидным бляшкам различной морфологии, амилоидные отложения находят в менингиальных кровеносных микрососудах, содержащих фибриллярный АР пептид в базальной мембране. В некоторых случаях такой васкулярный амилоидоз принимает особо тяжёлые формы. Хотя сущуствуют значительные вариации в количестве и качестве бляшек и НФК у разных больных БА, нейропатология болезни сравнительно стандартна. Существование чётко определённой и относительно специфической патологии явилось важной причиной того, что значительный прогресс был достигнут в понимании патогенеза БА в течении последних двух десятилетий. Информация о сложных клеточных и молекулярных изменений в процессе развития болезни постепенно возникала из всё более детального анализа композиционного содержания двух основнных патологических поражений мозга больных Б А — амилоидных отложений и НФК. В настоящее время БА поражает более 4 миллионов только в США (население 250 миллионов) и с подбной же частотой встречается в других развитых и развивающихся странах. Расходы, связанные с БА, только в США достигают 85 милиардов долларов в год. БА является самой распространённой причиной деменции. Около 50% всех случаев деменции пожилых людей вызываются Б А. Около 1% 60-летних болеет Б А. Количество больных удваивается каждые 5 лет и к 90 годам около 50% людей заболевают БА (Hebert et al. 1995). Факторами риска являются возраст, наличие случаев БА среди кровных родственников, головные травмы, низкий образовательный уровень и женский пол. Быстро изменяющаяся демографическая ситуация в мире, приводящая к увеличению продолжительности жизни, означает что количество больных БА будет расти. Так, число американцев старше 65 лет почти удвоилось с 16,6 миллионов в 1960 году до 31 миллиона в 1990 году.

Ожидается, что быстро растущее число пожилых и старых людей в США удвоится к 2030 году. Почти 79 миллионов американцев будут старше 65 лет к 2050 году и частота заболеваемости Б А к тому времени достигнет 14 миллионов в год. Распространение БА в других странах с развитой экономикой сходно с распространением в США, а в Голландии БА официально объявлена болезнью угрожающей нации. Эти данные свидетельствуют о том, что Б А является чрезвычайно серьёзной социальной и экономической медицинской проблемой стран с развитой и быстро развивающейся экономикой, в которых явно прослеживается тенденция к увеличению продолжительности жизни. БА условно разделяют на две группы — с ранним и с поздним началом заболевания, принимая 65 лет как точку разделения. Заболевания с ранним началом (ранняя форма — РФБА) обычно являются семейными, тогда как заболевания с поздним началом болезни (поздняя форма — ПФБА) обычно являются спорадическими. Подавляющее число случаев БА представлены поздней формой. Долгое время считалось, что генетика не играет никакой роли в БА. Однако, клонирование гена АРР в 1986 году автором этой диссертационной работы совместно с его коллегами, заложило основу современного генетического подхода к БА. Приблизительно 1-5% всех случаев Б А являются чисто генетическими с автосомно доминантной формой передачи болезни по наследству (St.George

Размер мРНК АРР, кодирущей три изоформы белка, определённый методом Норзерн-гибридизации, равнялся 3,2-2,4 килобаз. Анализ мРНК гена АРР показал, что ген экспрессирован во всех главных органах, включая мозг, однако уровень экспрессии зависел от ткани и в печени был еле заметен. Нейроанатомический анализ распределения мРНК в клетках мозга был проведен методом гибридизации in situ используя РНК-зонды, меченные либо радиоактивной серой 35S , либо биотином. Были исследованы районы коры головного мозга и гиппокампа, которые больше всего поражаются болезнью Альцгеймера, и мозжечок, который обычно не поражается (Рис. 2). Для сравнения использовали мозговые ткани больных болезнью Альцгеймера, контролей без деменции (Рис. 2-1, 2-2, 2-4) и обезьян Масаса fascicularis (Рис. 2 3). Биотинилированные зонды использовались для более тонкой дифференциации морфологии клеток мозга и для полуколичественного определения мРНК АРР (Рис. 2-1, 2-2). Радиоактивные зонды были использованы для регистрации мРНК в различных слоях и зонах мозга и для сравнительного определения количества мРНК АРР (Рис. 2-3, 2-4). Было обнаружено, что АРР экспрессирован во многих, но не во всех клетка мозга. В основном мРНК АРР была определена в нейронах.. Интересно, что в гиппокампе и кортексе, т.е. в районах мозга, которые сильнее всего поражаются болезнью Альцгеймера, уровень мРНК АРР был высокий (Рис. 2-2, 2-3, 2-4). Положительные сигналы были также зарегистрированы в клетках микроглии, эндотелиальных клетках кровеносных сосудов мозга и в перицитах. Значительное количество мРНК АРР часто обнаруживали в больших пирамидальных нейронах с нейрофибриллярными клубками. Экспрессия АРР носила региональный характер. Качественной разницы в распределении мРНК АРР в мозге больных болезнью

Альцгеймера и контрольных больных без деменции не было, как не было и разницы в экспрессии АРР в мозгу человека и обезьян. Однако, количество мРНК АРР в различных районах и слоях мозга сильно варьировало. Высокий уровень был обнаружен в гиппокампе и в базальном ядре Мейнерта, в визуальном, фронтальном и префронтальном кортексах. С другой стороны, в большинстве клеток мозжечка, стволового мозга и спинного мозга уровень экспрессии гена АРР был низок. Внутри каждого исследованного района мозга уровень мРНК АРР также варьировал. Так, в гипокампе высокий сигнал был обнаружен в полях СА1 и САЗ, тогда как количество мРНК АРР было низким в соседних районах, таких как субикулум, парасубикулум и в энторальном кортексе. Наиболее интересная разница в количестве мРНК АРР была обнаружена при сравнении и анализе радиоактивных сигналов секций мозга больных болезнью Альцгеймера и соответствующих контролей без деменции. У контролей количество мРНК АРР в нейронах dentate gyrus и полей cornu Ammonis было в 2.5 раза больше, чем в нейронах субикулума и энторального кортекса (Рис. 2-4). У больных количество мРНК АРР в этих районах было одинаково. В районах гиппокампа разница была настолько значительна, что она была явно заметна даже при использовании биотинилированных зондов, которые обычно применяются для качественного анализа результатов гибридизации (Рис. 2-2). Таким образом, нами было обнаружено, что при болезни Альцгеймера в определённых субпопуляциях нейронов регуляция гена АРР изменена и приводит к его гиперэкспрессии. Материалы и методы использовавшиеся для получения представленных результатов были подробно описаны в работах автора (Bahmanyar et al., 1987; Higgins et al., 1987; Lewis et al., 1987; Schmechel et al., 1988; Goldgaber abd Schmechel, 1989; 1990). Первые анализы экспрессии гена АРР в культурах клеток показали, что количество определяемой мРНК АРР зависит от ряда факторов. В частности, уровень мРНК резко падал в клетках образовавших монослой, позволяя предположить, что контактное торможение может играть значительную роль в регуляции экспрессии гена АРР. Мы обнаружели, что целый ряд биологически активных модуляторов влияют на экспрессию гена АРР. Пожалуй наиболее интересным было открытие гиперэкспрессии АРР в результате стимулирования транскрипции гена АРР интерлейкином 1 (ИЛ-1). Важность этого наблюдения была связана с тем, что количество ИЛ-1 в мозгу больных болезнью Альцгеймера значительно повышено. Так как ИЛ-1 является характерным показателем воспаления, можно предположить, что процессы, подобные воспалительным, играют важную роль в патологии болезни Альцгеймера. Однако, связь ИЛ-1 с патологическими процессами болезни Альцгеймера была не ясна. Анализ последовательности промотора гена АРР (Salbaum et al., 1988) показал, что в промоторе есть два элемента АР-1, которые могут объяснить стимуляцию экспрессии гена АРР ИЛ-1. Для картирования элемента, действительно ответственного за влияние ИЛ-1, различные фрагменты промотора были соединены с геном-репортёром, кодирующим человеческий ростовой гормон (ЧГР). Клетки мышиной нейробластомы АВ-1 были трансфецированы рекомбинантными плазмидами, содержащими различные фрагменты промотора. Количество ЧГР, секретированного в среду, было определено радиоиммуным методом.

Анализ результатов показал, что участок промотора АРР, отвечающего на стимуляцию ИЛ-1, находится между нуклеотидами -485 и -305. В этой зоне промотора находится только один элемент АР-1, который, по-видимому, и является элементом ответственным за стимуляцию уровня транскрипции гена АРР ИЛ-1 (Рис. ЗА, В). Для определения элементов, ответственных за базовую экспрессию гена АРР, был проведен анализ последовательных делеций его промотора. Различные делеционные фрагменты промотора были помещены в 5 -положении к репортёру, гену хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CAT), и полученные плазмиды были трансфецированы в различные культуры клеток. Измерение транзиентной ферментативной активности CAT позволило оценить активность промотора количественно. Оказалось, что для базовой экспрессии АРР необходим участок промотора длиной в 94 оснований от старта транскрипции. Анализ делеций проксимального района промотора АРР показал наличие двух элементов, АРВа (от -55 до -31) и АРВр (от -93 до -82), отвечающих за базовую экспрессию гена (Рис. ЗС). Два ядерных фактора, связывающихся с этими элементами, были охарактеризованы методами сдвига в электрофорезе, ДНКазным футпринтингом и интерференцией метилирования. Исследования ядерных экстрактов показали, что с элементом АРВа связывается гетеромер, состоящий из двух термостабильных транскрипционных факторов — белков USF43 и USF44, которые являются членами семейства белков bHLH (basic helix-loop-helix). Однако, для высокого уровня экспрессии АРР в клетках HeLa и PC-12 абсолютно необходимым является элемент АРВ(5, который отвечает примерно за 70% базовой активности промотора. Последующие эксперименты показали, что хорошо известный траскрипционный фактор CTCF, содержащий 11 цинковых пальцев, связывается с АРВр элементом (Vostrov et al., 1997). Таким образом, нами были определены два основных базовых элемента и первый модулирующий элемент промотора, ответственного за гиперэкспрессию АРР. Материалы и методы использовавшиеся для получения представленных результатов были подробно описаны в работах автора (Goldgaber et al., 1989; Quitschke and Goldgaber, 1992; 1995; Vostrov et al., 1995).

Целый ряд сообщений указывает на реактивацию клеточного цикла впостмитотических нейронах в мозгу больных БА. Высказывалисьпредположения, что такая патологическая реактивация может служить основной причиной нейрофибриллярной дегенерации типичной для Б A (Busser et al., 1998; Liu et al., 1995; McShea et al., 1997 ; Nagy et al. 1997; Vincent et al., 1995; Vincent et al., 1997). Было показано, что киназа p34Cdc2 активирована в нейронах мозга больных Б A (Vincent et al., 1997). Более того, используя иммунолокализацию, другие маркеры клеточного цикла тоже были найдены в нейронах мозга больных БА (Busser et al., 1998; McShea et al., 1997 ; Nagy et al. 1997). Аберации в активации митотических механизмов в постмитотических нейронах может начать серию клеточных событий приводящую к образованию НФК и нейродегенерации. Свидетельством того, что митотические механизмы вовлечены в образование НФК были получен тогда, когда моноклональныеантитела генерированные против иммунноочищенных препаратов НФК, оказались специфично не только при анализе срезов мозга больных БА, но и узнавали с высокой специфичностью иключительно митотические клетки в культурах (Vincent et al., 1996). В этой же работе было показано, что моноклональные антитела МРМ-2, генерированные против митотических клеток, специфично прокрашивали срезы мозга больных БА, но не реагировали со срезами мозга контролей. Более того, МРМ-2 узнавали НФК, нейритные компоненты амилоидных бляшек и морфологическинормальные нейроны, предполагая, что детектируется маркер ранних этапов дегенерации. Из всех моноклональных антител, описанных Винсент с коллегами, моноклональные антитела TG-3 были наиболее специфичны для нейрофибриллярной патологии БА при полной отсутствии сигнала в мозговых срезах контролей. Поэтому, идентификация антигена, узнаваемого этими антителами является абсолютно необходимым для понимания конвергенции нейрофибриллярной дегенерации и митоза. Первый иммунореактивный белок в мозгу больных БА, узнаваемый антителами TG-3, оказался гиперфосфолированный тау (Jicha et al., 1997). Однако другие TG-3 антигены определены не были. В культурах клеток, не экспрессирующих белок тау, антитела TG-3 детектировали белок размером в 105 кДа, который значительно больше тау (Vincent et al., 1996). Поэтому мы поставили задачу идентифицировать и характеризовать митотический клеточный белок, узнаваемый антителами TG-3.

Антиген TG-3 узнавал 105 кДа бэнд в экстрактах клеток линии НЕр2, которые были синхронизированы в митотической фазе обработкой нокодазолом (Рис 9В, дорожка 5). Этот бэнд также обнаруживался в экстрактах синхронизированных клеток MSN нейробластомы (Vincent et al., 1996) и клеток HeLa (данные не представлены). Появление этого бэнда не является артефактом обработки нокодазолом, так как, такой же бэнд был найден в экстрактах митозных клеток линии НЕр2, стряхнутых с матрасов (Рис. 9В, дорожка 3). Антиген TG-3 был очищен из синхронизированных нокодазолом клеток линииНЕр2 на хромотографической колонке и секвенирован, начиная с N-конца (Рис. 9А). Последовательность первых 18 аминокислот антигена TG-3 идентична N-концевой последовательности человеческого нуклеолина, белка с массой 105 Для того, чтобы исключить возможность того, что минорный белок того же размера, очищенный вместе нуклеолином, может включаться в иммунореактивность антигена TG-3, мы иммунопреципитировали лизаты клеток с моноклональными антителами MS3 к нуклеолину и анализировали иммунопреципитат с помощью TG-3. Был обнаружен бэнд массой 105 кДа, преципитировавший с антителами MS3 и выявлявшийся антителами к антигену TG-3 (Рис. 9В, дорожка 7). Эти результаты подтверждают нашу первоначальную гипотезу о том, что и антитела MS3 и антитела к антигену TG-3 узнают нуклеолин в митотических клетках.

Для дальнейшего подтверждения этой гипотезы очищенный белок, выделенный из синхронизированных нокодазолом клеток, был подвергнут химической деградации с либо N-хлоросукцинимидом, либо с гидроксиламином (Рис. 10). Каждый из этих реагентов химически расщепляет нуклеолин в двух местах, уникальных для каждого реагента. После расщепления образуются 3 фрагмента, два из которых узнаются антитела MS3 и антитела TG-3. Было обнаружено, что узнаваемые бэнды переходят в область 92 и 74 кДа после обработки N-хлоросукцинимидом (Рис. 10А) и гидроксиламином (Рис. 10В) соответственно. Необходимо отметить, что хотя нуклеолин содержит только 2сайта для каждого реагента, в наших экспериментальных условиях мы обнаружили продукты только одного акта расщепления. После каждой реакции деградации и антитела MS3 и антитела к TG-3 связывались с одинаковыми бэндами, позволяя предположить, что они связываются с одним и тем же фрагментом белка. Таким образом, принимая во внимание и результаты экспериментов по химической деградации, и результаты иммунопреципитации, можно сделать вывод о том, что антитела TG-3 действительно узнают нуклеолин в митотических клетках.мембрана была анализирована антителами TG-3 (дорожки 1, 2), тестирована ECL, антитела были убраны и мембраны были анализированы с помощью антителами MS3 (дорожки 3, 4). Контрольные пробы не содержали лизирующего соединения (дорожки 1,3).

Нуклеолин является одним из важнейших клеточных белков, содержащем в своем составе, по-видимому, 9 сайтов фосфорилирования для одной из основных киназ Cdc2. С(іс2-опосредованное фосфорилирование показано для нуклеолина как в экспериментах in vitro, так и in vivo (Belenguer et al., 1990) Предшествующие исследования продемонстрировали, что антитела TG-3 узнают фосфоэпитопы этого белка (Vincent et al., 1996; Jicha et al., 1997)

Так как антитела TG-3 узнают нуклеолин в митотических и не интерфазных клетках, следующие эксперименты были поставлены для того, чтобы проверить, является ли иммунореактивность TG-3 результатом фосфорилирования нуклеолина киназой cdc2. Интерфазный нуклеолин, не

Происхождение амилоида, явно патологического образования в мозговой ткани больных, являлось одним из центральных вопросов, стоявших перед исследователями болезни Альцгеймера. До клонирования гена АРР не было даже ясно, является ли амилоид продуктом человеческого генома. Клонирование гена АРР и его картирование его на хромосоме 21 ответило на этот фундаментальный вопрос. Однако, считая амилоид результатом патологического процесса, большинство исследователей также рассматривали и основной компонент амилоида, Ар пептид как продукт патологического процесса. Эта точка зрения была подкреплена обнаружением протеолитического расщепления АРР в альфа сайте, который находится внутри района АР пептида. Казалось, что нормальный процессинг АРР предотвращает появление полноценных молекул Ар пептида. Поэтому был сделан вывод, что генерация АР пептида должна происходить только патологическим путём. Однако два года спустя АР пептид был обнаружен в плазме и СМЖ не только больных болезнью Альцгеймера, но и здоровых людей (Seubert et al., 1992). Более того, оказалось, что любые клетки, которые синтезируют АРР, секретируют Ар пептид. Таким образом, стало ясно что Ар пептид появляется в результате нормального процессирования АРР и был найден Р сайт расщепления АРР. С другой стороны, уже было известно, что АР пептид токсичен для клеток и спонтанно образует амилоид. Так как у здоровых людей амилоида нет, эти наблюдения означали, что здоровый организм защищен от токсичности Ар пептида и что существует механизм, предотвращающий образование амилоида. Для того, чтобы объяснить эти процессы защиты, мы предложили гипотезу секвестрирования Ар пептида. Мы постулировали, что в норме Ар пептид всегда находится в комлексе с другими молекулами. Находящийся в комплексе АР пептид не токсичен и не способен образовывать амилоид.

Образование комплекса является механизмом регуляции билогической активности АР пептида и необходимым шагом его метаболизма, приводящего к выводу Ар пептида из организма. При болезни Альцгеймера механизм секвестрирования АР пептида нарушается, что и приводит к образованию амилоида и смерти клеток чувствительных к АР пептиду. (Goldgaber et al., 1993). Для того, чтобы идентифицировать молекулы, которые взаимодействуют и образуют комплексы с Ар пептидом, мы инкубировали образцы СМЖ, полученные от больных без деменции, с синтетическим А(540 пептидом, меченным радиоактивным иодом I с помощью реагента Болтона-Хантера. После инкубации проводили анализ с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН (Рис. 17-1). До инкубации радиоиодированный АР пептид агрегировал в физиологических растворах. Однако, после инкубации с СМЖ агрегации не было. Вместо этого электрофоретическое разделение позволило выявить два вида комплексов, имеющих электрофоретическую подвижность, соответствующую 30 кДа и 50 кДа. Эти комплексы отличались от 40 кДа комплексов апоЕ-Ар пептид, которые мы описали в предыдущей главе. Белки, образующие эти комплексы, были очищены, переварены трипсином и несколько образовавшихся пептидов были подвергнуты секвенированию. Анализ полученных последовательностей показал, что белок, образующий 30 кДа комплекс, являлся транстиретином (transthyretin — TTR). Белок, образующий 50 кДа комплекс, оказался альбумином. При инкубации с немеченным АР пептидом коммерческие препараты ТТР образовывали комплексы 30 кДа. Однако, коммерческие препараты альбумина не образовывали комплексов с немеченым Ар пептидом. При инкубации немеченного АР пептида с образцами СМЖ образовывались только 30 кДа комплексы. По-видимому, появление 50 кДа комплексов было связано со взаимодействием альбумина с модифицированным иодированием Ар пептидом. Флуорометрия в присутствии тиофлавина Т была использована для количественной оценки влияния ТТР на агрегацию Ар пептида. Результаты проведённых экспериментов убедительно показали, что ТТР снижает флуоресцентный сигнал, связанный с агрегацией Ар пептида (Рис. 17-2). Снижение сигнала было пропорционально количеству ТТР. В отличие от ТТР, присутствие альбумина не влияло на агрегацию Ар пептида. Агрегаты Ар пептида прокрашивали Конго Красным, который обычно используется для прокрашивания амилоида. При таком окрашивании амилоида образуется характерное жёлто-зелёное свечение в поляризованном свете. Добавление альбумина к препаратам Ар пептида не уменьшало это характерное свечение. Однако, добавление ТТР резко снижало количество агрегатов Ар пептида с характерным свечением. Другим характерным признаком амилоида является образование характерных фибриллярных структур, легко узнаваемых при электронной микроскопии.

Синтетический Ар пептид легко образует эти типичные амилоидные фибриллы толщиной в 5 и 10 нм. Однако, после инкубации АР пептида с ТТР мы наблюдали только аморфные массы с несколькими короткими фибриллами (Рис. 17-3). Таким образом, наши эксперименты убедительно показали, что ТТР является белком, секвестрирующим Ар пептид и предотвращающим образование амилоида. Для того, чтобы понять взаимодействие Ар пептида и ТТР мы построили модель комплекса. Модель комплекса позволила предсказать, что положительно заряженный район Ар пептида, содержащий аминокислоты Arg (5), His (13), Lys (16) и Lys (28), очень хорошо комплексуется с отрицательно заряженной поверхностью ТТР, содержащей аминокислоты Asp (38), Glu (42), Glu (62) и Glu (66). Последующий анализ делеционных и точечных мутантов ТТР показал, что глютамин 42 является критически важным для образования комплексов. Обнаружение секвестрирования Ар пептида и выявление ТТР как главного секвестрирующего белка в СМЖ, открыло новые перспективы в исследовании болезни Альцгеймера. Исследования образцов СМЖ в шести различных лабораториях мира показало, что у больных болезнью Альцгеймера уровень ТТР снижен. Комплексы Ар пептида с ТТР были обнаружены в почках. Добавление ТТР к культурам клеток, в которых образовывется амилоид, снижало количество регистрируемого амилоида. Более того, в нескольких моделях болезни Альцгеймера на животных, комплексы были обнаружены в мозге и было продемонстрировано, что с увеличением уровня ТТР происходит уменьшение амилоида, выявленного в мозгу. Эти результаты позволяют предположить, что вещества, способные увеличить количество ТТР у больных болезнью Альцгеймера, могут привести к снижению амилоида и, таким образом, могут послужить прототипом лекарств для лечения болезни Альцгеймера.

источник

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА: ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД

Е. И. Рогаев Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Центральной задачей при исследовании патогенеза сложного заболевания является идентификация первичных молекулярных нарушений.

Предполагается, что первые гистопатологические изменения (например, накопление амилоидных бляшек) при болезни Альцгеймера могут возникать задолго (за 10-20 лет) до появления первых клинических симптомов. Это, разумеется, затрудняет идентификацию первичных дефектов, ведущих к нейродегенерации. Прорывом в данной области явился генетический подход, в частности, стратегия позиционного клонирования генов.

Генетическая предрасположенность и возраст являются наиболее четко определенными факторами риска развития болезни Альцгеймера (БА).

Установлено, что болезнь Альцгеймера включает несколько генетически гетерогенных форм, объединенных общим спектром клинических и гистопатологических признаков. Обнаружено, что причиной или фактором риска развития определенных форм БА являются мутации и полиморфизм в некоторых генах человека. В докладе будут вкратце изложены последние достижения в новой области «геномики» болезни Альцгеймера, а также перспективы исследований для разработки диагностики и терапии БА на основе генетических знаний.

1. Роль генетических факторов при болезни Альцгеймера

Еще в 40-х годах была предсказано, что генетические факторы играют значительную роль в патогенезе болезни Альцгеймера как с ранним, так и с поздним началом болезни. Суммируя данные близнецового анализа, характера наследования БА в семьях и недавние результаты анализа генов, вовлеченных в болезнь Альцгеймера, можно сделать следующие выводы:

1) семейные формы с ранним началом БА (до 65, в среднем 35-55 лет) характеризуются аутосомно-доминантным наследованием. Необходимой и достаточной причиной патологии при этом является мутация в единственном гене. Число больных с такими генетическими формами БА, видимо, не превышает 10 % от всех случаев БА.

2) для семейных случаев с поздним началом БА (условно старше 65 лет) наиболее соответствующей характеру наследования является олигогенная (несколько генов) природа наследования с «главной» мутацией в одном или нескольких генах и модификационным эффектом в других генах.

3) «Спорадические» случаи также могут быть обусловлены мутациями или полиморфизмом в генах, патогенная экспрессия которых зависит от многих других генов и эпигенетических факторов.

Обнаружение и клонирование генов БА, в целом, подтверждают данную схему.

2. Гены, мутации в которых ведут к развитию болезни Альцгеймера

К настоящему времени выявлено 4 гена, мутации или вариации, которые бесспорно вызывают или являются факторами риска БА.

Мутации в гене пресенилин 1 ( PS 1, хромосома 14) вызывают наиболее распространенные ранние семейные формы БА и являются, видимо, наиболее «агрессивными» генетическими факторами. Их патологическое проявление характеризуется высокой пенетрантностью и не зависит от других факторов среды или генотипа. К настоящему времени обнаружено более 45 различных миссенс-мутаций, разбросанных по всей длине кодирующей части гена, и одна «сплайсинг» — мутация, ассоциированных с семейной БА. Две мутации гомологичного гена пресенилин 2 ( PS 2, хромосома 1) обнаружены в родословных поволжских немцев и итальянцев.

Анализ многих популяций различного этнического происхождения, в том числе русских (см. в данном сборнике), показал, что полиморфизм в гене аполипопротеина АРОЕ (аллель е4, хромосома 19) является наиболее широко распространенным фактором риска как ранних, так и поздних форм БА. Следует отметить, что в отличие от мутации в гене PS 1 наличие в генотипе индивида е4 варианта не является необходимым или достаточным условием развития БА.

Несколько мутаций в экзоне 16 и 17 у пациентов с ранней семейной БА были ранее описаны для гена предшественника амилоида (APP, хромосома 21).

Суммируя, можно сказать, что мутации в генах пресенилина 1 и 2 ответственны за 30-70 % (по подсчетам разных авторов), а мутации в гене APP менее 5 % случаев семейных форм БА с ранним началом. АРОЕ е4 является одним из факторов риска в 30-50 % всех случаев БА.

В настоящее время продолжается поиск генов, вовлеченных в развитие БА, как методами позиционного клонирования, так и прямым анализом генетической ассоциации полиморфизмов в генах-кандидатах. Для некоторых семейных форм обнаружено «предполагаемое сцепление» БА с геном (еще не идентифицированном) на хромосоме 12. За последние четыре года обнаружено не менее 12 генов, для тех или иных аллельных вариантов которых показаны ассоциации с БА (см., например, в этом сборнике Щербатых и др., Григоренко и др.). К сожалению, известные статистические недостатки метода генетической ассоциации часто не позволяют получать убедительные данные, подтверждаемые в независимых исследованиях.

3. Функции генов болезни Альцгеймера в норме и патологии. Биологическая модель

На первый взгляд, не существует очевидной функциональной или структурной связи между белковыми продуктами тех генов, мутации в которых ассоциированы с БА. Пресенилины — внутриклеточные белки со множественными трансмембранными доменами. APP — белок с одним трансмембранным доменом, локализованным на плазматической мембране. Их экспрессия происходит во всех тканях, в том числе и в нейронах. Аполипопротеин Е — белок со множественными функциями, экспрессируется в мозге, но в глиальных клетках, а не в нейронах.

Исследования клеточных моделей и трансгенных животных показывают, что мутантные формы данных генов изменяют:

1) процессинг APP и аккумуляцию наиболее нейротоксичных форм бета-амилоида;

2) вызывают повышение чувствительности клеток различного типа, в том числе нейронов, к апоптозу;

3) могут влиять на изменение внутриклеточного Са 2+ -гомеостаза и различные системы сигнальной трансдукции и окислительного стресса.

Аполипопротеин Е участвует также в процессах регенерации ЦНС при повреждениях и является фактором риска (е4 форма) при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Для выявления непосредственных молекулярных элементов, взаимодействующих с продуктами пресенилинов, APP или АРОЕ, необходимо дальнейшее развитие подходящих клеточных моделей или моделей трансгенных животных. Помимо традиционной модели трансгенной мыши (см. Григоренко и др. в данном сборнике) мы начали создание принципиально новых моделей беспозвоночных (дрозофила и моллюск) для исследования генов БА, и в частности, пресенилинов. В настоящее время клонированы ортологичные гены пресенилинов из Drosophila melanogaster (в сотрудничестве с Университетом г. Торонто) и из улитки Helix L . (неопубликованные данные). Данные модели, как предполагается, будут наиболее подходящими для идентификации элементов сигнальной трансдукции, взаимодействующих с пресенилинами.

С открытием генов пресенилинов остается открытым вопрос: является ли верной «центральная догма бета-амилоида», т. е. бета-амилоид как главная биохимическая причина БА. С одной стороны, показано, что мутации в генах PS 1 и PS 2 и АРОЕ е4 способствуют образованию наиболее «амилоидогенной» формы бета-амилоида. С другой стороны, больные с некоторыми мутациями в генах пресенилинах характеризуются накоплением лишь «диффузных» непатогенных форм амилоидных бляшек. Мутации (Р163Н и H 163 R ) в гене пресенилина 1 способствуют также отложению другого белка — приона (РгР). Наконец, установлено, что подкорковая деменция с множественными инсультами ( CADASIL ) вызывается мутациями в гене Notch 3. В систему Notch -сигнальной трансдукции вовлечен и продукт гена пресенилина. Таким образом, возможно, нарушение системы сигнальной трансдукции в позднем или даже раннем развитии центральной нервной системы может являться фактором ведущим к БА.

Перспективы генной диагностики и терапии

Для проведения генной диагностики БА необходимо: выяснение распространенности мутаций (например, в генах пресенилинов) не только в семейных, но и в спорадических случаях БА и других деменций в разных популяциях; поиск новых генов (например, на хромосоме 12), полиморфизмы в которых являются факторами риска БА или протектирующими факторами при БА.

Уже в настоящее время представляется перспективным тестирование на мутации гена пресенилина 1 у пациентов и родственников в семьях с ранним началом БА. Обнаружение мутации в эволюционно-консервативном сайте пресенилина 1 позволяет, по существу, однозначно предсказать развитие болезни до 60 лет (и наиболее вероятно в возрасте 35-55 лет).

Модели клеточных линий и животных, содержащих трансгенные мутантные формы генов БА, позволят тестировать различные лекарства и молекулы, влияющие на клеточные механизмы

2) апоптоза (програмированной клеточной смерти)

3) сигнальной трансдукции в данных системах.

Это дает надежды на создание лекарственных препаратов, имеющих не симптоматический эффект, а влияющих на первичные молекулярные нарушения при БА.

источник

студент 2 курса, лечебный факультет НГМУ,

ст. преподаватель кафедры медицинской химии НГМУ,

Болезнь Альцгеймера является актуальной проблемой современной цивилизации, так как её распространённость в мире возрастает, а достаточно эффективные методы лечения пока не найдены. По различным прогнозам, к 2030 г. число больных увеличится до 56-66 млн, к 2050 г. это число ещё удвоится [3, с. 2].

Болезнь Альцгеймера (БА) – прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, связанное с неправильным сворачиванием, накоплением в тканях мозга и проявлением токсических свойств β-амилоида (Аβ) и τ-белка. Обнаруживаемые в мозгу больных т. н. сенильные бляшки образованы Аβ – фрагментом трансмембранного белка-предшественника амилоида АРР, обнаруженного во многих тканях, включая синапсы, и необходимого в нервных клетках. В норме АРР расщепляется на растворимые полипептиды и выводится из организма, но при БА образуются нерастворимые фрагменты (доминирующие изоформы у человека – Аβ40 и Аβ42), накопление и агрегация которых ведут к гибели нейронов. Ферменты, катализирующие распад АРР, называют секретазами. В ходе неамилоидогенного превращения АРР подвергается действию α-секретазы – белка из семейства ADAM. Отщепление внеклеточного N-концевого домена происходит вблизи внешней поверхности мембраны между аминокислотными остатками внутри последовательности Аβ, что и предотвращает образование амилоида. Однако другой фермент, β-секретаза (или ВАСЕ), разрывает связь вблизи N-конца домена, соответствующего Аβ. Образовавшийся под действием обеих секретаз С-концевой фрагмент может подвергнуться вторичному протеолизу γ-секретазным комплексом и выйти из мембраны внутрь или вне клетки. В α-секретазном пути образуется р3, в β-секретазном – Аβ.

Вначале Аβ представляет собой мономеры. В ходе агрегации они превращаются в небольшие сферические олигомерные частицы, содержащие много β-структур. Методом PICUP (фотоиндуцированное связывание немодифицированных белков) выяснили, что растворимые олигомеры, образованные Аβ-пептидом, находятся в динамическом равновесии с мономерной формой и относительно неструктурированы [1, с. 17]. В составе олигомеров – 2–4 мономера для Аβ40 и 5–6 для Аβ42. Далее формируются протофибриллы и фибриллы, обладающие нейротоксичностью. Нарушаются гомеостаз Са 2+ , структура цитоскелета, синаптическая передача в холинергических терминалях; снижается содержание серотонина, норадреналина и других моноаминов. Индуцируются окислительный стресс, эксайтотоксичность, воспалительные процессы, апоптоз. Особенно чувствительны к токсическому воздействию холинергические нейроны базальных отделов переднего мозга. На конечных стадиях болезни из них дегенерирует 95%. Важную роль в дегенерации играет нарушение гомеостаза Са 2+ : оно вызывает эксайтотоксичные каскады и образование токсичных белков. Нарушение обусловлено снижением экспрессии Са 2+ -связывающего белка кальбиндина-D28K и, как следствие, уменьшением Са 2+ -буферной ёмкости нейронов [9, с. 2].

Также фибриллы Аβ провоцируют накопление нейрофибриллярных клубков (NFT) из нерастворимых филаментов гиперфосфорилированного τ-белка. В норме τ-белок стимулирует полимеризацию тубулина, таким образом стабилизируя микротрубочки через 4 тубулин-связывающих домена путём замедления движения ассоциированных с ними кинезиновых моторных белков. При гиперфосфорилировании τ-белок теряет эту способность и агрегирует с образованием парных спиральных филаментов и NFT, причём количество отложений патологических форм коррелирует с выраженностью когнитивных нарушений (наблюдалось методом нейровизуализации биомаркеров в ликворе) [8, с.11]. Для Аβ подобной корреляции не обнаружено.

Распространение Аβ и τ-белка происходит по прионному механизму: неправильно свёрнутые формы захватываются здоровыми нейронами, и их нормальные белки превращаются в патологические. Взаимодействие между Аβ и τ-белком также напоминает прионное: in vitro Аβ активирует протеинкиназу GSK3, фосфорилирующую τ-белок, и сам связывается с ним, вызывая олигомеризацию его мономеров. Далее олигомеры распространяются уже без участия Аβ, что объясняет прогрессирование симптомов заболевания.

Раннее начало заболевания обусловлено мутацией гена АРР (21-я хромосома), пресенилина-1 (14-я хромосома) или пресенилина-2 (1-я хромосома). Кроме того, группу риска составляют люди, гомо- и гетерозиготные по аллелю, кодирующему 4-ю изоформу АпоЕ. В развитии спорадической формы БА весьма значительную роль играет окислительный стресс (ОС), неизбежный в процессе старения организма в связи с интенсивной генерацией активных форм кислорода (АФК) и ослаблением антиоксидантной защиты. Генерация АФК в нервной ткани при БА связана с нарушениями системы тканевого дыхания, метаболизма арахидоновой кислоты, катехоламинов и ксантиноксидазы, с воспалительной реакцией в микроглии [2, с. 2]. Таким образом, ОС является одним из звеньев в патогенезе БА. Кроме того, он повышает чувствительность нейронов к цитотоксическому действию возбуждающих аминокислот (глутамата, аспартата), т. е. эксайтотоксичности. Это объясняется гипоксией, вызванной нарушением работы митохондрий.

В образовании АФК, предположительно, принимают участие металлы с переменной валентностью. У больных, умерших от БА, обнаружены скопления железа в гиппокампе, коре больших полушарий, базальных ядрах Мейнерта, сенильных бляшках и NFT. Из-за токсического действия Al 3+ , прошедшего через повреждённый ГЭБ, ускоряется Fe 2+ -зависимая пероксидация, которая и ведёт к продуцированию АФК [2, с. 2]. Также отмечается участие таких металлов, как Al, Zn, Cu и Fe в олигомеризации и конформационных изменениях Аβ путём образования поперечных сшивок.

В усугублении ОС при БА принимает участие и Аβ. В 35-м положении пептида находится метионин, под влиянием АФК переходящий в сульфуранил-радикал MetS• + , который повышает гидрофобность окружающих молекул, индуцирует процессы ПОЛ и окислительной модификации белков. Под действием кислорода радикал превращается в супероксид-анион и метионинсульфоксид (МСО). МСО может окисляться далее до метионинсульфона, а может разрушаться ферментом МСО-редуктазой, активность которой снижена при БА.

Некоторые учёные выдвигают гипотезу об изначальной защитной антиоксидантной роли Аβ, т. е. считают его накопление компенсаторной реакцией организма на ОС. Подтверждает теорию способность Аβ действовать как фермент СОД. Однако со временем после накопления Аβ проявляются его токсические свойства (нарушение активности факторов транскрипции, метаболизма Са, фосфорилирования/дефосфорилирования белков), появляются отложения τ-белка, происходит взаимодействие с металлами переменной валентности (особенно Cu и Fe). Аβ утрачивает первоначальные функции и приобретает уже прооксидантную активность.

Существует гипотеза, что в развитии БА существенная роль принадлежит нарушению оттока Аβ из мозга [2, с. 3]. Главная помпа очистки от Аβ – рецепторы белка, связанного с ЛПНП – LRP1. При ОС, возможно, повреждения LRP1 сопровождаются нарушением его транспортной способности.

Одна из важнейших регуляторных систем метаболизма клетки – система фосфорилирования/дефосфорилирования. За баланс работы киназ и фосфатаз ответственны пептидил-пролилизомеразы, например, Pin1, действие которой сопряжено с изомеризацией пептидной связи между pSer/Thr-Pro. Pin1 влияет на сборку и фолдинг белка, внутриклеточный транспорт и сигнализацию, транскрипцию, митоз и апоптоз [2, с. 5]. Существует связь между гиперфосфорилированием τ-белка при БА, активностью киназ/фосфатаз и клеточным циклом. Pin1 участвует в изомеризации и дефосфорилировании τ-белка, сохраняя его функцию и конформацию, и тем самым осуществляет регуляцию вхождения клетки в митотический цикл [2, с. 9]. Окисляясь, этот фермент теряет активность (наблюдается при БА в гиппокампе), что приводит также к гиперфосфорилированию АРР и в конечном итоге к образованию Аβ.

Состояние ОС при БА сопровождается апоптозом. За этот процесс отвечает р53, активность транскрипции которого определяется степенью его фосфорилирования. В регуляции транскрипции р53 участвуют различные киназы: JNK/SAPK, р38 МАРкиназа. При активировании р53 индуцируются гены Вах, вызывающего дисфункцию митохондрий, выход цитохрома с в цитоплазму, активацию каспаз 9 и 3. Митохондрии при этом подвергаются действию церамида, освободившегося из сфингомиелин-церамидного комплекса под влиянием ОС и Аβ.

Апоптоз при БА – защитная реакция организма, направленная на удаление повреждённых клеток. Дифференцированные нейроны неспособны к делению, поэтому при активации клеточного цикла он абортивен, т. е. заканчивается апоптозом. Скорее всего, вступление нейронов в цикл вызвано несвоевременной экспрессией регуляторов клеточного деления. ДНК способна реплицироваться, но митоз нарушен, и клетка гибнет. При этом отмечают повышение концентрации белков клеточного цикла (циклинов, циклин-зависимых протеинкиназ).

Исходя из рассмотренных биохимических процессов развития БА, а также процессов, стимулирующих её прогресс или препятствующих ему, выделяют множество направлений в её терапии.

1. Предотвращают накопление патологически изменённых белков ингибиторы β-, γ-секретаз, а также стимуляторы α-секретазы.
2. Выведение Аβ из мозга усиливают антитела и белки-шапероны (высокую эффективность показывает пассивная иммунизация моноклональными антителами [6, с. 4]), ферменты деградации Aβ (инсулиндеградирующий фермент, ангиотензинконвертирующий фермент и непрелизин), индукторы аутофагии, антиагреганты.
3. Применение ноотропных препаратов с антиамилоидным эффектом (церебролизин, кортексин, солкосерил, Актовегин).
4. Устранение нарушений нейротрансмиссии.

Наиболее распространены ингибиторы ацетилхолинэстеразы (АХЭ) – например, донепезил, галантамин, ривастигмин и такрин. В симптоматическом лечении используют антагонисты глутаматных NMDA-рецепторов.

БА сопровождается нейровоспалением и цереброваскулопатиями, что обусловливает применение ингибиторов активации тромбоцитов, тромбина.

1. Нейропротекция, стимуляция нейрогенеза.

Выяснено, что некоторые белки (нейролигины, нейрексины, тромбоспондин), а также избирательные ингибиторы гистоновых деацетилаз вызывают образование синапсов. Эритропоэтин и плазма, богатая факторами роста, стимулируют нейрогенез.

1. Антиапоптотический эффект имеют α-токоферол, N-ацетилцистеин, ингибиторы каспаз, цитохрома с, стресс-активированных SAPK (JNK, p38 MAPK).
2. Коррекция межклеточных взаимодействий.

Эндогенная матриксная металлопротеиназа-9 (MMP-9) действует подобно α-секретазе, поэтому её активация снижает уровень Aβ. Перспективными методами также считают блокирование сигнальных путей и рецепторов, активирующих нейротоксичность олигомеров Aβ, и модуляцию экспрессии рецептора фактора роста нервов p75NTR.

1. Применение мезенхимальных стволовых клеток, трансплантируемых из плаценты, снижает экспрессию АРР, BACE1 и Аβ и активность β- и γ-секретаз, оказывает нейропротекцию путём регулирования нейрогенеза, гибели нейронов, активации глии в гиппокампе и изменения экспрессии цитокинов. Метод пока находится на стадии разработки.

Список литературы:

1. Довидченко Н. В., Леонова Е. И., Галзитская О. В. Механизмы образования амилоидных фибрилл // Успехи биологической химии. – 2014. – Т. 54. – С. 203-230.
2. Дубинина Е. Е. Окислительный стресс и его влияние на функциональную активность клеток при болезни Альцгеймера // Биомедицинская химия. – 2015. – Т. 61, № 1. – С. 57-69.
3. Комлева Ю. К. Современные представления о патогенезе болезни Альцгеймера: новые подходы к фармакотерапии (обзор) // Современные технологии в медицине. – 2015. – Т. 7, № 3. – С. 138-148.
4. Лобзин В. Ю. Значение определения белков-маркеров амилоидоза и нейродегенерации в цереброспинальной жидкости в диагностике когнитивных расстройств сосудистого и нейродегенеративного генеза // Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. – 2013. – № 4. – С. 21-27.
5. Лысогорская Е. В., Клюшников С. А. Точки приложения препаратов биологической природы в терапии нейродегенеративных заболеваний // Нервные болезни. – 2015. – №2. – С. 10-13.
6. Науменко А. А. Диагностика и лечение болезни Альцгеймера // Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. – 2016. – Т. 8, № 4. – С. 91-97.
7. Радько С. П. Физико-химические методы исследования агрегации β-амилоида // Биомедицинская химия. – 2015. – Т. 61, № 2. – С. 203-218.
8. Татарникова О. Г., Орлов М. А., Бобкова Н. В. Бета-амилоид и Тау-белок: структура, взаимодействие и прионоподобные свойства // Успехи биологической химии. – 2015. – Т. 55. – С. 351–390.
9. Baker-Nigh A. Neuronal amyloid-β accumulation within cholinergic basal forebrain in ageing and Alzheimer’s disease // Brain. – 2015. – Vol. 138., № 6. – P. 1722-1737.

источник